Pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia z noworodków gryzoni

Podsumowanie

Pierwotne dysocjowane hodowle komórek dopaminergicznych śródmózgowia umożliwiają badanie charakterystyki presynaptycznej neuronów dopaminergicznych. Mogą one być wykorzystywane do monitorowania w czasie rzeczywistym kinetyki uwalniania dopaminy oraz poziomów białek/mRNA regulatorów egzocytozy dopaminy. W niniejszym materiale przedstawiamy sposób przygotowania tych hodowli z noworodków gryzoni.

Streszczenie

Zdolność do tworzenia pierwotnych kultur komórkowych neuronów dopaminergicznych umożliwia badanie charakterystyki presynaptycznej tych neuronów w izolacji od sygnałów systemowych pochodzących z innych obszarów mózgu. W naszym laboratorium wykorzystujemy te neurony do oceny kinetyki uwalniania dopaminy za pomocą amperometrii z wykorzystaniem mikroelektrod z włókna węglowego, a także do badania poziomu ekspresji genów i białek związanych z dopaminą przy użyciu ilościowej PCR oraz immunocytochemii. W tym filmie pokazujemy, w jaki sposób generujemy te kultury z noworodków gryzoni.

Proces ten obejmuje kilka etapów, w tym wysiew astrocytów glejowych kory, kondycjonowanie pożywek do hodowli komórek neuronalnych przez podłoże glejowe, sekcję śródmózgowia noworodków, trawienie, ekstrakcję i wysiew neuronów dopaminergicznych oraz dodanie czynników neurotroficznych w celu zapewnienia przeżywalności komórek.

Zastosowania odpowiednie dla takiego preparatu obejmują elektrofizjologię, immunocytochemię, ilościowy PCR, mikroskopię wideo (tj. obrazowanie fuzji pęcherzyków z błoną plazmatyczną w czasie rzeczywistym), testy żywotności komórek oraz inne badania toksykologiczne.

Protokół

Przygotowania poprzedzające hodowlę

Uwaga: ** Komórki glejowe muszą zostać wysiane z odpowiednim wyprzedzeniem, aby miały czas na proliferację i pokrycie dna   naczyń. W przypadku myszy o nietypowym lub eksperymentalnym tle genetycznym należy upewnić się, że kultury glejowe i neuronalne są zgodne pod względem genotypu.

Uwaga: ** na 1-7 dni przed sekcją przygotować świeże podłoże neuronalne i wymienić podłoże glialne w naczyniach na 2ml.

Uwaga: ** W dniu poprzedzającym sekcję następujące elementy muszą zostać pozostawione pod światłem UV na całą noc:

• 4 płytki do sekcji
• 2 probówki do dysocjacji z mikromagnetycznym mieszadełkiem
• 2 nakrętki do probówek (z 2 małymi otworami wykonanymi w górnej części)
• Rozłożone pierścienie do szkiełek (i pokryte 70% EtOH) - zostawić również otwarte pudełko
• PRZYNAJMNIEJ 2 pełne pudełka żółtych końcówek do pipet (10-200μl)
• 1 pudełko niebieskich końcówek do pipet (100-1000μl)

Dzień hodowli

Uwaga: * NALEŻY PAMIĘTAĆ, ABY NIE DOTYKAĆ ŻADNYCH PRZEDMIOTÓW, KTÓRE ZOSTAŁY WYEKSPONOWANE NA PROMIENIE UV PRZEZ NOC!

Utrzymanie sterylnego środowiska pod wyciągiem jest bardzo ważne.

1) Przygotowanie:

Uwaga: ** Odstaw wszystkie zamrożone składniki w celu przygotowania roztworu papainy.

1. Oczyścić pęsetę 70% EtOH. Przykryć każdy koniec sterylnym żółtym końcem do pipety. Użyć do umieszczenia sterylnych pierścieni do szkiełek w ich pudełku.
2. Płyta grzewcza:
   1. Umieścić mini-mieszadło magnetyczne/płytę grzewczą pod dygestorium wraz z zlewkiem 1000ml wypełnionym do 500-600ml dH₂O oraz dużym mieszadełkiem magnetycznym.
   2. Umieścić dysk styropianowy w zlewku tuż nad poziomem wody.
   3. Wsunąć termometr w mały otwór w dysku styropianowym. Pokrętło grzania powinno być ustawione nieco powyżej 2 (dla temperatury 34°C), a pokrętło mieszania na ok. 5-6.
3. PBS:
   1. Przygotować sterylny PBS i napełnić 15 sterylnych probówek 15ml ilością 4-6 ml (należy zachować sterylność
      techniki).
   2. Umieścić probówki i butelkę z roztworem zapasowym na lodzie obok dygestorium.
4. Karbogen:
   1. Przełamać na pół pipetę seryjną 5ml i przełożyć ją przez gumowy korek tak, aby końcówka pipety wystawała z szerokiej strony korka.
   2. Umieścić korek w kolbie 500ml z 400-500ml dH₂O (przełamany koniec pipety powinien znajdować się W dH₂O).
   3. Podłączyć rurkę do bocznego otworu kolby.
   4. Odciąć końcówkę żółtej pipety i połączyć ją z końcem rurki (ciętą stroną na zewnątrz).
      
      Podłączyć butlę z karbogenem do końcówki pipety seryjnej 5ml.
      
      
5. Przygotować roztwór papainy:
   1. * Stosować rygorystyczną technikę sterylną.
   2. Wymieszać w sterylnej probówce 50ml.
6. Przefiltrować roztwór papainy do fiolki do dysocjacji:
   1. Użyć jednostki filtracyjnej Steriflip i przenieść do fiolki do dysocjacji za pomocą pipety seryjnej 25ml (LUB umieścić nowy filtr strzykawkowy 0.2μm na końcówce strzykawki tłokowej 20ml,
      wyjąć tłok i użyć pipety seryjnej (25mL), aby przenieść cały roztwór papainy do strzykawki.
   2. Przefiltrować do fiolki do dysocjacji).
   3. Zamknąć fiolkę korkiem, włożyć sterylną strzykawkę przez otwór w korku i przymocować sterylny filtr strzykawkowy 0.2μm do podstawy strzykawki.
   4. Podłączyć karbogen do filtra i zabezpieczyć Parafilmem. Umieścić fiolkę w uchwycie/dysku styropianowym.
      
      *Mikromieszadło magnetyczne musi być w ruchu.
      *Gaz MUSI przedostawać się do fiolki.
      *Temperatura MUSI ustabilizować się na poziomie 34°C.
      
      
7. Przygotowanie do sekcji:
   1. Przenieść mikroskop sekcyjny pod dygestorium.
   2. Rozłożyć wszystkie instrumenty sekcyjne na folii aluminiowej, spryskać 70% EtOH, odlać nadmiar i pozostawić pod dygestorium do wyschnięcia.
8. Przygotować podłoże dla neuronów:
   1. Pozostawić 30ml świeżego podłoża dla neuronów w inkubatorze.
9. Przygotować 1 duży kwadrat folii aluminiowej i 12 mniejszych kwadratów. Położyć nożyczki do dekapitacji wraz z folią aluminiową. Napełnić małe pudełko styropianowe wodą z lodem i pozostawić wszystko poza dygestorium.
10. Przygotować anestezyjkę (0.075ml ketaminy i 0.075ml ksylazyny).
11. Przygotować co najmniej 12 młodych szczurów/myszy (P0-P2) na 100 płytek. W przypadku myszy należy upewnić się, że genotyp jest zgodny dla całego miotu. Jeśli genotyp jest nieznany, należy wysiać komórki z każdego osobnika na osobnej płytce, prowadzić dokładną dokumentację numerów myszy i dopasować je do naczyń z kulturami komórkowymi oraz upewnić się, że tło genetyczne podłoża glejowego jest jednolite we wszystkich kulturach komórkowych.

2) Disekcja

1. Zanurz pierwsze zwierzę w narkozie poprzez wstrzyknięcie domięśniowe. Gdy zwierzę wykaże sedację i nie będzie reagować na test odruchu cofania ogona, umieść je na lodzie przez 30 sekund (do wystąpienia hipotermii). Przepłucz jeden mały kwadrat z folii aluminiowej, nożyce do dekapitacji oraz głowę 70% EtOH.
2. Wykonaj dekapitację, pozwalając głowie upaść na kwadrat z folii aluminiowej, a następnie przenieś ją pod wyciąg. Delikatnie wyjmij mózg do probówki 15 ml z lodowatym PBS. Umieść probówkę z powrotem na lodzie podczas wyjmowania kolejnego mózgu.
3. Powtarzaj te pierwsze kroki, aż na lodzie znajdą się 3 mózgi. Przelej wszystkie 3 mózgi wraz z PBS do pierwszej szalki do sekcji pod mikroskopem. Wyetrakuj odpowiednią część mózgu (VTA) i za pomocą pipety transferowej umieść segmenty w roztworze papainy. Uruchom stoper w momencie umieszczenia pierwszych segmentów w roztworze.
4. Powtarzaj poprzednie 3 kroki, aż wszystkie mózgi będą trawione w papainie. Średni czas trawienia powinien wynosić 2 godziny. Pierwsze segmenty będą znajdować się w roztworze przez około 1 godzinę w momencie dodania ostatnich.
   
   Postaraj się wyrównać ten odstęp czasowy.
   
   
5. *W trakcie trawienia:
   1. Upewnij się, że temperatura w kąpieli wynosi 34°C.
   2. Segmenty mogą początkowo przyklejać się do mieszadła magnetycznego, ale z czasem powinny się rozprzestrzenić. Jeśli tak się nie stanie, ostukaj dno fiolki.

3) Tryturacja:

1. Za pomocą pipety transferowej przenieś fragmenty mózgu do sterylnej probówki 15 ml (staraj się unikać nadmiaru roztworu papainy) i PRZEMYJ je 3 razy 2 ml ogrzanej pożywki glialnej z inkubatora. Po wlaniu pożywki glialnej do probówki poczekaj, aż fragmenty opadną, a następnie ostrożnie usuń jak największą ilość roztworu, nie naruszając fragmentów. Wymień pipety, aby uniknąć kontaminacji!
   
   **NIE ZACHOWUJ usuniętego roztworu.
   
   
2. Używając nowej pipety transferowej, rozpocznij triturację w 2 ml pożywki glialnej. Trituruj 25 razy (unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza) i pozostaw probówkę na 3 minuty, aż niezdysocjowane fragmenty opadną. Użyj pipety transferowej, aby usunąć i ZACHOWAĆ jak największą ilość roztworu, nie naruszając fragmentów na dnie. Przenieś supernatant do nowej (sterylnej) probówki 15 ml.
3. Powtórz poprzedni krok, używając pipety 1000 µl i pipety 200 µl, aż do całkowitej dysocjacji.
4. Trituruj 10 razy pipetą transferową lub do momentu całkowitego resuspensowania komórek w roztworze.

4) Wysiewanie komórek

1. Używając sterylnego żółtego końcówki do pipety do osłonięcia każdego z końców pęsety, ostrożnie umieść pierścień do preparatów tak, aby był jak najlepiej wycentrowany względem szkła w każdym naczyniu.
2. Nanieś 10μl zawiesiny komórkowej na komorę licznikową i wykonaj odczyt. (Pomiń skupiska zanieczyszczeń).
3. Pomnóż liczbę komórek przez 10. Otrzymana wartość to liczba komórek/μl. Podziel 1 000 000-1 500 000 (lub pożądaną gęstość) przez tę liczbę. Wynik określa liczbę μl, którą należy dodać do każdego naczynia.
4. Użyj końcówki pipety, aby przesunąć pierścienie nad centralną część każdego naczynia, dodając odpowiednią ilość μl/naczynie. Rozmieść komórki ostrożnie i wymieniaj końcówki dla KAŻDEGO naczynia.
5. Dodaj 100μl (rozcieńczonego) roztworu GDNF do wnętrza pierścienia w każdym naczyniu.
6. W tym momencie umieść tacki w inkubatorze i przenieś pożywkę neuronalną do pomieszczenia chłodniczego.
7. Pozostaw komórki na noc w celu ich osadzenia.
8. Następnego dnia: usuń pierścienie (używając nowych sterylnych końcówek do pipety do osłonięcia końców pęsety dla KAŻDEGO naczynia)
   

5) Hamowanie mitozy: NASTĘPNEGO DNIA

1. Rozcieńcz alikwoty FDU zetstawu 1000X w stosunku 1:10, dodając 200μl zapasu FDU do 1,8 ml sterylnego MEM.
2. Dodaj 20μl rozcieńczonego roztworu FDU do zewnętrznego pierścienia każdej płytki. Często zmieniaj końcówki pipet. Przykryj i przenieś z powrotem do inkubatora.
   
   *Przez kolejne 7-10 dni ogranicz manipulacje przy płytkach do minimum. Sprawdzaj, czy płytki nie są zainfekowane i usuwaj je przy pierwszych oznakach infekcji. Hodowle są gotowe do testów w ciągu 3 tygodni.

 

MEDIA/ROZTWORZY

Pożywka neuronalna

(na 200mL)

**Najlepiej, jeśli zostanie poddane kondycjonowaniu na glii z kolb przez noc przed użyciem do przemyć/tryturacji

Składnik	Ilość	Uwagi
BSA 5%	0.5 g	Frakcja V
MEM (ciecz)	94.0 ml	Sigma
DMEM (ciecz)	80.0 ml	Sigma
F-12 (ciecz)	20.0 ml	Sigma
Glukoza 45% (ciecz)	1.50 ml	Roztwór Sigma
Glutamina 200mM	0.5 ml	Aliquot roztworu Sigma
Diporzio Conc.	2.0 ml	Roztwór Sigma
Katalaza (ciecz)	0.1 ml
Kwas kynurenowy 0.5M	200μl	W 1N NaOH
HCL 5N	50 μl

1. Połączyć składniki (BSA dodać na końcu) w plastikowej butelce o pojemności 250ml.
2. Przefiltrować, opisać i przechowywać w lodówce.

 

Kwas kynurenowy
(FW = 189.2)
0,5M = 94,6mg/ml
Przygotuj 8ml roztworu zapasu: 756,8mgKA/8ml 1N NaOH i pipetuj do STERYLNYCH alikwotów po 200μl

Pożywka DiPorzio

A) Roztwory stokowe DiPorzio:

POTRZEBY			Łączenie			Alikwotowanie
Dodatek	Rozpuszczalnik	Probówka	Ilość	ml	ml/probówkę	Stężenie	Ilość	Liczba alikwotów
Insulina	20mM HCL (1)	plastikowa	butelka 250mg	10	1	25mg/ml	25mg	10
Transferryna	Hank’s		butelka 500mg	5	1	100mg/ml	100mg	5
SOD	Hank’s		butelka 70mg	14	1	5mg/ml	5mg	14
Putrescyna	Hank’s		50mg	3	0.12	20mg/ml	2.4mg	21
Na2SeO3	Hank’s		0.104mg	10	0.5	10μg/ml	5.2μg	20
T3	10mM NaOH		2mg	10	0.1	0.20mg/ml	0mg	100
Progesteron	100% EtOH	Szklana	12.5mg	10	0.05	1.25mg/ml	Użyć pipety
Kortyzol	100% EtOH	Szklana	20mg	10	0.02	2.00mg/ ml	Użyć pipety

1. 20mM HCl = 41,5μl stężonego HCl/25ml.
2. Przygotować roztwór zapasowy 1mg/ml i dodać 104μl do 10ml.

B) Podłoże DiPorzio (stock):

Dodatek	Ilość (ml)	Ilość (ml) X2	Stężenie końcowe μg/ml	Molarne stężenie końcowe
Progesteron	0.05	0.1	0.06	200nM
Kortyzol	0.02	0.04	0.04	125nM
Hank’s BSS	6.21	12.42
Insulina	1	2	25
Na2SeO3	0.5	1	0.01	30nM
T3	0.1	0.2	0.02	30nM
SOD	1	2	5
Putrescyna	0.12	0.24	2.4	15nM
Transferryna	1	2	100

1. Użyj sterylnej probówki polipropylenowej o pojemności 15 ml, aby dodać progesteron i kortyzol. Użyj pipety aspiracyjnej i próżni, aby przyspieszyć odparowanie EtOH: (użyj stripetty 5 ml przełamanej na pół i wprowadź ją do połowy probówki, uważając, aby nie odessać płynnego EtOH. Stabilnie zamocuj pipetę za pomocą chusteczek Kimwipes, a następnie obniż końcówkę do poziomu 500 μl zaznaczonego na ściance probówki).
2. Dodaj kolejne alykwoaty w kolejności, w jakiej pojawiają się w powyższej tabeli.
3. Po dodaniu insuliny, która powoduje zmętnienie roztworu, dodaj 20 μl 1N NaOH, aby zneutralizować pH. Roztwór powinien zmienić kolor z żółtego na różowy i natychmiast się przejaśnić. RÓWNIEŻ po dodaniu transferryny natychmiast dodaj 20 μl 1N NaOH, aby zneutralizować pH i zapobiec tworzeniu się osadów.
4. Pobierz 10 ml pipetą serologiczną i podziel na 5 alykwotów (jedna partia).
5. Przechowywać w temperaturze -20°C.
6. Można przygotować 2 partie jednocześnie.

 

Pożywka do dysocjacji

A. Papaina (na 1 fiolkę):

**Przygotować w dniu wysiewania, bezpośrednio przed sekcją. 

Składnik	Ilość	(Uwagi) Stężenie końcowe
Woda z cysteiną	7.8mL	1mM cysteiny
Papaina	Zmienna (*190μl dla butelki 44.0mg/ml)	20 jednostek/ml (łącznie 400 jednostek dla 20ml roztworu)
Koncentrat H&B	2mL
Carbogen	95% O2 + 5% CO2
HCl 5N	10μl
0.5% Czerwony fenol	20μl	0.001%
Kynurenian 0.5M	10μl	(W 1N NaOH) 0.5mM

1. NAJPIERW dodaj papainę do wody z cysteiną.
2. Dodaj roztwór H&B, kynurenat, HCl oraz czerwień fenolową.
3. Przefiltruj do fiolki do dysocjacji (zgodnie z instrukcjami przygotowania) i podłącz do systemu carbogen.
   

B. Koncentrat H&B (100 ml 5X):

Składniki	Masa cząsteczkowa	Proszek/50 ml H2O2O	Stęż. (M)	Połączyć (ml)	Stęż. końc. (mM)
NaCl	58.44	11,699 g	4	14.5	116
KCl	74.56	3,728 g	1	2.7	5.4
NaHCO₃3	84.01	4,2 g	1	13	26
NaH2PO4Możliwość tworzenia pierwotnych kultur komórkowych neuronów dopaminergicznych pozwala na badanie charakterystyki presynaptycznej tych neuronów w izolacji od systemowych sygnałów z innych obszarów mózgu. W naszym laboratorium wykorzystujemy te neurony do oceny kinetyki uwalniania dopaminy za pomocą amperometrii z użyciem elektrod z włókna węglowego, a także do analizy poziomów ekspresji genów i białek związanych z dopaminą przy użyciu ilościowej PCR oraz immunocytochemii. W tym filmie pokazujemy, jak generujemy te kultury z noworodków gryzoni. Proces ten obejmuje kilka etapów, w tym wysiew kortykalnych astrocytów glejowych, kondycjonowanie pożywek do kultur neuronowych przez podłoże glejowe, wypreparowanie śródmózgowia noworodków, trawienie, ekstrakcję i wysiew neuronów dopaminergicznych oraz dodanie czynników neurotroficznych w celu zapewnienia przeżywalności komórek. Zastosowania odpowiednie dla takiej preparatyki obejmują elektrofizjologię, immunocytochemię, ilościową PCR, mikroskopię wideo (np. w celu obserwacji fuzji pęcherzyków z błoną plazmatyczną w czasie rzeczywistym), testy żywotności komórek oraz inne badania toksykologiczne.2O	137.99	6,90 g	1	1	2
MgSO₄4	120.38	6,019 g	1	0.5	1
EDTA (ED2-SS)	292	Sigma 5% (przygotować (stężenie zapasu 5 g/100 ml)	0.134	0.3722	0.5
Glukoza	180	Sigma 45%	2.5	5	25
TC H2O				62.93

1. Połączyć odpowiednie ilości z roztworów zapasowych.
2. Podzielić na aliquoty po 4ml.
3. Dodać aliquot do wody z cysteiną po dodaniu papainy.
   

C. Woda z cysteiną (157,5 ml 1X):

Składniki	Masa mol.	Komponenty Proszek (mg)	H2O (ml)	Stężenie zapasu (mM)	Objętość końcowa (ml)	Stężenie końcowe (mM)
CaCl2	147.2	736	10	500	0.6	1.9mM
Cysteina	121.7	(1.5)	24	20mM (0.02M)	10	1.27mM (0.88)
Woda TC					146.9

1. Przygotować i przechowywać roztwór stokowy 0.5M CaCl2 w temperaturze 4°C
2. Przygotować jednorazowy roztwór cysteiny i połączyć go z pozostałymi składnikami
3. Podzielić na 10 aliquotów po 15.75 ml i przechowywać w temperaturze 4°C
   

Przygotowanie GDNF

1. Przygotowanie alikwotów:
   1. Rozpuścić sterylną, liofilizowaną pelletkę 5μg GDNF w 2,4mL sterylnej wody dejonizowanej. Stężenie tego roztworu GDNF = 2,08μg/mL.
   2. Rozdzielić roztwór GDNF o stężeniu 2,08μg/mL na alikwoty po 76,9μl w sterylnych probówkach kriogenicznych. Oznacza to 160ng na probówkę.
   3. Przechowywać w temperaturze -20°C.
2. Dodanie do kultur:
   1. Rozmrozić 1 alikwot na każde 8 naczyń.
   2. Rozcieńczyć alikwot, dodając 723,1μl pożywki dla neuronów na alikwot. Pozwoli to otrzymać roztwór 160ng/800μl GDNF.
   3. Dodać 100μl tego roztworu do 2mL pożywki w każdym naczyniu, aby uzyskać stężenie końcowe 10ng GDNF na mL.
      

Przygotowanie FDU

Roztwór FDU 1000X (stok):

Składnik	Ilość	(Uwagi) Stęż. końcowe
Urydyna	247 mg	16,5 mg/ml
5-FDU (5-fluorodeoksyurydyna)	100 mg (butelka)	6,7 mg/ml
Woda TC	15 ml

1. Przygotuj nieco ponad 15 ml roztworu urydyny o stężeniu 16,5 mg/ml.
2. Dodaj 15 ml roztworu urydyny do buteleczki zawierającej 100 mg FDU, aby otrzymać roztwór FDU o stężeniu 6,7 mg/ml.
3. Podziel na aliquoty po 200 μl i zamroź w temperaturze -20°C.

Rozcieńczenie do użytku:

1. Zahamuj wzrost komórek nieneuronalnych. Rozcieńcz 1000X roztwór zapasowy w stosunku 1:10, dodając 200μl roztworu zapasowego do 1,8 ml MEM.
2. Dodaj 20μl rozcieńczonego FDU do zewnętrznego pierścienia każdej płytki. Często wymieniaj końcówki pipety. Przykryj i odstaw do inkubatora.

Dyskusja

Opisane tutaj metody umożliwiają precyzyjną analizę cech morfologicznych i neurochemicznych centralnych neuronów dopaminergicznych, które w przeciwnym razie nie byłyby dostępne przy zastosowaniu podejścia systemowego lub in vivo.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały są zawarte w tekście protokołu.