Pełny protokół tekstowy dla tego podejścia eksperymentalnego jest dostępny w <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb0101/current/abstract" target="_blank">Current Protocols in Cell Biology</a>.

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

trypsynizacja i pasażowanie komórek ssaczych

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Gdy komórki osiągną pełną konfluencję, należy przeprowadzić ich subkulturę lub pasażowanie. Brak subkultury konfluencyjnych komórek prowadzi do obniżenia indeksu mitotycznego, a w konsekwencji do śmierci komórek. Pierwszym krokiem w procesie subkulturowania jest oddzielenie komórek od powierzchni naczynia kultury pierwotnej poprzez trypsynizację lub metodami mechanicznymi. Otrzymaną w ten sposób zawiesinę komórkową następnie dzieli się i wysiewa do świeżych kultur. Kultury wtórne są monitorowane pod kątem wzrostu i okresowo zasilane pożywką, a następnie mogą zostać poddane kolejnej subkulturze w celu uzyskania kultur trzeciorzędowych. Czas między pasażami komórek różni się w zależności od linii komórkowej i zależy od szybkości wzrostu.

W momencie gdy komórki osiągają konfluencję, należy je poddać subkulturze lub pasażowaniu. Niniejszy film zaprezentuje procedurę subkultury komórek adherentnych oraz zawiesinowych.

Trypsynizacja i pasażowanie komórek ssaczych

W miarę osiągania przez komórki konfluencji, należy poddać je subkulturze lub pasażowaniu. Brak subkultury konfluencyjnych komórek prowadzi do obniżenia indeksu mitotycznego, a w konsekwencji do ...

Technologia hodowli tkankowej znalazła szerokie zastosowanie w dziedzinie biologii komórki. Jednakże hodowane komórki wymagają regularnej pielęgnacji, aby zachować żywotność. Gdy komórki osiągną pełną konfluencję, muszą zostać poddane subkulturze lub pasażowaniu.Zaniechanie tych czynności prowadzi do ograniczenia wzrostu, a w konsekwencji do śmierci komórek. W tym filmie demonstrujemy, jak utrzymywać hodowle komórkowe zarówno w przypadku linii komórkowych adherentnych, jak i zawiesinowych. Cześć, jestem Ricky z laboratorium dr. LAN w sieci Molecular Pathology Laboratories w East Tennessee.Dzisiaj chcę przedstawić dwie techniki pasażowania komórek zawiesinowych oraz komórek przylegających. Aby przeprowadzić pasaż komórek z płytki, zaczniemy od hodowli pierwotnej, która osiągnęła pełną konfluencję w 60 mm szalce Petriego lub 25 cm² flasku do hodowli tkanek zawierającym 5 ml medium do hodowli tkanek.Zaczynamy od usunięcia całej pożywki z hodowli pierwotnej za pomocą sterylnej pipety. Następnie przemywamy przylegającą monowarstwę komórek raz lub dwa razy niewielką objętością HBSS bez wapnia i magnezu o temperaturze 37 °C. Ma to na celu usunięcie pozostałości płodowej surowicy bydlęcej, która mogłaby hamować działanie enzymu trypsyny dodawanego w kolejnym kroku.Następnie dodaj do hodowli odpowiednią ilość ciepłego roztworu trypsyny z EDTA, aby pokryć przyrastającą warstwę komórek. Następnie płytkę można umieścić na podgrzewaczu o temperaturze 37 °C na jedną do dwóch minut. Po inkubacji ostukać dno płytki o płaską powierzchnię, aby odczepić komórki.Sprawdź hodowlę pod mikroskopem odwróconym, aby upewnić się, że komórki stały się okrągłe, co wskazuje na ich odklejenie się od powierzchni. Jeśli komórki nie odkleiły się w wystarczającym stopniu, wprowadź płytkę z powrotem do ogrzewacza na dodatkową minutę lub dwie. Po oględzinach pod mikroskopem wypłucz naczynie w pełnej pożywce i przelej zawiesinę pipetą do 15 ml probówki stożkowej zawierającej 2 ml pełnej pożywki.Odwiruj komórki, aby otrzymać osad, a następnie resuspenduj go w pożywce kompletnej. Następnie dodaj równą objętość zawiesiny komórkowej do każdej z nowych, odpowiednio oznakowanych płytek. Alternatywnie komórki można policzyć za pomocą komory udowania i rozcieńczyć do pożądanej gęstości, aby do każdej płytki dodać określoną liczbę komórek.Należy pamiętać, aby opisać każdą płytkę datą subkultury oraz numerem pasażu. Po dodaniu zawiesiny komórek, dodaj 1 ml świeżej pożywki do każdej nowej kultury. Następnie inkubuj płytki w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C i 5% CO2.Po inkubacji komórek przez noc, należy dodać do płytek świeżą pożywkę i ponownie umieścić je w temperaturze 37 stopni. Gdy komórki na płytce osiągną pełną konfluencję, można przeprowadzić ponowne pasażowanie, powtarzając tę procedurę i kontynuując pasażowanie w razie potrzeby. Teraz pokażemy, jak pasażować komórki w hodowli zawiesinowej.Pakowanie komórek w hodowli zawiesinowej jest prostsze niż w przypadku komórek adherentnych. Przed pakowaniem hodowli zawiesinowych komórki muszą być utrzymywane poprzez dokarmianie co dwa do trzech dni, aż osiągną konfluencję, czyli moment, w którym komórki skupiają się w zawiesinie, a medium staje się mętne podczas zakręcania kolby.Aby to zrobić, wyjmij kolbę z zawiesiną komórek z inkubatora, uważając, aby nie zakłócić tych, które osiadły na dnie kolby. Aseptycznie usuń i odrzuć około jednej trzeciej pożywki z kolby, a następnie zastąp ją równą objętością uprzednio ogrzanej pożywki w temperaturze 37 °C. Po wymianie pożywki delikatnie zakręć kolbą i przenieś ją z powrotem do inkubatora w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2.Jeśli w kolbie znajduje się mniej niż 15 ml pożywki, należy inkubować ją w pozycji poziomej, aby zwiększyć kontakt komórek z pożywką. W przeciwnym razie kolbę można inkubować pionowo w dniach, w których nie przeprowadza się dokarmiania kultur. Należy sprawdzać je, delikatnie obracając kolby w celu resuspensji komórek.Należy zwrócić uwagę na wszelkie zmiany koloru pożywki, które świadczą o prawidłowym wzroście metabolicznym. Po osiągnięciu konfluencji kultur, co powinno nastąpić przy około 2,5 miliona komórek na ml, można przeprowadzić pasaż. W ten sposób zaprezentowaliśmy metodę pasażowania hodowlach komórek zarówno w formie przylegającej, jak i zawiesiny.To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we wszystkich eksperymentach.

trypsinizing-and-subculturing-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Trypsyna i subkulturacja komórek ssaków

Molecular Pathology Laboratory Network, Inc.  Gdy komórki osiągną konfluencję, muszą zostać podkulturowe lub pasażowane. W tym filmie zademonstrujemy procedurę subkulturacji zarówno komórek przylegających, jak i zawiesinowych.

Summary

Gdy komórki osiągną pełną konfluencję, należy przeprowadzić ich subkulturę lub pasażowanie. Brak subkultury konfluencyjnych komórek prowadzi do obniżenia indeksu mitotycznego, a w konsekwencji do śmierci komórek. Pierwszym krokiem w procesie subkulturowania jest oddzielenie komórek od powierzchni naczynia kultury pierwotnej poprzez trypsynizację lub metodami mechanicznymi. Otrzymaną w ten sposób zawiesinę komórkową następnie dzieli się i wysiewa do świeżych kultur. Kultury wtórne są monitorowane pod kątem wzrostu i okresowo zasilane pożywką, a następnie mogą zostać poddane kolejnej subkulturze w celu uzyskania kultur trzeciorzędowych. Czas między pasażami komórek różni się w zależności od linii komórkowej i zależy od szybkości wzrostu.

Trypsynizacja i pasażowanie komórek ssaczych

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Protokół

Oświadczenia

Przedruki i uprawnienia

Tagi