Niniejszy materiał wideo demonstruje sposób utrzymania wzrostu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) w warunkach bez komórek karmących oraz metodę ciągłego pasażowania hESCs w warunkach bez komórek karmących. Przedstawiono również potwierdzenie pluripotencji hESCs hodowanych bez komórek karmących za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Część 2 z 3.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Od MEF do Matrigelu 2: Przesiewanie hESC z MEF na Matrigel
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W niniejszym filmie zaprezentowano sposób hodowli ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) na warstwie komórek karmiających z embrionalnych fibroblastów mysich (MEF) oraz sposób pasażowania hESC z płytek z MEF na płytki z Matrigelem bez zastosowania komórek karmiających.
Protokół
codzienna pielęgnacja hodowli hESC
- Pożywkę do hodowli hESC należy wymieniać co 24 h. Z butelki z zapasem pożywki ES przechowywanej w temperaturze 4°C należy odlać potrzebną ilość roztworu (~20ml na płytkę 6-dołkową), przelać go do probówki Falcon 50ml i ogrzać do 37°C w kąpieli wodnej. Po ogrzaniu pożywki należy dodać bFGF przechowywany w temperaturze 4°C do końcowego stężenia 10ng/ml. Zapas bFGF należy natychmiast po użyciu odstawić do temperatury 4°C!
- Z płytek 6-dołkowych należy usunąć całą pożywkę, pozostawiając jedynie ~500µl. Należy delikatnie zamieszać naczynie z hodowlą, aby zawiesić zanieczyszczenia i umożliwić ich usunięcie. Po upewnieniu się, że bFGF w pożywce do hodowli hESC został dokładnie wymieszany, należy dodać 3ml świeżej pożywki do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Następnie płytkę należy umieścić z powrotem w inkubatorze.
Pasażowanie hESC z MEF na Matrigel
Zazwyczaj konfluencyjną płytkę 6-dołkową z hESC na MEF można przesiewać w stosunku od 1:2 do 1:3 na płytki 6-dołkowe z Matrigel, przy czym dołki ponownie stają się konfluencyjne po 4-5 dniach od przesiewania.
- Podczas przesiewania hESC na Matrigel, w celu utrzymania pluripotencji stosuje się pożywkę warunkowaną fibroblastami zarodkowymi myszy (MEF-conditioned media, CM). Pożywkę warunkowaną MEF przygotowuje się z wyprzedzeniem. Pierwszego dnia 1,5×107 naświetlanych promieniami γ MEF wysiewa się do kolby T75. Drugiego dnia MEF płucze się raz 1×PBS (pH 7,4) o temperaturze pokojowej, a następnie do kolby dodaje się 15 ml pożywki ES uzupełnionej o 5 ng/ml bFGF. (UWAGA: MEF można wysiewać do mniejszych lub większych kolb, jednak proporcja między gęstością komórek a objętością pożywki ES powinna pozostać stała). Kolbę inkubuje się w temperaturze 37°C przez kolejne 24 h. Trzeciego dnia zbiera się CM i zastępuje 15 ml świeżej pożywki ES uzupełnionej o 5 ng/ml bFGF. Zebraną CM przechowuje się w temperaturze 4°C. Pożywkę warunkowaną MEF z jednego wysiewu MEF pobiera się przez siedem kolejnych dni, aby uzyskać 15 × 7 = 105 ml. Po siedmiu dniach wszystkie frakcje CM łączy się, filtruje sterylnie, rozdziela na alykwoty i przechowuje w temperaturze -20°C. Pożywkę CM przygotowaną w opisany sposób można przechowywać i stosować przez 1 miesiąc.
- Na dzień przed przesiewaniem hESC alykwoty Matrigelu w probówkach Eppendorf umieszcza się w temperaturze 4°C w celu rozmrożenia przez noc (jedna alykota zawiera 76,2 mg Matrigelu, co jest ilością potrzebną dla jednej płytki 6-dołkowej). W dniu przesiewania jedną fiolkę rozmrożonego Matrigelu dla jednej płytki 6-dołkowej oraz 6 ml zimnej pożywki DMEM/F12 umieszcza się na lodzie. Matrigel przenosi się do pożywki DMEM/F12 i dokładnie miesza. Do każdego dołka płytki 6-dołkowej dodaje się 1 ml roztworu. Płytkę delikatnie potrząsa się, aby rozprowadzić Matrigel po powierzchni, a następnie inkubuje płytkę pokrytą Matrigelem w temperaturze pokojowej przez co najmniej 1 h przed przesiewaniem hESC.
- hESC na MEF płucze się raz 1×PBS (pH 7,4). Następnie do każdego dołka płytki 6-dołkowej dodaje się 1 ml ciepłej kolagenazy IV (1 mg/ml), a płytkę inkubuje w temperaturze 37°C przez 5-10 min.
- Do każdego dołka dodaje się 1 ml pożywki ES bez bFGF. Za pomocą pipety o objętości 1 ml zmywa się komórki macierzyste z płytki. Całą pożywkę zawierającą agregaty hESC i martwe MEF przenosi się do probówki Falcon 50 ml. Pozostawia się duże agregaty komórek na 5-10 min, aby agregaty hESC utworzyły pellet na dnie probówki, podczas gdy MEF pozostaną w zawiesinie w nadosadzie. Nadosad usuwa się, a pellet hESC płucze poprzez resuspensję w pożywce ES pozbawionej bFGF, a następnie wiruje w temperaturze pokojowej przy 200g przez 5 min.
- Aby wysiać komórki macierzyste na płytki z Matrigelem, najpierw płucze się płytki z Matrigelem pożywką DMEM/F12 o temperaturze pokojowej (1 ml na dołek), a następnie dodaje 2,5 ml CM uzupełnionej o 10 ng/ml bFGF na dołek. Pellet resuspenduje się w odpowiedniej objętości CM uzupełnionej o 10 ng/ml bFGF, pipetując zawiesinę komórkową kilkakrotnie w górę i w dół, aż agregaty staną się jednolite i małe. Zawiesinę rozdziela na alykwoty po 0,5 ml na dołek na płytce z Matrigelem. Należy zauważyć, że gęstość kolonii na Matrigelu jest wyższa niż gęstość kolonii przy zwykłym przesiewaniu na MEF. Płytkę umieszcza się w inkubatorze do hodowli tkanek w temperaturze 37°C.
- W celu utrzymania hESC na Matrigelu pożywkę CM uzupełnioną o 10 ng/ml bFGF wymienia się co 24 h przez okres do 4-5 dni.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
W tym filmie pokazano, jak przenosić hESC z płytek z MEF na płytki z Matrigelem bez komórek karmiących. Należy zauważyć, że gęstość kolonii na Matrigelu jest wyższa niż gęstość kolonii uzyskiwana podczas zwykłego pasażowania na MEF. Aby potwierdzić utrzymanie hESC w stanie niedróżnicowanym w warunkach hodowli bez komórek karmiących, konieczne jest przeprowadzenie barwienia immunofluorescencyjnego i mikroskopii lub cytometrii przepływowej w celu wykrycia markerów pluripotencji hESC, takich jak Oct-4 i SSEA-4.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Badania nad ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi w laboratorium Teitella są wspierane przez grant zalążkowy California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) RS1-00313. Dziękujemy członkom Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research na UCLA, w szczególności dr Amander Clark, dr Jerome Zack oraz członkom UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility za wsparcie naszych badań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| zamiennik surowicy Knockout (KSR) | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Niezbędne aminokwasy nieessencjalne | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| płytkowa krowia surowica (FBS) | Odczynnik | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamina | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Odczynnik | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Odczynnik | R&R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Kollagenaza IV | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Odczynnik | Technologie komórek macierzystych | 17105-041 | |
| Penicylina / Streptomycyna | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Żelatyna | Odczynnik | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Odczynnik | BD Biosciences | 354277 | |
| przeciwciało anty-Oct-4 | Odczynnik | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anty-h/mSSEA-4 Phyc–rytryna sprzężona z mysim IgG3 | Odczynnik | R&D Systems | FAB1435P | |
| przeciwciało przeciwko królikiemu IgG sprzężone z FITC | Odczynnik | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
Bibliografia
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
