W tym filmie prezentujemy alternatywną metodę wykrywania i mianowania wirusów przy użyciu enzymatycznej techniki wykrywania antygenów, znanej jako test immunoperoksydazowy. Pokażemy, jak pobierać próbki wirusowe, przygotować komórki do testów, a następnie przeprowadzić test immunoperoksydazowy z wykorzystaniem rozcieńczeń seryjnych w celu oznaczenia miana wirusa.
Artykuł metodologiczny
Miareczkowanie ludzkich koronawirusów z wykorzystaniem testu immunoperoksydazowego
W tym artykule
Informacja o sprostowaniu
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
Podsumowanie
Streszczenie
Oznaczanie mian wirusa zakaźnego jest podstawowym i niezbędnym podejściem eksperymentalnym w wirusologii. Klasyczne testy plackowe nie mogą być stosowane w przypadku wirusów, które nie wywołują istotnych efektów cytopatycznych, co ma miejsce w przypadku szczepów prototypowych 229E i OC43 ludzkiego koronawirusa (HCoV). W związku z tym opracowano alternatywny pośredni test immunoperoksydazowy (IPA) do detekcji i miareczkowania tych wirusów, który został tutaj opisany. Podatne komórki w formacie płytki 96-dołkowej inokuluje się seryjnymi rozcieńczeniami logarytmicznymi próbek zawierających wirusa. Po namnożeniu wirusa detekcja metodą IPA pozwala wyznaczyć miano wirusa zakaźnego, wyrażone jako „średnia dawka zakaźna dla hodowli tkankowej 50%” (TCID50). Reprezentuje ona rozcieńczenie próbki zawierającej wirusa, przy którym połowa z serii dołków laboratoryjnych zawiera zakaźnego, replikującego się wirusa. Technika ta zapewnia niezawodną metodę miareczkowania HCoV-229E i HCoV-OC43 w próbkach biologicznych, takich jak komórki, tkanki i płyny. Niniejszy artykuł opiera się na pracy po raz pierwszy opisanej w Methods in Molecular Biology (2008) tom 454, strony 93-102.
Protokół
Pełny tekst protokołu dla tego podejścia eksperymentalnego jest dostępny w Springer Protocols.
Oświadczenia
Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.
Przedruki i uprawnienia
Sprostowanie
Formal Correction: Erratum: Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay
Posted by JoVE Editors on 4/01/2012. Citeable Link.
A correction was made to: Titration of Human Coronaviruses Using an Immunoperoxidase Assay. A revised abstract was republished due to a publisher error.
Revised Abstract:
Determination of infectious viral titers is a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for prototype strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). Therefore, an alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) was developed for the detection and titration of these viruses and is described herein. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of virus-containing samples in a 96-well plate format. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as 'Tissue Culture Infectious Dose 50 percent' (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain infectious replicating virus. This technique provides a reliable method for the titration of HCoV-229E and HCoV-OC43 in biological samples such as cells, tissues and fluids. This article is based on work first reported in Methods in Molecular Biology (2008) volume 454, pages 93-102.
Original Abstract:
Calculation of infectious viral titers represents a basic and essential experimental approach for virologists. Classical plaque assays cannot be used for viruses that do not cause significant cytopathic effects, which is the case for strains 229E and OC43 of human coronavirus (HCoV). An alternative indirect immunoperoxidase assay (IPA) is herein described for the detection and titration of these viruses. Susceptible cells are inoculated with serial logarithmic dilutions of samples in a 96-well plate. After viral growth, viral detection by IPA yields the infectious virus titer, expressed as "Tissue Culture Infectious Dose" (TCID50). This represents the dilution of a virus-containing sample at which half of a series of laboratory wells contain replicating virus. This technique is a reliable method for the titration of HCoV in biological samples (cells, tissues or fluids).
