Immunoprecypitacja chromatyny z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Podsumowanie

Różnicowanie ESC zbiega się z charakterystycznymi dla danego typu komórek zmianami w strukturze i składzie chromatyny. Wykrycie tych zmian dostarcza cennych informacji na temat mechanizmów definiujących pluripotencję oraz różnicowanie komórek. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi wartościową metodę analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw różnicowania komórek macierzystych.

Streszczenie

Funkcjonalna i strukturalna złożoność niezliczonych komórek w organizmach metazoicznych wywodzi się z niewielkiej liczby komórek macierzystych. Komórki macierzyste charakteryzują się dwiema fundamentalnymi właściwościami: zdolnością do samoodnawiania oraz multipotencjalnością, która pozwala komórce macierzystej zróżnicować się w niemal każdy typ komórek ¹. Przejście od komórki macierzystej do komórki zróżnicowanej charakteryzuje się utratą multipotencjalności, zmianami strukturalnymi i morfologicznymi oraz hierarchiczną aktywnością czynników transkrypcyjnych i cząsteczek sygnałowych, których działanie ustanawia i utrzymuje specyficzne dla danego typu komórek wzorce ekspresji genów. Na poziomie molekularnym różnicowanie komórek wiąże się z dynamicznymi zmianami struktury i składu chromatyny, a wykrycie tych zmian może dostarczyć cennych informacji na temat cech funkcjonalnych komórek macierzystych oraz procesu różnicowania komórkowego ^2,3. Chromatyna to silnie upakowany kompleks DNA-białko, który tworzy się, gdy komórki pakują chromosomalne DNA z białkami, głównie histonami ⁴. Stan komórki macierzystej oraz różnicowanie komórkowe skorelowano z obecnością specyficznych układów białek regulacyjnych, takich jak czynniki epigenetyczne, warianty histonów i czynniki transkrypcyjne ^2,3,5.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi cenną metodę monitorowania obecności RNA, białek oraz modyfikacji białek w chromatynie ^6,7. Porównanie chromatyny z różnych typów komórek pozwala wyjaśnić dynamiczne zmiany w oddziaływaniach białko-chromatyna, które zachodzą podczas różnicowania komórek.

Immunoprecypitacja chromatyny polega na oczyszczaniu chromatyny sieciowanej in vivo. Wyizolowana chromatyna jest redukowana do mniejszych fragmentów poprzez trawienie enzymatyczne lub siłę mechaniczną. Fragmenty chromatyny są wytrącane przy użyciu specyficznych przeciwciał skierowanych przeciwko białkom docelowym lub modyfikacjom białek i DNA. Wytrącone DNA lub RNA jest oczyszczane i wykorzystywane jako matryca dla PCR lub testów opartych na mikromacierzach DNA. Warunkami niezbędnymi do pomyślnego przeprowadzenia ChIP są wysokiej jakości przeciwciała przeciwko pożądanemu antygenowi oraz dostępność chromatyny z komórek kontrolnych, które nie wykazują ekspresji cząsteczki docelowej. ChIP pozwala na powiązanie obecności białek, modyfikacji białek i RNA oraz RNA ze specyficznym docelowym DNA i, w zależności od wybranego narzędzia odczytu, wykrywa asocjację cząsteczek docelowych w konkretnych genach docelowych lub w kontekście całego genomu. Porównanie rozkładu białek w chromatynie różnicujących się komórek może wyjaśnić dynamiczne zmiany w składzie chromatyny, które zbiegają się z progresją komórek wzdłuż danej linii komórkowej.

Protokół

Rozmrażanie komórek ES (nie pokazane na filmie)

Komórki ES mrozi się w pożywce zawierającej 10% DMSO. Ponieważ DMSO może indukować różnicowanie komórek ES, można rozmrozić komórki późno w ciągu dnia, a następnie wymienić pożywkę następnego ranka, aby zminimalizować wpływ resztkowego DMSO.

1. Pokryć płytkę tkankową 6-dołkową 0,1% żelatyną na co najmniej 15 min, a następnie odessać roztwór bezpośrednio przed wysianiem komórek.
2. Rozmrozić komórki ES (około 5×10⁶ komórek, co odpowiada jednej konfluentnej płytce 6-dołkowej) w kąpieli wodnej o temperaturze 37°C i rozcieńczyć w 10 ml podgrzanego wcześniej medium do hodowli komórek ES.
3. Zbić komórki w pellet, wirując przez 10 minut przy 1000 rpm w laboratoryjnej wirówce klinicznej.
4. Odessać medium i delikatnie resuspendować komórki w 10 ml podgrzanego do 37°C medium.
5. Przenieść zawiesinę komórkową na płytkę 6-dołkową i inkubować w temperaturze 37°C w wilgotnym inkubatorze z 5% CO₂.
6. Następnego dnia wymienić medium, aby usunąć martwe komórki oraz pozostałości DMSO.

Pasażowanie i namnażanie kultur komórek ES

Komórki ES są rutynowo pasażowane co 2/3 dni, a medium jest wymieniane co drugi dzień. Zatem komórki ES wymagają codziennej uwagi. W naszym doświadczeniu komórki ES niezależne od warstwy karmionej rosną szybko i błyskawicznie zakwaszają medium, zmieniając jego kolor na żółty. Pozostawienie komórek w zakwaszonym medium (poprzez niewymianę mediów codziennie lub pasażowanie komórek przy zbyt niskim rozcieńczeniu) spowoduje wystąpienie kryzysu komórkowego, co wywoła nadmierne różnicowanie i śmierć komórek, po czym ich totipotencja nie może być już gwarantowana. Wysiewanie komórek przy zbyt niskiej gęstości, niewystarczająca dyspersja komórek podczas pasażowania lub nierównomierne wysiewanie mogą powodować podobne problemy, ponieważ komórki będą tworzyć duże skupiska przed osiągnięciem konfluencji, a komórki wewnątrz tych skupisk będą ulegać różnicowaniu lub obumierać. Transmisja w linii zarodkowej jest znacznie zredukowana w komórkach, które były niewłaściwie traktowane, nawet jeśli w momencie iniekcji wydają się zdrowe.

1. Z płytki 6-dołkowej z konfluentną warstwą komórek odessać medium i przemyć komórki 2-3 ml podgrzanego do 37°C PBS, pipetując go z dala od komórek.
2. Przykryć komórki 1 ml 1× roztworu trypsyny na 3-4 minuty lub do momentu, aż komórki zostaną równomiernie rozproszone w małe skupiska.
3. Dodać 1 ml medium w celu inaktywacji trypsyny.
4. Zebrać trypsynizowane komórki i przenieść je (zazwyczaj 2/5 dołka) na świeżo żelatynizowaną płytkę 6-dołkową.

Mrożenie komórek ES

1. Poddać trypsynizacji konfluencyjną płytkę 6-dołkową (około 1 × 10⁷ komórek) zgodnie z powyższym opisem.
2. zebrać trypsynizowane komórki w 9 ml pożywki i odwirować przez 5 minut przy 1,000 rpm.
3. Odssać pożywkę i zawiesić osad komórkowy w 1 ml świeżo przygotowanego medium do zamrażania. Przenieść po 0,5 ml zawiesiny komórek do dwóch krioprobek.
4. Zamrozić probówki w temperaturze -80°C przez noc, a następnie przenieść do ciekłego azotu w celu długoterminowego przechowywania.

PROCEDURA ChIP-on-chip

Immunoprecypitacja

1. Siatkowanie komórek formaldehydem (dla komórek w zawiesinie)
   
   1. Użyć 5 x 10⁷ – 1 x 10⁸ komórek na każdą immunoprecypitację.
   2. Do zawiesiny komórek dodać świeży formaldehyd do stężenia 1%.
   3. Inkubować komórki z roztworem formaldehydu przez 10 minut w temperaturze pokojowej.
   4. Dodać 1/10 objętości 1,25 M glicyny w celu zneutralizowania formaldehydu.
   5. Przepłukać komórki dwukrotnie 10 ml 1x PBS.
   6. Zebrać komórki do probótek stożkowych 50 ml i wirować przy 700g przez 5 min w 4°C. Odlać nadsącz i resuspender osad w 1,5 ml buforu lizującego. Przenieść komórki do probówki mikrocentryfugowej 1,5 ml.
2. Komórki zamrozić gwałtownie trzykrotnie w ciekłym azocie i rozdrobnić za pomocą homogenizatora tkankowego. Po usieciowaniu komórki mogą być przechowywane w zamrożeniu w -80°C bezterminowo.

Przygotowanie kulek magnetycznych (Wszystkie etapy należy przeprowadzić w temperaturze 4°C)

1. Do mikroprobówki o niskiej retencji o pojemności 1,5 ml dodać 50 µl kulek Dynal. Przygotować jedną probówkę z kulkami na każdą immunoprecypitację. Dodać 1 ml roztworu blokującego (Block Solution).
2. Zebrać kulki za pomocą Dynal MPC. Umieścić probówki w statywie magnetycznym. Odczekać, aż kulki osiądą na ściance probówki, co powinno zająć około 15 s. Odwrócić statyw dwukrotnie, aby ułatwić zbieranie kulek. Usunąć nadsącz za pomocą pipety.
3. Dodać 1 ml roztworu blokującego i delikatnie resuspendować kulki, wyjmując pasek magnetyczny ze statywu i odwracając statyw z probówkami wewnątrz – powtórzyć czynność 10-20 razy lub do momentu równomiernego resuspendowania kulek. Zebrać kulki w sposób opisany powyżej (Krok 2). Usunąć nadsącz za pomocą pipety.
4. Przemyć kulki w 1,5 ml roztworu blokującego, analogicznie do Kroku 3, jeszcze jeden raz.
5. Resuspendować kulki w 750 µl roztworu blokującego i dodać 10 µg przeciwciała. Inkubować w temperaturze 4°C przez minimum 6h lub przez noc na rotatorze.
6. Przemyć kulki trzy razy w 1 ml roztworu blokującego, zgodnie z opisem w Kroku 3.

Sonikacja komórek

1. Wyjąć zamrożone pellety komórkowe z temperatury -80°C i przenieść komórki do probówek do sonikacji. Obecnie preferujemy używanie dna standardowej polipropylenowej probówki stożkowej o pojemności 15 ml do sonikacji. Probówkę przecinamy na dwie części na wysokości znaku 5 ml i odrzucamy górną połowę. Podczas przygotowań probówki można przykryć parafimem lub zakrętką.
2. Używając statywu do probówek do mikrowirówki, ustawić probówkę tak, aby sonda sonikatora znajdowała się około 0,5-1,0 cm nad dnem probówki. Należy zadbać o to, aby sonda była wycentrowana i nie dotykała ścianek probówki. (Pozycjonowanie sondy może wpływać na to, czy roztwór spieni się podczas sonikacji. Zazwyczaj pienienie wskazuje, że sonikowane DNA zostanie słabo pocięte).
3. Sonikować zawiesinę 6 razy przez 20 s. Próbki powinny być utrzymywane w łaźni lodowo-wodnej podczas sonikacji. Aby zmniejszyć pienienie, początkowo ustawić moc wyjściową na 0 i zwiększać ją ręcznie do mocy końcowej podczas pierwszego impulsu. (W przypadku znacznego pienienia wszystkie pęcherzyki można usunąć poprzez wirowanie przy 20,000g, a następnie delikatne resuspensowanie całego materiału, tak aby nie pozostały pęcherzyki piany).
4. Wirować przy 20,000g przez 10 min w temperaturze 4°C w celu osadzenia resztek komórkowych i zebrać nadsącz do probówki 1,5 ml.
5. Odprowadzić 50 µl lizatu komórkowego z każdej próbki jako DNA wejściowe. Przechowywać w temperaturze -20°C. Należy zachować co najmniej jedną alikwot DNA wejściowego dla każdej partii sonikowanego lizatu. Należy pamiętać, że wpływ sonikacji i wynikający z niej rozkład wielkości fragmentów można sprawdzić dopiero po odwróceniu sieciowania i oczyszczeniu DNA.

Immunoprecypitacja chromatyny

1. Do 50 µl mieszaniny przeciwciał i kulek magnetycznych z etapu Przygotowanie kulek magnetycznych, krok 6  dodać ilość komórek równoważną ilości chromatyny (od 5 x 10⁷ do 1 x 10⁸ komórek) z etapu Sonikacja komórek, krok 4 , tak aby końcowa objętość wyniosła 1 ml (w razie potrzeby można ją dostosować za pomocą buforu lizującego). Inkubować przez noc na rotatorze w temperaturze 4°C.

Przemyć

1. Zebrać kuleczki za pomocą Dynal MPC. Umieścić probówki w statywie i odczekać, aż kuleczki osadzą się na ściance probówki. Powinno to zająć około 20 s. Odwrócić statyw dwukrotnie, aby wspomóc zebranie wszystkich kuleczek. Usunąć naddatek pipetą, zmieniając końcówki między próbkami.
2. Do każdej probówki dodać 1 ml buforu do lizy (Lysis Buffer) i delikatnie resuspendować kuleczki. Można to zrobić, wyjmując pasek magnetyczny ze statywu i odwracając statyw z probówkami wewnątrz – 10-20 razy lub do momentu równomiernego resuspendowania kuleczek. Zebrać kuleczki. Usunąć naddatek pipetą. Powtórzyć to płukanie jeszcze 5 razy, zmieniając końcówki między poszczególnymi etapami.
3. Przepłukać kuleczki 6 razy w 1 ml buforu IP1 (IP1 Buffer), zgodnie z opisem w kroku 2.
4. Przepłukać kuleczki 6 razy w 1 ml buforu IP2 (IP2 Buffer), zgodnie z opisem w kroku 2.
5. Przepłukać kuleczki 6 razy w 1 ml buforu TE 8.0 (TE 8.0 Buffer), zgodnie z opisem w kroku 2.
6. Wirować z prędkością 960g przez 3 min w temperaturze 4°C i usunąć pozostałości buforu TE.

Elucja

1. Dodać 210 µl buforu elucyjnego i eluować materiał z kulek, inkubując probówki w łaźni wodnej o temperaturze 65°C przez 15 min. Krótko wirować w vortexie co 2 min. Inkubację tę można wydłużyć do 30 min, co może pomóc w zwiększeniu odzysku eluatu.
2. Odwirować kulki z prędkością 16,000g przez 1 min w temperaturze pokojowej.
3. Odać 200 µl supernatantu i przenieść go do nowej probówki. Materiał można zamrozić w temperaturze -20°C i przechowywać przez noc.

Odwrócenie sieciowania

1. Przeprowadź odwrócenie sieciowania DNA z immunoprecypitacji z etapu Elucja, krok 3 poprzez inkubację w temperaturze 65°C przez minimum 6 h i maksymalnie 15 h (dłuższy czas odwracania sieciowania zazwyczaj prowadzi do zwiększenia poziomu szumu w analizie mikromacierzy). Inkubację tę można przeprowadzić w inkubatorze, aby zapewnić równomierne ogrzewanie probówki i zminimalizować powstawanie kondensatu.
2. Odmroź 50 µl DNA wejściowego (input) odłożonego po sonikacji (krok 13), dodaj 150 µl (3 objętości) buforu do elucji i wymieszaj. Odwróć sieciowanie tego DNA wejściowego poprzez inkubację w 65°C, analogicznie do etapu Odwracanie sieciowania, krok 1. Od tego momentu każda probówka z DNA z immunoprecypitacji lub DNA wejściowego jest traktowana jako osobna probówka lub próbka w dalszych etapach procesu.

Oczyszczanie DNA

1. Dodać 8 µl RNazy A o stężeniu 10 mg ml-1 (stężenie końcowe 0,2 mg ml-1), wymieszać poprzez kilkukrotne odwrócenie probówki i inkubować w temperaturze 37°C przez 2 h.
2. Dodać 4 µl Proteinazy K o stężeniu 20 mg ml-1 (stężenie końcowe 0,2 µg ml-1), wymieszać poprzez kilkukrotne odwrócenie probówki i inkubować w temperaturze 55°C przez 2 h.
3. Dodać 400 µl mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylowy (P:C:IA), wymieszać w wirówce typu vortex i rozdzielić fazy za pomocą probówki Heavy Phaselock o pojemności 2 ml (zgodnie z instrukcją firmy Eppendorf).
4. Jeśli roztwór P:C:IA jest stary lub ma niskie pH, dojdzie do degradacji DNA, co spowoduje szum w analizie mikroarray i utratę detekcji prawidłowych celów.
5. Przenieść warstwę wodną do nowej probówki wirówkowej zawierającej 16 µl 5M NaCl (stężenie końcowe 200 mM) oraz 1,5 µl glikogenu o stężeniu 20 µ µl-1 (łącznie 30 µg).
6. Dodać 800 µl EtOH. Inkubować przez noc w temperaturze -20°C lub przez 30 min w temperaturze -80°C.
7. Wirować przy 20 000g przez 10 min w temperaturze 4°C w celu osadzenia DNA. Przemyć osady, dodając 500 µl 80% EtOH, mieszając w wirówce typu vortex w celu resuspensji osadu i ponownie wirując przy 20 000g przez 5 min w temperaturze 4°C.
8. Usunąć pozostały 80% EtOH. Krótko odwirować probówki, aby zebrać resztki cieczy, a następnie usunąć ciecz pipetą, unikając dotknięcia osadu. Pozostawić probówki do wyschnięcia na powietrzu, aż osady będą prawie suche; powinny one nadal sprawiać wrażenie wilgotnych. Resuspender każdy osad w 70 µl 10 mM Tris-HCl, pH 8.0.
9. Zbyt mocne wysuszenie osadów może utrudnić ich resuspensję lub spowodować ich łuszczenie się i odklejanie od ścianek probówki.
10. Opcjonalnie: Odłożyć 15 µl próbki z immunoprecypitacji do późniejszego użycia. Materiał ten można wykorzystać do potwierdzenia wyników mikroarray za pomocą specyficznej dla genu reakcji PCR.
11. Oznaczyć stężenie metodą absorbancji UV (260 nm).

Uwaga: Następujące kroki, obejmujące przygotowanie biblioteki i amplifikację, wykorzystują zmodyfikowany zestaw GenomePLex WGA z 10X Amp Mix firmy Sigma bez dNTP:

Przygotowanie biblioteki

Dostępne w zestawie GenomePLex WGA wraz z 10X Amp Mix firmy Sigma

1. Do probówki PCR dodać 2 µl 1X buforu do przygotowania biblioteki (Library Preparation Buffer) do 10 µl próbki DNA z etapu Purification DNA, krok 11.
2. Dodać 1 µl roztworu do stabilizacji biblioteki (Library Stabilization Solution).
3. Dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex, skondensować poprzez wirowanie, a następnie umieścić w termocyklerze w temperaturze 95°C na 2 minuty.
4. Schłodzić próbkę na lodzie, skondensować poprzez wirowanie, a następnie ponownie umieścić na lodzie.
5. Dodać 1 µl enzymu do przygotowania biblioteki (Library Preparation Enzyme), dokładnie wymieszać w wirówce typu vortex, a następnie krótko odwirować.
6. Umieścić próbkę w termocyklerze i inkubować w następujący sposób:
   • 16°C przez 20 minut
   • 24°C przez 20 minut
   • 37°C przez 20 minut
   • 75°C przez 5 minut
   • przechowywanie w 4°C
7. Wyjąć próbki z termocyklera i krótko odwirować. Próbki można amplifikować natychmiast lub przechowywać w temperaturze 20°C przez trzy dni.

Amplifikacja

Dostępny w zestawie GenomePLex WGA wraz z 10X Amp Mix firmy Sigma

1. Mieszaninę główną (master mix) przygotowuje się poprzez dodanie następujących odczynników do 15 µl reakcji z kroku 3 opisanego poniżej:
   
   • 7,5 µl 10X Amp Mix (bez dNTP)
   • 5,0 µl polimerazy DNA WGA
   • 3,0 µl roztworu stokowego 10 mM dNTP (każdego) (stężenie końcowe 0,4 mM)
   • Uzupełnienie końcowej objętości reakcji do 75 µl wodą wolną od nukleaz
2. Dokładnie wymieszać na wirówce typu vortex. Krótko odwirować i rozpocząć cykling termiczny.
   
   • Denaturacja wstępna: 95°C przez 3 minuty
   • Wykonać 14 cykli według następującego schematu:
   • Denaturacja: 94°C przez 15 sekund
   • Przyłączanie/Wydłużanie: 65°C przez 5 minut
   Po zakończeniu cyklowania utrzymywać reakcje w temperaturze 4°C lub przechowywać w -20°C do czasu analizy lub oczyszczania.
3. Oczyścić DNA za pomocą zestawu PCR Purification® Kit firmy Quiagen zgodnie z instrukcją producenta i określić stężenie metodą absorpcji UV (260 nm).
4. Ponownie przeprowadzić cykl amplifikacji od Przygotowania biblioteki, kroku 1 przez Amplifikację, krok 2, z następującymi modyfikacjami.
   
   • W odniesieniu do ilości DNA wymaganego w kroku 3 powyżej, do rozpoczęcia procesu fragmentacji: jeśli stężenie DNA wynosi około 200-300 µg/ml, należy użyć 2,5 µl próbki i uzupełnić wodą do końcowej objętości 10 µl.
   Jeśli stężenie DNA wynosi około 50-60 µg/ml, należy użyć 5 µl próbki i uzupełnić wodą do końcowej objętości 10 µl.
   
   
   • W tym drugim procesie amplifikacji dNTP z dTTP w mieszaninie głównej zastępuje się mieszaniną zawierającą 10 mM dATP, 10 mM dGTP, 10 mM dCTP oraz 8 mM dTTP i 2 mM dUTP, w takim samym stężeniu jak w poprzedniej mieszaninie.
   
   
5. Zmierzyć ilość DNA za pomocą spektrofotometru UV-vis (260 nm). Zazwyczaj z każdej reakcji uzyskuje się ponad 9 µg amplifikowanego DNA.
   
   Uwaga: Znakowanie celów DNA wykonuje się za pomocą zestawu GeneChip® WT Double-Stranded DNA Terminal Labelling Kit firmy Affymetrix zgodnie z instrukcją producenta, jak opisano poniżej:
   

Fragmenty namnożonych celów

1. Przeprowadź fragmentację próbek, korzystając z odpowiedniej tabeli poniżej, w zależności od rodzaju matrycy, z którą będzie hybrydyzowany cel.
   
   Tabela 1. Mieszanina do fragmentacji dla pojedynczych matryc

   Objętość/ilość składnika w 1 reakcji

   Dwuniciowe DNA 7.5 µg

   10X cDNA Fragmentation 4.8 µl

   UDG, 10 U/µl 1.5 µl

   APE 1, 100 U/µl 2.25 µl

   Woda wolna od nukleaz do 48 µl

   Dostępne w zestawie GeneChip® WT Double-Stranded DNA Terminal Labelling Kit firmy Affymetrix
   
   Tabela 2. Mieszanina do fragmentacji dla zestawów wielomatrycowych

   Objętość/ilość składnika w 1 reakcji

   Dwuniciowe DNA 9 µg

   10X cDNA Fragmentation 4.8 µl

   UDG, 10 U/µl 1.5 µl

   APE 1, 100 U/µl 2.25 µl

   Woda wolna od nukleaz do 48

   Dostępne w zestawie GeneChip® WT Double-Stranded DNA Terminal Labelling Kit firmy Affymetrix
2. Przygotuj mieszaninę do fragmentacji zgodnie z jedną z powyższych tabel. Wymieszaj próbki przez delikatne potrząsanie (flick-mix) i odwiruj probówki.
3. Inkubuj reakcje w temperaturach:
   • 37°C przez 1 h.
   • 93°C przez 2 min.
   • 4°C przez co najmniej 2 minuty.
4. Wymieszaj próbki przez delikatne potrząsanie, odwiruj probówki i przenieś 45 µl próbki do nowej probówki.
5. Pobierz 2 µl każdej próbki do analizy przesunięcia w elektroforezie żelowej.

Oznakowanie pofragmentowanego dwuniciowego DNA

1. Przygotować mieszaninę do znakowania dwuniciowego DNA zgodnie z poniższą tabelą:
   
   Tabela 3. Skład mieszaniny do znakowania dwuniciowego DNA

   Składnik Objętość/Ilość na 1 reakcję

   Bufor TdT 5X 12 µl

   TdT 2 µl

   Odczynnik do znakowania DNA, 5 mM 1 µl

   Objętość całkowita 15 µl

   Dostępne w zestawie GeneChip® WT Double-Stranded DNA Terminal Labelling Kit firmy Affymetrix
2. Dodać 15 µl mieszaniny do znakowania dwuniciowego DNA do próbek DNA, wymieszać poprzez delikatne potrząsanie i odwirować.
3. Inkubować reakcje w temperaturach:
   • 37°C przez 60 min.
   • 70°C przez 10 min.
   • 4°C przez co najmniej 2 min.
4. Pobrać 2 µl każdej próbki do analizy przesunięcia w elektroforezie żelowej.

Analiza przesunięcia w żelu (EMSA)

1. Przygotować 4% żel agarozowy.
2. Próbki z etapu 5 sekcji Fragment amplified targets oraz etapu 4 sekcji Label fragmented double-stranded DNA inkubować w temperaturze 65°C przez 2 min.
3. Dodać 10 µl streptawidyny (1 mg/ml) i inkubować próbki w temperaturze pokojowej przez 5 min.
4. Próbki z etapu 3 poddać elektroforezie na 4% żelu agarozowym (Gel-shift analysis, etap 1), aby sprawdzić przesunięcie migracji produktów znakowania.

Hybrydyzacja macierzy i płukanie macierzy

Wykonano w Centrum Genomiki Uniwersytetu Kalifornijskiego w Riverside.

Analiza macierzy

Wykonano za pomocą analizy komputerowej.

SKŁADY BUFORÓW:

Roztwór blokujący: PBS + 0,5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA).

Bufor lizujący: 50 mM HEPES-KOH, pH 7.5
140 mM NaCl
1 mM EDTA
1% Triton X-100
0.1% SDS
1mM PMSF
Końcowe pH 7.5

IP1: Bufor lizujący + 500 mM NaCl

IP2: 10 mM Tris-HCl
250 mM LiCl
1 mM EDTA
0,5% NP-40
0,5% dioksycholanu sodu
Końcowe pH 8,0

Bufor TE: 10 mM Tris, pH 7.4
1 mM EDTA

Końcowe pH 8.0
Bufor elucyjny: bufor TE + 1% SDS.

Dyskusja

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) stanowi cenną technikę analizy procesów opartych na chromatynie podczas różnicowania komórkowego. Warunkami sukcesu tej metody są wysokiej jakości przeciwciała oraz dostępność chromatyny z komórek lub tkanek kontrolnych, które nie posiadają badanego antygenu. Połączenie metody ChIP z technologią mikromacierzy DNA pozwala na uzyskanie ogromnych ilości informacji. Walidacja wyników ChIP zależy od dostępności odpowiednich systemów testowych, które mogą powiązać dynamiczne asocjacje białek, modyfikacje białek i/lub RNA z przebiegiem procesów biologicznych podczas rozwoju komórek.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Proteinaza K	Odczynnik	Roche Group	#EO0491
RNaza A	Odczynnik	Fermentas	#EN0531
formaldehyd 37%	Odczynnik	EMD Millipore	FX040-13
Chloroform	Odczynnik	EMD Millipore	3150
Etanol	Odczynnik	Goldshield
fenol:chloroform:alkohol izoamylowy	Odczynnik	Invitrogen	15593-031
SA, frakcja V	Odczynnik	EMD Millipore	2930
Fosforanowy bufor solny Dubecco’s	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	14190
HEPES	Odczynnik	EMD Millipore	5330
Chlorek sodu	Odczynnik	Fisher Scientific	S271-10
EDTA	Odczynnik	EMD Millipore	4050
Triton X-100	Odczynnik	EMD Millipore	9410
Dodecylosiarczan sodu	Odczynnik	JT Baker	4095-02
Chlorek litu	Odczynnik	EMD Millipore	5910
Tris-HCl	Odczynnik	EMD Millipore	9230
NP-40	Odczynnik	Calbiochem	492015
Kwas deoksycholowy, sól sodowa	Odczynnik	Fisher Scientific	BP349-100
Octan amonu	Odczynnik	Applichem	631-61-8
Glicyna	Odczynnik	EMD Millipore	4840
Glicyna	Odczynnik	EMD Millipore	4840
dynalbeads, białko A	Odczynnik	Invitrogen	100.02D
dynalbeads, białko G	Odczynnik	Invitrogen	100.04D
Mikroprobówki Low Retention 1,5 ml, Xtreme	Inne	Phenix Research Products	MAX-815S
Phase Lock Gel Light, 2,0 ml	Odczynnik	Eppendorf	955154037