Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Podsumowanie

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Streszczenie

Pluripotencję można indukować w zróżnicowanych komórkach mysich poprzez transdukcję wirusową Oct4, Sox2, Klf4 oraz c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006; Wernig, et al., 2007; Okita, et al., 2007; Maherali, et al., 2007). Opracowaliśmy strategię reprogramowania, w której te cztery czynniki transkrypcyjne są eksprymowane z wektorów lentiwirusowych indukowanych doksycykliną (dox) (Brambrink et al., 2008). Wykorzystując te indukowalne konstrukty, możemy otrzymywać indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) z embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs). W tym filmie przedstawiamy procedurę generowania indukowalnych lentiwirusów eksprymujących cztery czynniki transkrypcyjne oraz pokazujemy, jak zainfekować MEFs tymi wirusami w celu wytworzenia komórek iPS. Dzięki zastosowaniu indukowalnych lentiwirusów ekspresja czterech czynników jest kontrolowana poprzez dodanie doksycykliny do pożywki hodowlanej. Przewagą tego systemu nad tradycyjną infekcją retrowirusową jest możliwość włączania i wyłączania genów, co pozwala na szczegółową analizę kinetyki reprogramowania oraz wymagań dotyczących ekspresji genów.

Protokół

Krok 1:

Rozmrozić komórki 293 i wysiać je w celu produkcji lentiwirusa.

1. Przygotuj 9 ml pożywki DMEM+ w probówce 15-ml.
2. Wyjmij fiolkę z zamrożonymi zapasami komórek 293 z pojemnika z ciekłym azotem i umieść ją w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C, aż większość (ale nie wszystkie) komórek zostanie rozmrożona.
3. Przenieś komórki z fiolki do zamrażania do probówki 15-ml z kroku 1.
4. Wiąrź przez 5 min przy 180g, a następnie odlej nadsącz.
5. Resuspenduj komórki w 10 ml pożywki DMEM+ i przenieś je na powlekaną żelatyną płytkę 100-mm. Inkubuj komórki w inkubatorze w temperaturze 37°C i 5% CO₂ aż osiągną 80–90% konfluencji.
6. Pasażowanie komórek 293: przemyj komórki buforem PBS, odciągnij PBS, dodaj 4 ml 0,05% trypsyny/0,53 mM EDTA na płytkę 10-cm i inkubuj przez 1 min w 37°C.
7. Odspój komórki z płytek poprzez delikatne opukiwanie, resuspenduj w 10 ml pożywki DMEM+ i przenieś do probówki 15-ml. Wiąrź przez 5 min przy 180g, a następnie odciągnij nadsącz.
8. Dodaj odpowiednią objętość pożywki DMEM+ i rozbij skupiska komórek do postaci pojedynczej zawiesiny poprzez kilkukrotne pipetowanie w górę i w dół.
9. Policz komórki i dostosuj ich stężenie do poziomu 8x10⁵ komórek na ml za pomocą pożywki FP.
10. Zasieją komórki w ilości 8x10⁶ komórek (10 ml) na płytkę hodowlaną 100-mm i inkubuj przez noc w 37°C, 5% CO₂.

Krok 2:

Transfekcja komórek 293 plazmidami lentiwirusowymi i zbiór wirusa

1. Dla każdej płytki 10-cm użyj 10 µg wektora lentiwirusowego FUW-tetO-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 lub c-Myc) wraz z 2,5 µg pMD-G i 7,5 µg pPax2.
2. Podczas odmierzania trzech plazmidów do probówki, dodaj 30 µl odczynnika do transfekcji Fugene 6 do drugiej probówki zawierającej 500 µl DMEM bez surowicy, wymieszaj delikatnie, opukując probówkę palcem, i inkubuj przez 5 min w temperaturze pokojowej.
3. Dodawaj mieszaninę DNA kroplami do probówki z Fugene 6/DMEM, wymieszaj delikatnie, opukując probówkę palcem, i inkubuj przez 20 min.
4. Dodaj kompleks DNA/Fugene 6 kroplami do naczynia z komórkami 293 i inkubuj przez noc w 37°C, 5% CO₂.
5. Następnego ranka: odessaj medium zawierające odczynnik do transfekcji, dodaj 5 ml świeżego medium do komórek ES i wprowadź komórki z powrotem do inkubatora.
6. W 48. i 72. godzinie po transfekcji pobierz medium z komórek 293 za pomocą sterylnej jednorazowej strzykawki 10-ml, przefiltruj je przez filtr z octanu celulozy o rozmiarze porów 0,45 µm i przelej do probówki 15-ml.
7. Skoncentruj nadsącz wirusowy za pomocą ultrawirowania. Resuspenduj pellet wirusowy w pożąganej objętości i przygotuj mieszaninę składającą się z równych części medium zawierającego lentiwirusy Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- oraz c-Myc-.
8. Podczas przygotowywania wirusa, doprowadź MEF Oct4-neo/rtTA lub Oct4-GFP/rtTA (pasaż <3) do 90% konfluencji w płytkach 10-cm (2x10⁶ komórek na płytkę).
9. Odessaj medium hodowlane i przemyj komórki 10 ml PBS.
10. Wylej PBS, dodaj 1 ml na płytkę 0,05% trypsyny/0,53 mM EDTA i inkubuj w 37°C przez 10 min.
11. Dodaj 9 ml medium hodowlanego, zresuspenduj komórki do postaci pojedynczych komórek i przenieś do probówki 15-ml.
12. Policz liczbę komórek i dostosuj stężenie do 8x10⁴ komórek na ml. Przenieś 10 ml zawiesiny komórkowej (8x10⁵ komórek) na płytkę 10-cm pokrytą żelatyną. Inkubuj płytkę przez noc w 37°C, 5% CO₂.
13. Odessaj medium z płytki z fibroblastami i dodaj 10 ml medium zawierającego wirusa. Inkubuj komórki od 4 h do całej nocy w 37°C, 5% CO₂.
14. Po 24 h odessaj medium z płytki z fibroblastami i dodaj 10 ml świeżego medium do komórek ES.
15. Zastąp zwykłe medium do komórek ES medium zawierającym doksycylinę, aby zainicjować ekspresję czterech genów; innymi słowy, rozpocznij reprogramowanie.
16. W przypadku użycia reportera Oct4-neo, rozpocznij selekcję lekową w dowolnym czasie między 6. a 9. dniem.
17. Wymieniaj medium codziennie, aż kolonie staną się wystarczająco duże, aby można było je pobrać. Kolonie powinny stać się widoczne mniej więcej tydzień po rozpoczęciu reprogramowania. Powinny osiągnąć rozmiar umożliwiający pobranie około 20. dnia.

Krok 3:

Zbieranie kolonii iPS

Dzień przed zbiorem:

1. Zasiać odpowiednią liczbę γ-naświetlonych MEF z linii DR4 na płytki 24-dołkowe powlekane żelatyną

Wybieranie klonów w dniu 1.:

1. Dokarm kolonie na płytkach 1-2 godziny przed ich pobraniem.
2. Dodaj 15 μl PBS do studni płytki 96-dołkowej z dnem w kształcie litery V.
3. Przepłucz raz PBS płytkę zawierającą kolonie do pobrania, a następnie dodaj do niej 10ml PBS.
4. Pobieraj kolonie za pomocą małych końcówek do pipet o objętości 5μl (ustaw pipetę P20 na 4 μl). Przenieś kolonie do studni w płytce 96-dołkowej.
5. Dodaj 20 μl trypsyny do każdej studni za pomocą pipety wielokanałowej (12-kanałowej). Pipetuj w górę i w dół 3 razy. Inkubuj w temperaturze 37°C przez 4 minuty.
6. Dodaj 100 μl pożywki ES do trypsynizowanych kolonii. Pipetuj w górę i w dół 10 razy. Przenieś po 6 klonów jednocześnie z płytki 96-dołkowej do płytki 24-dołkowej, używając końcówki w co drugiej pozycji 12-kanałowej pipety.
7. Hoduj komórki na płytce 24-dołkowej w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO₂ aż do osiągnięcia konfluencji 80–90%, codziennie dodając pożywkę dla komórek ES. Komórki będą prawdopodobnie gotowe do pasażowania w ciągu 3-7 dni.

Krok 4

1. Ekspansja komórek iPS
   1. Odssać pożywkę i przemyć komórki 1 ml PBS.
   2. Całkowicie usunąć PBS, dodać 0,1 ml 0,25% trypsyny/1 mM EDTA i inkubować w 37°C przez 10 min.
   3. Dodać 0,4 ml pożywki ES i zawiesić komórki poprzez pipetowanie w górę i w dół, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
   4. Przenieść zawiesinę komórkową do dołka płytki 6-dołkowej, dodać 1,5 ml pożywki dla komórek ES i inkubować w inkubatorze w 37°C i 5% CO₂, aż komórki osiągną 80–90% konfluencji w płytkach 6-dołkowych. W tym momencie przygotować zamrożony stok komórek w następujący sposób.
2. Przygotowanie stoku zamrożonego
   1. Odssać pożywkę i przemyć komórki 2 ml PBS.
   2. Całkowicie usunąć PBS, dodać 0,5 ml 0,25% trypsyny/1 mM EDTA i inkubować w 37°C przez 10 min.
   3. Dodać 2 ml pożywki ES i zawiesić komórki poprzez pipetowanie w górę i w dół, aż do uzyskania zawiesiny pojedynczych komórek.
   4. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki 15-ml, policzyć liczbę komórek i odwirować komórki.
   5. Odlać nadsącz, ponownie zawiesić komórki w pożywce ES do stężenia 2x10⁶ komórek na ml.
   6. Przygotować pożywkę do zamrażania komórek ES (20% DMSO w pożywce ES) i rozdzielić ją w ilości 0,5 ml na fiolkę.
   7. Przenieść 0,5 ml zawiesiny komórkowej do fiolek do zamrażania i delikatnie wymieszać.
   8. Umieścić fiolki w pojemniku do zamrażania komórek i przechowywać w -80°C przez noc; następnego dnia przenieść do ciekłego azotu w celu długoterminowego przechowywania.

Dyskusja

W tym filmie demonstrujemy, jak wykorzystać indukowalny system lentiwirusowy do generowania pluripotencjalnych komórek iPS dodatnich pod względem GFP z MEF pochodzących od myszy Oct4-GFP/R26-M2rtTA oraz Nanog-GFP/R26-M2rtTA. Procedura ta stanowi użyteczną metodę generowania komórek iPS, ponieważ pozwala na kontrolę ekspresji transgenu podczas procesu reprogramowania. Choć zastosowanie wirusów w generowaniu komórek iPS utrudnia ich wykorzystanie w warunkach klinicznych, procedura ta umożliwia udzielenie odpowiedzi na niektóre z kluczowych pytań biologicznych, które leżą u podstaw wciąż definiowanego procesu reprogramowania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Hiclian doksycyklina	Odczynnik	Sigma-Aldrich	D9891-100G