W niniejszym filmie zaprezentowano sposób utrzymania wzrostu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESCs) w warunkach bez komórek karmionek oraz sposób ciągłego pasażowania hESCs w warunkach bez komórek karmionek. Przedstawiono również potwierdzenie pluripotencji hESCs hodowanych bez komórek karmionek za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej. Część 3 z 3.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Od MEF do Matrigelu 3: Pasażowanie hESC z Matrigelu na Matrigel
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
W niniejszym filmie zaprezentowano sposób utrzymania wzrostu ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC) w warunkach bez udziału komórek karmicieli oraz metodę ich ciągłego pasażowania w takich warunkach. Przedstawiono również potwierdzenie pluripotencji hESC hodowanych bez komórek karmicieli przy użyciu mikroskopii immunofluorescencyjnej.
Protokół
Przesadzanie hESC z Matrigelu na Matrigel
Zazwyczaj konfluencyjną płytkę 6-dołkową z hESC na Matrigelu można przesadzić w stosunku od 1:3 do 1:5 na inną płytkę z Matrigelem, a dołki ponownie stają się konfluencyjne 4-5 dni po przesadzeniu.
- Przed pasażowaniem przygotowuje się płytki z CM oraz Matrigel zgodnie z powyższym opisem.
- W dniu pasażowania każdą studnię przeznaczoną do podziału przemywa się 1×PBS, pH7.4, następnie do każdej studni dodaje się 1ml Dispase o stężeniu 1mg/ml (roztwór stokowy 5mg/ml rozcieńczony w medium DMEM/F12) i inkubuje w temperaturze 37°C przez 3 min.
- Każdą studnię przemywa się trzykrotnie 1×PBS, pH7.4, dodaje 1ml medium ES bez bFGF, a następnie za pomocą skrobaka do komórek zdejmuje kolonie z dna studni. Zawiesinę hESCs zbiera się do probówki typu Falcon o pojemności 50ml i pelletuje poprzez wirowanie przy 200g przez 5 min w temperaturze pokojowej.
- Aby ponownie wysiać hESCs na płytkach z Matrigel, najpierw przemywa się płytki z Matrigel medium DMEM/F12 i dodaje do każdej studni 2,5ml CM uzupełnionego o 10ng/ml bFGF. Pellet hESC resuspenduje się w odpowiedniej objętości CM uzupełnionego o 10ng/ml bFGF, pipetując zawiesinę komórkową trzy razy w górę i w dół. (UWAGA: Gdy hESCs do pasażowania pochodzą z płytek z Matrigel, agregaty są bardzo łatwe do rozbicia; zatem trzy cykle pipetowania są wystarczające, a nadmierne pipetowanie może doprowadzić do zbyt silnej dysocjacji kolonii i powstania pojedynczych komórek). Do każdej studni 6-dołkowej płytki z Matrigel przenosi się po 0,5 ml zawiesiny agregatów hESC, aby uzyskać końcową objętość 3ml na studnię. Płytkę umieszcza się w inkubatorze w temperaturze 37°C.
Wykrywanie markerów pluripotencji za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej
Mikroskopia immunofluorescencyjna jest wykorzystywana do badania ekspresji markerów pluripotencji hESC, Oct-4 i SSEA-4, podczas hodowli.
- Odessać pożywkę z jednej studzienki i przemyć 1×PBS, pH 7.4. Dodać do studzienki 2ml 3,7% formaldehydu i utrwalać przez 10 min.
- Przepłukać 1xPBS, pH 7.4, dodać do studzienki 2ml metanolu i inkubować w temperaturze -20°C przez 2 min.
- Przepłukać 1xPBS, pH 7.4 i blokować 1ml 0,2% albuminy surowiczej bydlęcej (BSA) przez 5 min.
- Dodać 1ml przeciwciała Oct-4 lub anty-h/mSSEA-4 (rozcieńczenie 1:200 w 0,2% BSA) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h lub w 4°C przez noc. (UWAGA: w przypadku barwienia SSEA-4 należy przejść bezpośrednio do kroku 6)
- Przepłukać trzykrotnie 1xPBS, pH 7.4, dodać królika IgG sprzężonego z FITC (rozcieńczenie 1:500 w 0,2% BSA) i inkubować w temperaturze pokojowej przez 1 h.
- Przepłukać 3 razy 1xPBS, pH 7.4 i nanieść kroplę medium montażowego (może zawierać DAPI, jeśli wymagana jest wizualizacja jąder) na środek studzienki. Położyć szkiełko nakrywkę na komórkach, uszczelnić lakierem do paznokci i ocenić za pomocą mikroskopii immunofluorescencyjnej.
Protokoły dotyczące ludzkich embrionalnych komórek macierzystych
Pożywka ES (pożywka dla embrionalnych komórek macierzystych):
DMEM/F12 - 400ml
zamiennik surowicy Knockout Serum Replacer - 100ml
nieessentialne aminokwasy - 5ml
roztwór 200mM GlutaMax / BME - 5ml
penicylina / streptomycyna - 5ml
Dokładnie wymieszać i przechowywać końcową pożywkę do hodowli hESC w butelkach o pojemności 500ml w temperaturze 4°C. Przechowywać maksymalnie przez dwa tygodnie.
Pożywka do hodowli MEF:
DMEM - 1000ml
FBS - 100ml
Niezbędne aminokwasy (NEAA) - 10ml
Glutamina - 10ml
Penicylina / Streptomycyna - 10ml
Wymieszać dokładnie i przechowywać gotowe MEF Culture Media w temperaturze 4°C.
Roztwór 200mM Glutamax / BME:
Glutamax – 100ml
β-merkaptoetanol (roztwór zapasowy o stężeniu 14,3M) – 140 µ1
Dokładnie wymieszać oba roztwory, a następnie podzielić na alikwoty po 10ml. Przechowywać alikwoty w temperaturze -20°C.
Roztwór bFGF (stężenie końcowe roztworu zapasowego: 10 micrograms/ml):
bFGF (FGF2) – 50 µg
0,1% BSA w 1xPBS, pH 7,4 – 5ml
Rozpuścić 50 µg bFGF w 5 ml 0,1% BSA, aby przygotować roztwór zapasu o stężeniu 10 µg/ml. Podzielić na aalikwoty po 500 µl. Przechowywać w temperaturze -80°C.
Roztwór kolagenazy IV (1mg/ml):
Kolagenaza IV - 50mg
Pożywka DMEM/F12 - 50ml
Wsyp proszek kolagenazy IV do probówki typu Falcon o pojemności 50 ml. W komorze z laminarnym przepływem powietrza dodaj 50 ml sterylnego medium DMEM/F12. Mieszaninę wstrząsaj w wibratorze Vortex przez < 1 min., aby upewnić się, że proszek został rozpuszczony. W komorze z laminarnym przepływem powietrza przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 µm do nowej sterylnej probówki typu Falcon o pojemności 50 ml. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4°C przez maksymalnie 2 tygodnie.
Roztwór dispazy (1mg/ml):
Dyspaza 5mg/ml - 2ml
Pożywka DMEM/F12 - 8ml
Rozdziel handlowy roztwór dyspazy o stężeniu 5mg/ml na alikwoty i przechowuj w temperaturze -20°C. Rozcieńcz dyspazę do stężenia 1mg/ml, używając pożywki DMEM/F12. Roztwór ten można przechowywać przez 1 tydzień w temperaturze 4°C.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Ta seria 3 filmów demonstruje, jak hodować ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESCs) na komórkach karmicielskich z zarodkowych fibroblastów myszy (MEF) (film 1), jak przenosić je na płytki z Matrigel bez komórek karmicielskich (film 2) oraz jak utrzymywać hESCs poprzez pasażowanie w warunkach bez komórek karmicielskich na Matrigel (film 3). Liczne wcześniejsze badania wykazały, że utrzymanie żywotnych, niezdiferencjowanych hESCs wymaga hodowli na inaktywowanych komórkach karmicielskich MEF. Jednak do wielu eksperym...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Badania nad ludzkimi embrionalnymi komórkami macierzystymi w laboratorium Teitella są wspierane przez grant zasiewowy RS1-00313 z California Institute for Regenerative Medicine (CIRM). Dziękujemy członkom Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research na UCLA, w szczególności dr Amander Clark, dr Jerome Zack oraz członkom UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility za wsparcie naszych badań.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Zamiennik surowicy KnockOut Serum Replacer (KSR) | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Aminokwasy nieesencjalne | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS (płytki surowica bydlęca) | Odczynnik | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamina | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Odczynnik | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Odczynnik | R&R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Kolagenaza IV | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Odczynnik | Technologie komórek macierzystych | 17105-041 | |
| Penicylina / Streptomycyna | Odczynnik | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Żelatyna | Odczynnik | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Odczynnik | BD Biosciences | 354277 | |
| przeciwciało przeciwko Oct-4 | Odczynnik | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| przeciwciało anty-h/mSSEA-4 Phyc–mysi IgG3 sprzężony z rytryną | Odczynnik | R&D Systems | FAB1435P | |
| anty-IgG przeciwko królikowi sprzężone z FITC | Odczynnik | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
Bibliografia
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells Nature Biotechnology 19. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
