Generowanie komórek iPS z MEFS poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Podsumowanie

Ten film pokazuje procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą indukowalnego lentiwirusa, który wyraża Oct4, Sox2, c-Myc i Klf4.

Streszczenie

Pluripotencja może być indukowana u zróżnicowanych myszy poprzez transdukcję wirusową Oct4, Sox2, Klf4 i c-Myc (Takahashi i Yamanaka, 2006; Wernig i wsp., 2007; Okita i wsp., 2007; Maherali i wsp., 2007). Opracowaliśmy strategię przeprogramowania, w której te cztery czynniki transkrypcyjne są wyrażane z wektorów lentiwirusowych indukowanych doksycykliną (doks) (Brambrink i wsp., 2008). Korzystając z tych indukowalnych konstruktów, możemy uzyskać indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS) z mysich fibroblastów embrionalnych (MEF). W tym filmie pokazujemy procedurę generowania indukowalnych lentiwirusów, które wyrażają cztery czynniki transkrypcyjne i pokazujemy, jak infekować MEF tymi wirusami w celu wytworzenia komórek iPS. Dzięki zastosowaniu indukowalnych lentiwirusów, ekspresja czterech czynników jest kontrolowana przez dodanie doksycyliny do pożywki hodowlanej. Przewagą tego systemu nad tradycyjną infekcją retrowirusową jest możliwość włączania i wyłączania genów, dzięki czemu kinetyka przeprogramowania i wymagania dotyczące ekspresji genów mogą być szczegółowo analizowane.

Protokół

Krok 1:

Rozmrozić 293 komórki i płytkę do produkcji lentiwirusa.

1. Przygotuj 9 ml pożywki DMEM+ w 15-mililitrowej probówce.
2. Wyjąć fiolkę z zamrożonymi 293 zapasami ze zbiornika ciekłego azotu i umieścić fiolkę w łaźni wodnej o temperaturze 37°C, aż większość (ale nie wszystkie) komórek zostanie rozmrożona.
3. Usuń komórki z fiolki do zamrażania i umieść w probówce o pojemności 15 ml z kroku 1.
4. Wirować przy 180 g przez 5 minut, a następnie wyrzucić supernatant.
5. Ponownie zawiesić komórki w 10 ml pożywki DMEM+ i przenieść do naczynia pokrytego żelatyną o średnicy 100 mm. Inkubować komórki w inkubatorze o temperaturze 37°C, 5%_{CO2 do} momentu, aż osiągną 80–90% zlewu.
6. Pasaż 293 komórek: umyj komórki PBS, odessaj PBS i dodaj 4 ml na 10-centymetrowe naczynie 0,05% trypsyny/0,53 mM EDTA i inkubuj przez 1 minutę w temperaturze 37°C.
7. Odłącz komórki od szalek przez stuknięcie, ponownie zawieś z 10 ml pożywki DMEM+ i przenieś do probówki o pojemności 15 ml. Odwirować przy 180 g przez 5 minut i odessać supernatant.
8. Dodaj odpowiednią objętość pożywki DMEM+ i rozbij komórki na zawiesinę pojedynczej komórki, kilkakrotnie pipetując w górę iw dół.
9. Policz liczbę komórek i dostosuj stężenie do 8x10⁵ komórek na ml z pożywką FP.
10. Komórki nasienne w formacie 8x10⁶ komórek (10 ml) na 100-milimetrowe naczynie hodowlane i inkubować przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO₂ .

Krok 2:

Transfekcja 293 komórek plazmidami lentiwirusa i wirusem żniwnym

1. Na każdą 10-centymetrową płytkę użyj 10 μg szkieletu lentiwirusa FUW-tetO-cDNA (Oct4, Sox2, Klf4 lub c-Myc) z 2,5 ug pMD-G i 7,5 μg pPax2.
2. Podczas rozdzielania trzech plazmidów do probówki, dostarczyć 30 μl odczynnika do transfekcji Fugene 6 do drugiej probówki zawierającej 500 μl DMEM bez surowicy i delikatnie wymieszać, stukając palcem i inkubować przez 5 minut w temperaturze pokojowej.
3. Dodaj mieszaninę DNA kropla po kropli do probówki zawierającej Fugene 6/DMEM, delikatnie wymieszaj, stukając palcem i inkubuj przez 20 minut.
4. Dodawać kroplami kompleks DNA/Fugene 6 do naczynia 293 i inkubować przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO₂ .
5. Następnego ranka: Odessać pożywkę zawierającą odczynnik do transfekcji, dodać 5 ml świeżej pożywki z komórek ES i wrzucić komórki z powrotem do inkubatora.
6. Po 48 godzinach i 72 godzinach od transfekcji należy pobrać pożywkę z 293 za pomocą sterylnej jednorazowej strzykawki o pojemności 10 ml, przefiltrować ją przez filtr z octanu celulozy o wielkości porów 0,45 μm i przenieść do probówki o pojemności 15 ml.
7. Zagęścić supernatant wirusa przez ultrawirowanie. Zawiesić osad wirusa w żądanej objętości i przygotować mieszaninę równych części pożywki zawierającej lentiwirusy Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- i c-Myc-lentiwirusy.
8. Podczas wytwarzania wirusa przygotuj Oct4-neo/rtTA lub Oct4-GFP/rtTA MEFs (pasaż <3) do 90% konfluencji w 10-centymetrowych szalkach (2x10⁶ komórek na szalkę)
9. Odessać pożywkę hodowlaną i przemyć 10 ml PBS.
10. Wyrzucić PBS, dodać 1 ml na naczynie 0,05% trypsyny/0,53 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37°C przez 10 minut.
11. Dodać 9 ml pożywki hodowlanej, zawiesić komórki w pojedynczej komórce i przenieść do probówki o pojemności 15 ml.
12. Policz liczbę komórek i dostosuj stężenie do 8x10⁴ komórki na ml. Przenieś 10 ml zawiesiny komórek (8x10⁵ komórek) do 10-centymetrowego naczynia pokrytego żelatyną. Inkubować naczynie przez noc w temperaturze 37°C, 5% CO₂ .
13. Odessać pożywkę z naczynia z fibroblastami i dodać 10 ml pożywki zawierającej wirusa. Inkubować komórki od 4 godzin do nocy w temperaturze 37°C, 5% CO₂ .
14. Po 24 odessać pożywkę z naczynia z fibroblastami i dodać 10 ml świeżej pożywki z komórek ES.
15. Zastąp zwykłą pożywkę komórek ES pożywką zawierającą doksycyklinę, aby zainicjować ekspresję czterech genów; innymi słowy, zainicjuj przeprogramowanie.
16. Jeśli używasz reportera Oct4-neo, rozpocznij sekcję narkotykową w dowolnym momencie od 6 do 9 dni.
17. Zmieniaj podłoże codziennie, aż kolonie staną się wystarczająco duże, aby można je było zebrać. Kolonie powinny stać się widoczne po około tygodniu od rozpoczęcia przeprogramowania. Powinny stać się wystarczająco duże, aby można je było zebrać około 20 dnia.

Krok 3:

Zbieranie kolonii iPS

Dzień przed wyborem:

1. Wysiać wymaganą liczbę pokrytych żelatyną płytek 24-dołkowych za pomocą napromieniowanych γ MEF DR4

Wybieranie klonów w dniu 1:

1. Nakarm kolonie na talerzach 1-2 godziny przed zbiorem.
2. Dodać 15 μl PBS do dołków 96-dołkowego naczynia z dnem w kształcie litery V.
3. Umyj naczynie zawierające kolonie, które mają być zebrane, raz za pomocą PBS i dodaj 10 ml PBS do naczynia.
4. Zbierz kolonie za pomocą małych końcówek do pipet o pojemności 5 μl (ustaw pipetarkę P20 na 4 μl). Przenieś kolonie do studzienki w 96-dołkowym naczyniu.
5. Dodaj 20 μl trypsyny do każdej studzienki za pomocą pipetora wielokanałowego (12). Pigazować w górę i w dół 3 razy. Inkubować w temperaturze 37°C przez 4 minuty.
6. Dodaj 100 μl pożywki ES do trypsynizowanych kolonii. Pibułuj w górę i w dół 10 razy. Przenieś 6 klonów na raz z naczynia 96-dołkowego do naczynia 24-dołkowego za pomocą końcówki w co drugiej pozycji na 12-dołkowym pipetorze.
7. Hoduj komórki na 24-dołkowej płytce w inkubatorze o temperaturze 37°C, 5% CO_{2 ,} aż komórki osiągną 80–90% konfluencji, codziennie karmiąc się pożywką z komórek ES. Komórki będą prawdopodobnie gotowe do ekspansji w ciągu 3-7 dni.

Krok 4

1. Ekspansja komórek
   iPS
   1. Odessać pożywkę i przemyć komórki 1 ml PBS.
   2. Całkowicie usunąć PBS, dodać 0,1 ml 0,25% trypsyny/1 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37°C przez 10 minut.
   3. Dodać 0,4 ml pożywki ES i zawiesić komórki przez pipetowanie w górę i w dół do zawiesiny pojedynczej komórki.
   4. Przenieś zawiesinę komórek do dołka na 6-dołkowej płytce, dodaj 1,5 ml pożywki z komórek ES i inkubuj w inkubatorze o temperaturze 37°C, 5% CO_{2 ,} aż komórki osiągną 80–90% konfluencji na płytkach 6-dołkowych. W tym momencie przygotuj zamrożony wywar z komórek w następujący sposób.
2. Przygotowanie zapasu
   do zamrażania
   1. Odessać pożywkę i przemyć komórki 2 ml PBS.
   2. Całkowicie usunąć PBS, dodać 0,5 ml 0,25% trypsyny/1 mM EDTA i inkubować w temperaturze 37°C przez 10 minut.
   3. Dodać 2 ml pożywki ES i zawiesić komórki, pipetując w górę i w dół do zawiesiny pojedynczej komórki.
   4. Przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml, policzyć liczbę komórek i odwirować komórki.
   5. Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić komórki pożywką ES do stężenia 2x10⁶ komórek na ml.
   6. Przygotować 2 pożywki do zamrażania komórek ES (20% DMSO w pożywce ES) i podać porcję w ilości 0,5 ml na fiolkę.
   7. Przenieść 0,5 ml zawiesiny komórkowej do zamrożenia fiolek i delikatnie wymieszać.
   8. Umieścić fiolki w pojemniku do zamrażania komórek i przechowywać w temperaturze -80°C przez noc; następnego dnia przenieść do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.

Dyskusja

W tym filmie pokazujemy, jak wykorzystać indukowalny system lentiwirusowy do generowania GFP-dodatnich, pluripotencjalnych komórek iPS z MEF pochodzących od myszy Oct4-GFP / R26-M2rtTA i Nanog-GFP / R26-M2rtTA. Procedura ta jest przydatną metodą generowania komórek iPS, ponieważ pozwala na kontrolę ekspresji transgenu podczas procesu przeprogramowywania. Chociaż wykorzystanie wirusów w generowaniu komórek iPS utrudnia wykorzystanie tych komórek w warunkach klinicznych, procedura ta pozwala nam odpowiedzieć na niektóre z głównych pytań biologicznych, które leżą u podstaw jeszcze zdefiniowanego procesu przeprogramowywania.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik do hykulanu doksycykliny		Sigma-Aldrich	D9891-100G