Niniejszy film demonstruje, w jaki sposób wykorzystać dwa stymulanty neuronalne, aldikarb i pentylenotetrazol (PTZ), w sposób komplementarny do badania funkcji synaptycznych u nicienia C. elegans. To komplementarne podejście może być również wykorzystane do wyjaśnienia ewolucyjnie konserwatywnych mechanizmów modulujących synchronizację neuronalną i ma znaczenie w badaniach nad epilepsją oraz napadami drgawkowymi.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Paradygmaty farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej u C. elegans
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Nicień, Caenorhabditis elegans, stał się dogodnym modelem do badania neurotransmisji. C. elegans jest wyjątkowy wśród modeli zwierzęcych, ponieważ anatomia i połączenia jego układu nerwowego zostały określone na podstawie mikrografii elektronowych i doprecyzowane za pomocą testów farmakologicznych. W tym filmie opisujemy, w jaki sposób dwa komplementarne stymulanty neuronalne – inhibitor acetylocholinoesterazy o nazwie aldikarb oraz antagonista receptora kwasu gamma-aminomasłowego (GABA) o nazwie pentylenotetrazol (PTZ) – mogą być wykorzystane do specyficznej charakterystyki sygnalizacji w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJs) u C. elegans oraz do ułatwienia zrozumienia antagonistycznych obwodów neuronalnych.
Z 302 neuronów C. elegans, dziewiętnaście GABAergicznych motoneuronów typu D unerwia mięśnie ściany ciała (BWMs), natomiast cztery neurony GABAergiczne, nazywane RME, unerwiają mięśnie głowy. Z kolei trzydzieści dziewięć motoneuronów wykazuje ekspresję pobudzającego neuroprzekaźnika, acetylocholiny (ACh), i znosi działanie przekaźnictwa GABA w BWMs w celu koordynacji lokomocji. Antagonistyczny charakter motoneuronów GABAergicznych i cholinergicznych w NMJs ściany ciała został początkowo ustalony za pomocą ablacji laserowej, a później potwierdzony poprzez ekspozycję na aldikarb. Ostra ekspozycja na aldikarb prowadzi do paraliżu zależnego od czasu lub dawki u nicieni typu dzikiego. Jednak utrata pobudzającego przekaźnictwa ACh nadaje odporność na aldikarb, ponieważ w NMJs nicieni gromadzi się mniej ACh, co prowadzi do mniejszej stymulacji BWMs. Odporność na aldikarb może być obserwowana u mutantów specyficznych dla ACh lub z ogólnymi zaburzeniami funkcji synaptycznych. Zgodnie z antagonistycznym działaniem przekaźnictwa GABA i ACh, utrata przekaźnictwa GABA lub brak negatywnej regulacji uwalniania ACh nadaje nadwrażliwość na aldikarb. Choć ekspozycja na aldikarb doprowadziła do wyizolowania licznych homologów genów neuroprzekaźnictwa u nicieni, sama ekspozycja na aldikarb nie pozwala efektywnie określić dominujących ról genów i szlaków w konkretnych motoneuronach C. elegans. W tym celu wprowadziliśmy uzupełniające podejście eksperymentalne, które wykorzystuje PTZ.
Mutanty neurotransmiteryjne wykazują wyraźne fenotypy w odpowiedzi na PTZ, które różnią się od paraliżu indukowanego aldikarbem. Nicienie typu dzikiego, jak również mutanty z konkretnymi zaburzeniami uwalniania lub odbierania ACh, nie wykazują widocznej wrażliwości na PTZ. Jednak mutanty GABA, a także mutanty z ogólnymi zaburzeniami funkcji synaptycznych, wykazują drgawki przedniej części ciała w sposób zależny od czasu lub dawki. Mutanty, które nie potrafią negatywnie regulować ogólnego uwalniania neuroprzekaźników i w związku z tym wydzielają nadmierne ilości ACh do BWMs, ulegają paraliżowi pod wpływem PTZ. Fenotypy indukowane przez PTZ w poszczególnych klasach mutantów wskazują, że podejście komplementarne, łączące paradygmaty ekspozycji na aldikarb i PTZ u C. elegans, może przyspieszyć nasze zrozumienie neurotransmisji. Ponadto filmy demonstrujące sposób przeprowadzania testów farmakologicznych powinny pomóc w ustanowieniu spójnych metod badawczych dla C. elegans.
Protokół
Paradygmat ekspozycji na aldikarb
- Pierwszego dnia należy zapewnić dostępność co najmniej trzydziestu nicieni w stadium młodych osobników dorosłych dla każdego genotypu i każdej powtórki, które będą wykorzystane do testów z aldikarbem drugiego dnia. Zaleca się, aby badacz przeniósł pięćdziesiąt lub więcej nicieni w stadium L4 na świeże płytki NGM (najlepiej bez nystatyny), zawierające E. coli (preferencyjnie szczep OP50) jako źródło pożywienia, i hodował je przez 12-24 godziny w stałej, dopuszczalnej temperaturze (najlepiej od 20°C do 22°C, choć 25°C jest również dopuszczalne).
- Drugiego dnia należy przygotować 100 mM roztwór zapasowy aldikarbu w 70% etanolu (EtOH) i 30% ddH2O. Odpowiednią ilość aldikarbu należy rozprowadzić na płytkach NGM bez nystatyny, stosując określone objętości w celu uzyskania pożądanych stężeń aldikarbu. My konsekwentnie stosujemy 0.5 mM aldikarbu, nanosząc 37.5 μL 100 mM aldikarbu na płytki NGM o objętości 7.5 mL. Płytki z aldikarbem należy pozostawić do wyschnięcia przez około 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Nie ma potrzeby uchylania pokrywek. Alternatywnie aldikarb można dodać do NGM i przechowywać w temperaturze 4°C przez jeden tydzień.
- Po wyschnięciu należy nanieść stałe objętości E. coli (preferencyjnie OP50) na środek każdej płytki z aldikarbem i pozostawić do wyschnięcia przez kolejne 30-60 minut w temperaturze pokojowej. My konsekwentnie nanosimy 25 μL OP50, co tworzy lawn pożywkowy o wystarczającej wielkości, aby utrzymać nicienie w małym obszarze, unikając jednocześnie ich nadmiernego zagęszczenia.
- Gdy lawn pożywkowy wyschnie, można przystąpić do testów z aldikarbem. Ze względu na subiektywny charakter testów z aldikarbem, zdecydowanie zaleca się przeprowadzanie eksperymentów metodą „ślepej próby”. Kolega głównego badacza może ponownie oznakować oryginalne płytki z nicieniami przeznaczonymi do analizy. Podobnie, kolega ten może przenieść nicienie z oryginalnych płytek na zakodowane płytki z aldikarbem bezpośrednio przed uruchomieniem stoperem czasu. Jeśli badacz przewiduje analizę konkretnego szczepu nicieni o charakterystycznym fenotypie, takim jak brak koordynacji, należy również zastosować kontrolę o podobnym fenotypie, aby zredukować błąd systematyczny. Ponadto najlepiej jest, aby badacz równolegle analizował szczep typu dzikiego, szczep oporny oraz szczep nadwrażliwy, co pomaga w standaryzacji eksperymentów. Badacz powinien dążyć do analizy stałej liczby nicieni dla każdej powtórki. My konsekwentnie analizujemy trzydzieści nicieni jednego genotypu dla każdej powtórki. Wykonujemy również co najmniej trzy powtórki dla każdego eksperymentu. Doświadczony badacz powinien być w stanie analizować co najmniej sześć szczepów jednocześnie.
- Liczbę sparaliżowanych nicieni należy określić poprzez systematyczne dotykanie każdego osobnika drutem platynowym. My konsekwentnie dotykamy naszych nicieni dwukrotnie w obrębie głowy i dwukrotnie w obrębie ogona co 30 minut przez łącznie trzy godziny. Do zdefiniowania paraliżu można również wykorzystać ustanie pompowania gardłowego, jednak tylko wtedy, gdy badacz stosuje spójną definicję paraliżu we wszystkich testach. Warto również zauważyć, że niektóre nicienie, zwłaszcza te oporne na aldikarb, mogą próbować pełznąć poza płytkę. W takim przypadku badacz może nanieść stałą ilość kwasu palmitynowego, który stanowi fizyczną barierę dla lokomocji nicieni, wokół płytek z aldikarbem. My nanosimy 25 μL roztworu 10 mg kwasu palmitynowego/mL EtOH.
Paradygmat ekspozycji na PTZ
- Pierwszego dnia należy zapewnić dostępność co najmniej trzydziestu młodych dorosłych nicieni każdego genotypu i każdej repliki do testów PTZ, które odbędą się drugiego dnia. Zaleca się, aby badacz przeniósł pięćdziesiąt lub więcej nicieni w stadium L4 na świeże płytki NGM (najlepiej bez nystatyny), zawierające E. coli (preferencyjnie szczep OP50) jako źródło pożywienia, i hodował je przez 12-24 godziny w stałej, dopuszczalnej temperaturze (najlepiej od 20°C do 22°C, choć 25°C jest dopuszczalne).
- Drugiego dnia należy przygotować roztwór zapasowy PTZ o stężeniu 0,5 g PTZ/mL ddH2O. Odpowiednią ilość PTZ rozprowadza się na płytkach NGM bez nystatyny w określonych objętościach, aby uzyskać pożądane stężenia PTZ. Ponieważ w przypadku PTZ preferujemy testy zależności dawka-odpowiedź, nakładamy różne ilości PTZ na płytki NGM o objętości 7,5 mL. Na przykład można nanieść 37,5 μL roztworu zapasowego PTZ na płytkę NGM 7,5 mL, aby uzyskać roztwór o stężeniu 5 mg PTZ/mL. Płytki z PTZ należy pozostawić do wyschnięcia przez około 60-120 minut w temperaturze pokojowej. Nie jest konieczne uchylanie pokrywek. Alternatywnie PTZ można dodać bezpośrednio do NGM, ale należy go użyć do testów niezwłocznie po zestaleniu. Stabilność PTZ jest znacznie niższa niż w przypadku aldikarbu. W związku z tym testy z wykorzystaniem starszych płytek PTZ są mniej wiarygodne. Przed użyciem PTZ należy przechowywać w temperaturze -20°C w eksykatorku z absorbentem wilgoci. W celu zapewnienia stabilności zalecamy utylizację PTZ około dwóch miesięcy po otwarciu.
- Po wyschnięciu należy nanieść stałe objętości E. coli (preferencyjnie OP50) na środek każdej płytki PTZ i suszyć przez kolejne 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Stosujemy stałą objętość 25 μL OP50, co tworzy lawn bakteryjny o wystarczającym rozmiarze, aby utrzymać nicienie w małym obszarze bez ich nadmiernego zagęszczenia.
- Gdy lawn bakteryjny wyschnie, można przystąpić do testów PTZ. Chociaż testy PTZ są mniej subiektywne niż testy z aldikarbem, nadal wysoce zaleca się przeprowadzanie eksperymentów metodą „ślepej próby”. Kolega głównego badacza może ponownie oznakować oryginalne płytki z nicieniami przeznaczonymi do badania. Podobnie kolega może przenieść nicienie z płytek oryginalnych na zakodowane płytki PTZ bezpośrednio przed uruchomieniem stopera. Jeśli badacz przewiduje analizę konkretnego szczepu nicieni o charakterystycznym fenotypie, np. braku koordynacji, należy zastosować kontrolę o podobnym fenotypie w celu zmniejszenia błędu systematycznego. Ponadto najlepiej jest, aby badacz równolegle analizował szczep typu dzikiego oraz szczepy z konwulsjami przednimi lub całego ciała, co pomaga w standaryzacji eksperymentów. Badacz powinien dążyć do analizy stałej liczby nicieni dla każdej repliki. My konsekwentnie analizujemy trzydzieści nicieni jednego genotypu dla każdej repliki. Wykonujemy również co najmniej trzy powtórzenia dla każdego eksperymentu. Doświadczony badacz powinien być w stanie analizować co najmniej trzy szczepy jednocześnie. Należy jednak pamiętać, że częstotliwość i intensywność konwulsji indukowanych przez PTZ zwykle osiągają szczyt między 15 a 30 minutą ekspozycji, a następnie słabną w miarę jak nicienie ulegają paraliżowi lub w niektórych przypadkach aklimatyzują się do leku.
- Należy liczyć liczbę nicieni z konwulsjami „typu epileptycznego” co 30 minut przez łącznie jedną godzinę. Najlepiej jest oddzielnie oceniać liczbę nicieni z konwulsjami przednimi, które nazywamy „head-bobs”, od liczby nicieni z konwulsjami całego ciała, paraliżem całego ciała, który nazywamy „tonic”, lub kombinacją konwulsji przednich z paraliżem BWM, co nazywamy „tonic-clonic”. Większość nicieni jednego genotypu wykazuje tylko jeden rodzaj konwulsji. Jednak nicienie tonic-clonic często stają się całkowicie tonic, dlatego należy kontynuować badanie powyżej 30 minut, nawet jeśli wszystkie nicienie wykazały już konwulsje. Warto również zauważyć, że niektóre nicienie mogą próbować pełznąć poza płytkę. W takim przypadku badacz może rozprowadzić stałą ilość kwasu palmitynowego wokół płytek PTZ. My rozprowadzamy 25 μL roztworu 10 mg kwasu palmitynowego/mL EtOH.
Reakcje behawioralne wybranych mutantów transmisji synaptycznej C. elegans na aldikarb i PTZ
| Nazwa mutanta | Rola synaptyczna | Zachowanie bez leku | Reakcja behawioralna na aldikarb (w porównaniu do typu dzikiego N2) | Reakcja behawioralna na PTZ |
| tom-1(ok188) | hamuje przekaźnictwo synaptyczne | nieskoordynowany | zwiększona szybkość paraliżu | nieodróżnialny od typu dzikiego |
| unc-43(n498n1186) | złożona | nieskoordynowany | zwiększona szybkość paraliżu | konwulsje całego ciała |
| unc-25(e156) | promuje przekaźnictwo GABA | nieskoordynowany | zwiększona szybkość paraliżu | konwulsje przedniej części ciała, paraliż całego ciała |
| snb-1(md247) | promuje przekaźnictwo synaptyczne | nieskoordynowany | zmniejszona szybkość paraliżu | konwulsje przedniej części ciała |
| unc-4(e120) | promuje przekaźnictwo ACh | nieskoordynowany | zmniejszona szybkość paraliżu | nieodróżnialny od typu dzikiego |
Dwa stymulanty neuronalne: inhibitor acetylocholinoesterazy, zwany aldikarbem, oraz antagonista receptorów GABA, zwany pentylenotetrazolem (PTZ), mogą być stosowane w sposób komplementarny do charakterystyki mutantów przekaźnictwa synaptycznego u C. elegans. Nadmiar pobudzającej acetylocholiny (ACh) gromadzi się w złączach nerwowo-mięśniowych (NMJs) ściany ciała nicieni w wyniku szkodliwych mutacji w negatywnych regulatorach przekaźnictwa ACh (np. tom-1 i unc-43) lub pozytywnych regulatorach hamującego przekaźnictwa GABA (np. unc-25). I odwrotnie, poziomy pobudzającej ACh w NMJs nicieni są obniżone w wyniku szkodliwych mutacji w pozytywnych regulatorach ogólnego przekaźnictwa synaptycznego (np. snb-1) lub w genach specyficznych dla przekaźnictwa ACh (np. unc-4). W porównaniu z nicieniami typu dzikiego N2, nicienie mutanty o zwiększonym pobudzającym przekaźnictwie ACh w NMJs wykazują przyspieszone tempo paraliżu indukowanego aldikarbem, natomiast nicienie mutanty o obniżonym pobudzającym przekaźnictwie ACh wykazują zmniejszone tempo paraliżu indukowanego aldikarbem. Chociaż PTZ zaburza synchronizację neuronalną w mięśniach ściany ciała C. elegans, podobnie jak aldikarb, PTZ znosi również działanie hamującego GABA w mięśniach głowy C. elegans. W rezultacie wrażliwość na aldikarb nie może precyzyjnie przewidzieć wrażliwości na PTZ. Nicienie mutanty ze specyficznymi defektami w negatywnej lub pozytywnej regulacji przekaźnictwa ACh są nieodróżnialne od nicieni typu dzikiego N2 w obecności PTZ, natomiast nicienie mutanty z defektami w pozytywnej regulacji ogólnego przekaźnictwa synaptycznego lub specyficznymi defektami w hamującym przekaźnictwie GABA wykazują silne konwulsje przedniej części ciała indukowane przez PTZ. Ponadto mutanty unc-43 z utratą funkcji wykazują konwulsje całego ciała w obecności PTZ i prawdopodobnie posiadają dodatkowe nieprawidłowości w przekaźnictwie synaptycznym, które przyczyniają się do ich unikalnych reakcji na leki.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Obecne protokoły ekspozycji na aldikarb z użyciem C. elegans nie pozwalają badaczom na odróżnienie mutantów ze specyficznymi deficytami w przekazywaniu ACh od mutantów z uogólnionymi deficytami w przekazywaniu synaptycznym, ponieważ obie klasy mutantów wykazują oporność na aldikarb. Podobnie, aldikarb nie może być wykorzystany do ustalenia, czy mutanty mają specyficzne deficyty w przekazywaniu GABA, czy uogólnione niepowodzenia w negatywnej regulacji przekazywania ACh, gdyż obie klasy mutantów wykazują nadwrażli...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Pragniemy podziękować wszystkim członkom laboratorium Caldwell za ducha współpracy. Badania nad pobudliwością neuronalną i epilepsją w laboratorium Caldwell były finansowane z nagrody Basil O’Connor Scholar Award przyznanej przez March of Dimes, grantu CAREER z National Science Foundation dla GAC, a także grantu z programu Undergraduate Research Science Program z Howard Hughes Medical Institute dla The University of Alabama.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Aldikarb | Odczynnik | Supelco, Sigma-Aldrich | PS734 | Dostępny w sprzedaży w Sigma |
| Pentylenotetrazol | Odczynnik | Sigma-Aldrich | P6500 |
Bibliografia
- Mahoney, T. R., Luo, S., Nonet, M. L. Analysis of synaptic transmission in Caenorhabditis elegans using an aldicarb-sensitivity assay. Nat. Protoc. 1, 1772-1777 (2006).
- Williams, S. N., Locke, C. J., Braden, A. L., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Epileptic-like convulsions associated with LIS-1 in the cytoskeletal control of neurotransmitter signaling in Caenorhabditis elegans. Hum. Mol. Genet.. 13, 2043-2059 (2004).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
