W tym filmie pokażemy, w jaki sposób można analizować kompleksy łańcucha oddechowego mitochondriów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu testów aktywności w żelu.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Mitochondria to organelle cytoplazmatyczne, które odgrywają główną rolę w metabolizmie i homeostazie komórkowej, regulacji sieci sygnałowej komórki oraz programowanej śmierci komórki. Mitochondria produkują ATP, regulują redoks stanu cytoplazmy i bilans Ca2+, katabolizują kwasy tłuszczowe, syntetyzują hem, nukleotydy, hormony steroidowe, aminokwasy oraz pomagają w montażu klastrów żelazowo-siarkowych w białkach. Mitochondria pełnią również istotną rolę w termogenezie. Mutacje genomu mitochondrialnego powodują wiele rodzajów schorzeń u ludzi. Akumulacja mutacji mtDNA koreluje ze starzeniem się organizmu i prawdopodobnie odgrywa istotną rolę w rozwoju nowotworów. Ze względu na ich kluczową funkcję we wszystkich typach komórek, działanie mitochondriów musi być również krytyczne dla komórek macierzystych. Dokonano znaczących postępów w rozumieniu żywotności, proliferacji i zdolności różnicowania się komórek macierzystych. Jednak funkcjonalna aktywność komórek macierzystych, w szczególności ich stan energetyczny, nie została jeszcze szczegółowo zbadana. Prawie nic nie wiadomo o właściwościach mitochondrialnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) oraz ich zróżnicowanych potomkach prekursorach. Jednym ze sposobów zrozumienia i oceny roli mitochondriów w funkcjonowaniu i potencjale rozwojowym hESC jest bezpośredni pomiar aktywności kompleksów oddechowych mitochondriów. W niniejszej pracy opisujemy wysokorozdzielczą elektroforezę w żelu natywnym (clear native gel electrophoresis) oraz następującą po niej wizualizację aktywności in situ w żelu jako metodę analizy pięciu kompleksów łańcucha oddechowego w hESC.
Protokół
Wysokorozdzielcza elektroforeza w żelu natywnym (hrCNE) do analizy aktywności kompleksów mitochondrialnych w żelu
Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) hodowano na monowarstwie naświetlonych ˠ lub potraktowanych mitomycyną C embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs), a następnie przeniesiono na Matrigel na 5 dni w pożywce warunkowanej przez MEF w standardowych warunkach. Aby usunąć zanieczyszczające MEF, hESCs ponownie wysiano na Matrigel i hodowano w pożywce warunkowanej przez MEF przez kolejne 3 dni. W celu potwierdzenia braku różnicowania hESCs zastosowano mikroskopię immunofluorescencyjną dla markerów pluripotencji Oct-4 oraz SSEA-4.
- Przemyć komórki ciepłym 1x PBS, pH 7.4, a następnie przeprowadzić trypsynizację (1ml 1x trypsyny na dołek w płytce 6-dołkowej) przez 5 min.
- Dodać równą objętość świeżego inhibitora trypsyny (1mg/ml w 1x PBS, pH 7.4). Zebrać komórki i odwirować przy 200g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
- Odlać nadsącz i resuspender osad komórkowy w 0,8 – 1,7ml (w zależności od wielkości osadu) lodowatego buforu do izolacji mitochondriów (83mM sacharozy; 6,6mM imidazolu/HCl, pH 7.0) z dodatkiem świeżo przygotowanego 1´ koktajlu inhibitorów proteaz. Inkubować na lodzie przez 10 min.
- Uhomogenizować komórki za pomocą homogenizatora Dounce'a (~40 – 50 pociągnięć). Alikwot uhomogenizowanych komórek zabarwić błękitem trypanu, aby sprawdzić kompletność homogenizacji pod mikroskopem świetlnym.
- Odwirować przy 20 000g przez 10 min w 4°C, aby uzyskać surowy osad mitochondrialny, który zawiera również jądra i większe fragmenty komórek. Odlać i usunąć nadsącz, a następnie zważyć wytrącony surowy osad mitochondrialny. Osad można przechowywać w -80 °C po natychmiastowym zamrożeniu w ciekłym azocie, jeśli jest to etap kończący pracę.
UWAGA: Do izolacji i zbierania czystej frakcji błon mitochondrialnych można zastosować wirowanie różnicowe lub inne procedury oparte na gradientach. Szczegóły znajdują się w ref. 4. To alternatywne podejście pozwoli na oznaczenie aktywności kompleksów mitochondrialnych na mg białka mitochondrialnego zamiast na mg masy komórkowej lub liczbę komórek. W celu dokonania takiego porównania konieczne będzie oznaczenie stężenia białek mitochondrialnych po oczyszczeniu. W tym podejściu może być również wymagany inny bufor izolacyjny. W kwestii solubilizacji czystej frakcji błony mitochondrialnej należy zapoznać się z uwagą po kroku 6 poniżej. - Zsolubilizować surowy osad mitochondrialny na lodzie, mieszając w wirówce (vortex) z lodowatym buforem do solubilizacji (50mM NaCl, 50mM imidazolu/HCl pH 7.0, 1mM EDTA, 2mM kwasu 6-aminoheksanowego). Kwas 6-aminoheksanowy można zastąpić 1x koktajlem inhibitorów proteaz. Zużyć 35µl buforu do solubilizacji na 20mg masy osadu. Dodać 20µl 10% w/v digitoniny na 20mg masy osadu i wymieszać, delikatnie potrząsając probówką. Inkubować przez 5-10 min na lodzie. W celu solubilizacji białek digitoninę można zastąpić dodecyl-β-D-maltosydem lub Tritonem X-100. Wybór detergentu oraz jego ilość mogą wpływać na tworzenie się superkompleksów lub form multimerycznych kompleksów mitochondrialnych. Więcej informacji znajduje się w ref.1.
UWAGA: Ilość detergentu wymagana do solubilizacji czystej frakcji błony mitochondrialnej odpowiada stosunkowi masy detergentu do białka w zakresie 2-6g/g. Optymalny stosunek do solubilizacji błon mitochondrialnych to 2,5g/g dla dodecyl-β-D-maltosydem, 3g/g dla Tritonu X-100 i 6g/g dla digitoniny. - Odwirować zsolubilizowany osad przy 100 000g przez 15 min w 4°C. Zebrać klarowny nadsącz.
- Dodać bufor do nakładania do stężenia końcowego 5% w/v glicerolu i 0,01% w/v Ponceau S (użyć roztworu stokowego buforu do nakładania: 50% w/v glicerolu, 0,1% w/v Ponceau S).
- Nanieść na dołki żelu objętość zawierającą 20-40mg surowego osadu mitochondrialnego na ścieżkę. Użyć żelu z gradientem akryloamidu (4-13%) z żelem koncentrującym (stacking gel) 3,5%.
UWAGA: Przygotowanie żelu i warunki elektroforezy:
Do przygotowania żelu należy użyć mieszaniny akryloamidu/bis-akryloamidu (AA/bisAA) 3 w następujący sposób: 48g akryloamidu i 1,5g bisakryloamidu (49,5% T, 3% C, gdzie T to całkowite stężenie AA i bisAA, a C to procentowy udział sieciującego (bisAA) w całkowitej ilości monomeru).
Bufor do żelu (3´): 1,5M kwasu 6-aminoheksanowego; 75mM imidazolu, pH 7.0
| Żel gradientowy: | 4% | 13% | Żel nakładający: | 3,5% |
| Mieszanina AA/bisAA 3 | 2 ml | 6,5 ml | 0,6 ml | |
| Bufor żelowy 3´ | 8,3 ml | 8,3 ml | 2,7 ml | |
| Glicerol | 5 g | |||
| H2O | 14,7 ml | 5 ml | 4,7 ml | |
| Objętość całkowita | 25 ml | 25 ml | 8 ml | |
| 10% APS | 139 µl | 125 µl | 67 µl | |
| TEMED | 14 µl | 12,5 µl | 6,7 µl |
Bufor anodowy: 25mM imidazol/HCl, pH 7.0
Bufor katodowy: 50mM tricyna, 7.5mM imidazol/HCl, 0.02% w/v dodecyl-β-D-maltozyd, 0.05% w/v deoksicholan, pH 7.0
Żele należy wlewać i prowadzić w pomieszczeniu chłodniczym (4-7 °C). Napięcie początkowe wynosi 100V. Po wejściu próbki w żel koncentrujący napięcie zwiększa się do 500V przy ograniczeniu natężenia prądu do 15mA (dla żeli o wymiarach 0.15 × 14 × 14 cm). Elektroforezę przerywa się po 3-4 h, gdy wyraźna linia czerwonego barwnika Ponceau S zbliża się do czoła żelu. Alternatywnie żel można prowadzić przez noc przy stałym napięciu 70-100V.
- Testy aktywności w żelu. Czas inkubacji dla każdego testu zależy od wydajności solubilizacji białek oraz ilości materiału naniesionego do każdego dołka. Kompleksy I, IV i V zazwyczaj dają silniejsze sygnały niż kompleksy II i III.
Kompleks I (CI)
Inkubować plasterek żelu w buforze CI (5mM Tris-HCl, pH 7.4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CI: Na każde 100ml 5mM Tris-HCl, pH 7.4 dodać:
0,01 g NADH
0,25g NBT
Utrwal żel w 50% metanolu i 10% kwasie octowym przez 15-45 min. Utrwalony żel przechowuje się w 10% kwasie octowym.
Kompleks II (CII)
Inkubować wycinek żelu w buforze CII (20mM bursztynianu sodu; 0,2mM fenazyny metasiarczanu; 2,5mg/ml NBT; 5mM Tris-HCl pH 7,4) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CII: Dodać na 100ml 5mM Tris-HCl, pH 7.4:
200µl 1M bursztynianu sodu
80µl fenazyny metasiarczanu (250mM PMS rozpuszczony w DMSO)
0,25g NBT
Utrwal żel zgodnie z opisem dla Kompleksu I
Kompleks III (CIII)
Inkubować plasterek żelu w buforze CIII (50mM fosforanu sodu, pH 7.2; 0,05% tetrahydrochlorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CIII: do 100ml 50mM fosforanu sodu, pH 7,2 dodać:
50mg tetrahydrochlorku diaminobenzydyny
Utrwal żel zgodnie z opisem dla Kompleksu I
Kompleks IV (CIV)
Inkubować plasterek żelu w buforze CIV (50mM fosforanu sodu, pH 7.2; 0,05% tetrahydrochlorku 3,3'-diaminobenzydyny (DAB), 50µM cytochromu c z serca konia) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CIV: do 100ml 50mM fosforanu sodu, pH 7,2 dodać:
50mg tetrahydrochlorku diaminobenzydyny
0,1 g cytochromu c z serca konia
Utrwal żel zgodnie z opisem dla Kompleksu I
Kompleks V (CV)
Inkubować plasterek żelu w buforze CV (35mM Tris-base, 270mM glicyny, pH 8.3 w 25°C, 14mM MgSO4, 0.2% w/v Pb(NO3)2, 8mM ATP) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CV: Na 100ml roztworu dodać:
| Tris-base | 0.424g |
| Glicyna | 2.026g |
| MgSO4 | 0.345g |
| Pb(NO3)2 | 0.29g |
Nie ma potrzeby korygowania pH (powinno wynosić 8.3) – nie należy używać kwasu ani zasady. Przefiltrować i dodać
| ATP | 0.441g |
Utrwal żel w 50% metanolu przez 30 min, a następnie przenieś do wody.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym filmie opisaliśmy ekstrakcję kompleksów białek mitochondrialnych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych, ich rozdział za pomocą wysokorozdzielczej elektroforezy w żelu natywnym (hrCNE) oraz następującą po tym analizę za pomocą testów aktywności katalitycznej w żelu. hrCNE rozdziela kompleksy białek błon mitochondrialnych z rozdzielczością porównywalną do elektroforezy w żelu Blue Native i jest metodą lepszą w przypadku testów aktywności w żelu. Technikę tę można zastosować nie tylko do ilościowego oznaczeni...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Badania nad ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi w laboratorium Teitella są obecnie wspierane przez grant zalążkowy California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) RS1-00313. Dziękujemy dr Carli Koehler (UCLA) oraz członkom laboratorium Koehler za udzielenie porad i wskazówek w ramach tych i dodatkowych badań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| 0,5M EDTA | Fisher Scientific | BP120-1 | dostosować pH do 8,0 za pomocą NaOH |
| 1M NaCl | Sigma-Aldrich | S3014-500MG | |
| 1M bursztynian sodu | Fisher Scientific | S413-500 | |
| Bufor fosforanowy 0,1M pH 7,2 | Fisher Scientific | BP332-1 i BP329-1 | Wymieszać 68,4 ml 1M Na2HPO4 i 31,6 ml 1M NaH2PO4, aby przygotować bufor fosforanowy 0,1M o pH 7,2 w temperaturze 25 °C |
| 1M trycyna, pH 7,0 (dostosowane NaOH) | EMD Millipore | 9010 | przechowywać w temperaturze 4 °C |
| 1M imidazol/HCl, pH 7,0 | Sigma-Aldrich | I-2399 | przechowywać w temperaturze 4 °C |
| 1M Tris-HCl, pH 7,4 | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| 20% (m/v) dodecyl-b-D-maltozyd (DDM) | Fluka | 44205-500MG | Rozpuścić w wodzie. Przechowywać alikwoty 1 ml w temperaturze –20 °C. |
| 10% (m/v) digitonina (>50% czystości, stosowana bez rekrystalizacji) | Fluka | 37008-1G | Rozpuścić w wodzie. Przechowywać alikwoty 0,1–1 ml w temperaturze –20 °C. Przed użyciem należy podgrzać do 95 °C. |
| 2M kwas 6-aminoheksanowy | Fluka | 07260-100G | przechowywać w temperaturze 4 °C |
| 10x roztwór zapasowy Ponceau S/glicerol | Sigma-Aldrich | P-3504 i G6279-1L | 0,1% Ponceau S, 50% glicerolu (m/v) w wodzie. |
| 10% m/v deoksycholan sodu | Fluka | 30970-25G | Rozpuścić w wodzie. Chronić przed światłem. Dostosować pH do 7,0 za pomocą HCl, przefiltrować i przechowywać w temperaturze pokojowej. |
| 250 mM fenazyno metosiarczan (PMS) | TCI America | P0083 | Rozpuścić w DMSO i podzielić na alikwoty. Przechowywać w temperaturze –20 °C. |
| Nitro-błękit tetrazoliowy (NBT) | Amresco | 0329-1G | |
| 3,3’-diaminobenzydyna tetrahydrochlorowodorek (DAB) | TCI America | D0078 | |
| Pb(NO3)2 | Fisher Scientific | L62-100 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Tris (zasada) | Fisher Scientific | BP152-10 | |
| Glicyna | Fisher Scientific | G45-212 | |
| Sól sodowa adenozyno-5’-trifosforanu (ATP) | Sigma-Aldrich | A2383-5G | Klasa I, minimum 99% |
| zredukowana forma beta-nikotynamid adenin dinukleotydu (NADH) | Sigma-Aldrich | N-8129 | |
| Cytochrom c z serca konia | Sigma-Aldrich | C2506-250MG | |
| Sacharoza | Fisher Scientific | BP220-212 | |
| 100x koktajl inhibitorów proteaz | Sigma-Aldrich | P8340 | Przechowywać w temperaturze –20 °C. |
| Dimetylosulfotlenek (DMSO) | Fisher Scientific | D128-500 | |
| Barwnik błękit trypanu 0,4% | GIBCO, by Life Technologies | 15250-061 | |
| 10x trypsyna (0,5%) | GIBCO, by Life Technologies | 15400-054 | |
| Inhibitor trypsyny | GIBCO, by Life Technologies | 17075-029 |
Bibliografia
- Wittig, I., Braun, H. -P., Sch˫gger, H. Blue native PAGE. Nature Protocols. 1, 418-428 (2006).
- Wittig, I., Karas, M., Sch˫gger, H. High Resolution Clear Native Electrophoresis for In-gel Functional Assays and Fluorescence Studies of Membrane Protein Complexes. 6. Molecular & Cellular Proteomics. 6, 1215-1225 (2007).
- Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Sch˫gger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28, 3811-3820 (2007).
- Castle, J. D. Purification of Organelles from Mammalian Cells. Current Protocols in Protein Science. Coligan, J. E., Dunn, B. M., Speicher, D. W., Wingfield, P. T. 4.2, John Wiley & Sons, Inc. New York. 4.2.1-4.2.57 (2007).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
