$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wysoka rozdzielczość Clear Native Gel Electophoresis (hrCNE) do testów aktywności w żelu kompleksu mitochondrialnego
Ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) były utrzymywane na monowarstwie mysich fibroblastów embrionalnych (MEF) napromieniowanych ɣ lub mitomycyną C, a następnie przełączone na wzrost na Matrigel przez 5 dni w pożywce kondycjonowanej przez MIF w standardowych warunkach. Aby usunąć zanieczyszczające MEF-y, hESC ponownie posiano na Matrigel i hodowano w pożywce kondycjonowanej przez MEF przez dodatkowe 3 dni. Mikroskopia immunofluorescencyjna dla markerów pluripotencji Oct-4 i SSEA-4 została wykorzystana do potwierdzenia braku różnicowania hESC.
- Umyj komórki ciepłym 1x PBS, pH 7,4, a następnie trypsynizuj (1 ml 1x trypsyny na dołek w 6-dołkowej płytce) przez 5 minut.
- Dodaj równą objętość świeżego inhibitora trypsyny (1 mg / ml w 1x PBS, pH 7,4). Zebrać komórki i odwirować w temperaturze pokojowej 200 g, 5 min.
- Wyrzuć supernatant i ponownie zawieś granulowane komórki w 0,8 - 1,7 ml (w zależności od wielkości osadu komórkowego) lodowatego buforu do izolacji mitochondriów (83 mM sacharozy; 6,6 mM imidazolu / HCl, pH 7,0) ze świeżo przygotowanym koktajlem inhibitora proteazy 1'. Inkubować na lodzie przez 10 minut.
- Odbić komórki homogenizatorem (~40 - 50 uderzeń). Wybarwić podwielokrotność odbitych komórek błękitem trypanowym w celu sprawdzenia kompletności homogenizacji za pomocą mikroskopu świetlnego.
- Wirować przy 20 000 g przez 10 minut w temperaturze 4°C, aby uzyskać surowy osad mitochondrialny, który zawiera również jądra i większe fragmenty komórek. Zdekantować i odrzucić supernatant i zważyć wytrącony surowy osad mitochondrialny. Osad może być przechowywany w temperaturze -80 °C po natychmiastowym zamrożeniu w ciekłym azocie, jeśli jest to punkt zatrzymania.
UWAGA: Wirowanie różnicowe lub inne procedury oparte na gradientach mogą być stosowane do izolowania i zbierania czystej frakcji błony mitochondrialnej. Szczegółowe informacje można znaleźć w odnośniku 4. To alternatywne podejście pozwoli uzyskać aktywność kompleksu mitochondrialnego na mg białka mitochondrialnego zamiast złożonej aktywności na mg masy komórki lub liczby komórek. Aby dokonać tego porównania, należy określić stężenie białek mitochondrialnych po oczyszczeniu. Ponadto w przypadku tego podejścia może być wymagany inny bufor izolacji. W celu uzyskania informacji na temat rozpuszczania czystej frakcji błony mitochondrialnej, patrz uwaga po kroku 6 poniżej.
- Rozpuszczaj surowe osady mitochondrialne na lodzie przez wirowanie z lodowatym buforem do rozpuszczania (50 mM NaCl, 50 mM imidazol / HCl pH 7,0, 1 mM EDTA, 2 mM kwas 6-aminoheksanowy). Kwas 6-aminoheksanowy można zastąpić koktajlem 1x inhibitor proteazy. Użyć 35 μl buforu do rozpuszczania na 20 mg masy granulki. Dodaj 20 μl 10% w/v digitoniny na 20 mg masy granulki i wymieszaj, przesuwając rurkę. Inkubować przez 5-10 minut na lodzie. Dodecyl-b-D-maltozyd lub tryton X-100 można zastąpić digitoniną w celu rozpuszczenia białek. Dobór detergentu i jego ilość może mieć wpływ na powstawanie superkompleksów lub multimerycznych form kompleksów mitochondrialnych. Aby uzyskać więcej informacji, patrz ref.1.
UWAGA: Ilość detergentu potrzebna do rozpuszczenia czystej frakcji błony mitochondrialnej odpowiada stosunkowi wagowemu detergentu do białka w zakresie od 2-6 g / g. Optymalna proporcja do rozpuszczania błon mitochondrialnych wynosi 2,5 g/g dla dodecyl-b-D-maltozydu, 3 g/g dla trytona X-100 i 6 g/g dla digitoniny.
- Rozpuszczony osad należy odwirować w stężeniu 100 000 g przez 15 minut w temperaturze 4°C. Zebrać klarowny supernatant.
- Dodać bufor ładujący do końcowego 5% w/v glicerolu i 0,01% w/v Ponceau S (użyć 50% w/v glicerolu, 0.1% w/v Ponceau S roztworu buforowego ładowania).
- Załaduj studzienki żelowe objętością zawierającą 20-40 mg surowego osadu mitochondrialnego na pas. Użyj gradientowego żelu akrylowego (4 -13%) z 3,5% żelem do układania.
UWAGA: Warunki przygotowania żelu i elektroforezy:
Do przygotowania żelu użyj mieszanki akrylamidu/bis-akrylamidu (AA/bisAA) 3 w następujący sposób: 48 g akrylamidu i 1,5 g bisakrylamidu (49,5% T, 3% C. Gdzie T jest całkowitym stężeniem AA i bisAA, a C jest procentem środka sieciującego (bisAA) w stosunku do całkowitego monomeru).
Bufor żelowy (3'): 1,5 M kwas 6-aminoheksanowy; 75mM imidazol, pH 7,0
.
| Żel gradientowy: | 4 proc | 13% | Żel do układania: | 3,5 % |
| Mieszanka AA/bisAA 3 | Pojemność 2 ml | Pojemność 6,5 ml | | Pojemność 0,6 ml |
| Bufor żelowy 3' | Pojemność 8,3 ml | Pojemność 8,3 ml | | Pojemność 2,7 ml |
| glicerol | | 5 gramów | | |
| H2O | Pojemność 14,7 ml | Pojemność 5 ml | | Pojemność 4,7 ml |
| Całkowita objętość | Pojemność 25 ml | Pojemność 25 ml | | Pojemność 8 ml |
| 10% SOA | 139 μl | 125 μl | | 67 μl |
| TEMED | 14 μl | 12,5 μl | | 6,7 μl |
Bufor anodowy: 25mM imidazol/HCl, pH 7.0
Bufor katodowy: 50mM Tricine, 7.5mM imidazol/HCl, 0.02% w/v dodecyl-b-D-maltozyd, 0.05% w/v deoksycholan, pH 7.0
Wlej i uruchom żele w chłodni (4-7 °C). Napięcie początkowe wynosi 100V. Gdy próbka dostanie się do żelu do układania, napięcie jest podnoszone do 500 V przy prądzie ograniczonym do 15 mA (dla żeli 0,15 ' 14' 14 cm). Elektroforeza zostaje przerwana po 3-4 godzinach, gdy ostra linia czerwonego barwnika Ponceau S zbliża się do czoła żelu. Alternatywnie żel może być uruchamiany przez noc ze stałym napięciem na poziomie 70-100V.
- Testy aktywności w żelu. Czas inkubacji dla każdego testu zależy od skuteczności solubilizacji białek i ilości materiału załadowanego na studzienkę. Kompleksy I, IV i V zwykle dają silniejsze sygnały niż kompleksy II i III.
Complex I (CI)
Inkubuj plasterek żelu z buforem CI (5mM Tris-HCl, pH 7.4; 0.1mg/ml NADH; 2.5mg/ml NBT) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
CI buffer: Dodać na 100ml 5mM Tris-HCl, pH 7,4:
0.01g NADH
0.25g NBT
Utrwal żel w 50% metanolu i 10% kwasie octowym przez 15-45 min. Utrwalony żel jest zakonserwowany w 10% kwasie octowym.
Kompleks II (CII)
Inkubuj plasterek żelu z buforem CII (20mM sodu succinate; 0.2mM metasiarczan fenazyny; 2.5mg/ml NBT; 5mM Tris-HCl pH 7.4) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CII: Dodać na 100ml 5mM Tris-HCl, pH 7.4:
200μl 1M bursztynian sodu
80μl metasiarczanu fenazyny (250mM PMS rozpuszczony w DMSO)
0.25g NBT
Napraw żel zgodnie z opisem dla Kompleksu I
.
Kompleks III (CIII)
Inkubuj plasterek żelu z buforem CIII (50mM fosforan sodu, pH 7,2; 0,05% tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB)) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CIII: Dodać na 100ml 50mM fosforanu sodu, pH 7,2:
50mg tetrachlorowodorku diaminobenzydyny
Napraw żel zgodnie z opisem dla Kompleksu I
.
Complex IV (CIV)
Inkubuj plasterek żelu z buforem CIV (50mM fosforan sodu, pH 7,2; 0,05% tetrachlorowodorek 3,3'-diaminobenzydyny (DAB), 50μM cytochrom c końskiego serca) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
Bufor CIV: Dodać na 100ml 50mM fosforanu sodu, pH 7,2:
50mg tetrachlorowodorku diaminobenzydyny
0.1g cytochrom C z końskim sercem
Napraw żel zgodnie z opisem dla Kompleksu I
.
Complex V (CV)
Inkubuj plasterek żelu z buforem CV (35mM Tris-base, 270mM glicyna, pH 8.3 w 25°C, 14mM MgSO4, 0.2% w/v Pb(NO3)2, 8mM ATP) w temperaturze pokojowej przez kilka godzin.
bufor CV: Na 100ml roztworu dodać:
Podstawa Tris
0,424 gr
glicyna
2,026 gr
MgSO4
0,345 gr
Pb(NO3)2
0,29 gr
Nie ma potrzeby dostosowywać pH (powinno być 8,3) - nie używaj kwasu ani zasady. Filtrowanie i dodawanie
Atp
0,441 gr
Utrwal żel w 50% metanolu na 30 minut i przenieś do wody.