Paradygmaty farmakologicznej charakterystyki mutantów transmisji synaptycznej C. elegans

Podsumowanie

Ten film pokazuje, jak wykorzystać dwa stymulanty neuronalne, aldikarb i pentylenotetrazol (PTZ), w uzupełniający się sposób do badania funkcji synaptycznych u nicienia, C. elegans. To uzupełniające podejście może być również wykorzystane do rzucenia światła na ewolucyjnie zachowane mechanizmy modulowania synchronizacji neuronalnej i ma wpływ na padaczkę i napady padaczkowe.

Streszczenie

Nicienie, Caenorhabditis elegans, stały się użytecznym modelem do badania neurotransmisji. C. elegans jest unikalny wśród modeli zwierzęcych, ponieważ anatomia i łączność jego układu nerwowego została określona na podstawie mikrofotografii elektronowych i udoskonalona za pomocą testów farmakologicznych. W tym filmie opisujemy, w jaki sposób dwa komplementarne stymulanty neuronalne, inhibitor acetylocholinoesterazy zwany aldikarbem i antagonista receptora kwasu gamma-aminomasłowego (GABA), zwany pentylenotetrazolem (PTZ), mogą być wykorzystane do specyficznego scharakteryzowania sygnalizacji w połączeniach nerwowo-mięśniowych C. elegans (NMJ) i ułatwienia naszego zrozumienia antagonistycznych obwodów neuronalnych.

Z 302 neuronów C. elegans, dziewiętnaście GABA-ergicznych neuronów ruchowych typu D unerwia mięśnie ściany ciała (BWM), podczas gdy cztery neurony GABA-ergiczne, zwane RME, unerwiają mięśnie głowy. I odwrotnie, trzydzieści dziewięć neuronów ruchowych wyraża pobudzający neuroprzekaźnik, acetylocholinę (ACh) i antagonizuje transmisję GABA w BWM w celu koordynowania lokomocji. Antagonistyczny charakter GABA-ergicznych i cholinergicznych neuronów ruchowych w ścianach ciała NMJ został początkowo określony przez ablację laserową, a następnie wzmocniony przez ekspozycję na aldikarb. Ostra ekspozycja na aldikarb powoduje paraliż w czasie lub zależny od dawki u robaków typu dzikiego. Jednak utrata pobudzającej transmisji ACh nadaje oporność na aldikarb, ponieważ mniej ACh gromadzi się w NMJ robaków, co prowadzi do mniejszej stymulacji BWM. Oporność na aldikarb można zaobserwować w przypadku mutantów specyficznych dla ACh lub ogólnych funkcji synaptycznych. Zgodnie z antagonistyczną transmisją GABA i ACh, utrata transmisji GABA lub brak negatywnej regulacji uwalniania ACh powoduje nadwrażliwość na aldikarb. Chociaż ekspozycja na aldikarb doprowadziła do wyizolowania wielu robaków homologów genów neuroprzekaźnictwa, sama ekspozycja na aldikarb nie może skutecznie określić dominujących ról genów i szlaków w określonych neuronach ruchowych C. elegans. W tym celu wprowadziliśmy komplementarne podejście eksperymentalne, które wykorzystuje PTZ.

Mutanty neurotransmisji wykazują wyraźne fenotypy, odmienne od paraliżu wywołanego aldikarbem, w odpowiedzi na PTZ. Robaki typu dzikiego, a także mutanty o specyficznej niezdolności do uwalniania lub odbierania ACh, nie wykazują widocznej wrażliwości na PTZ. Jednak mutanty GABA, jak również mutanty ogólnej funkcji synaptycznej, wykazują drgawki przednie w czasie lub w sposób zależny od dawki. Mutanty, które nie są w stanie negatywnie regulować ogólnego uwalniania neuroprzekaźników, a tym samym wydzielają nadmierne ilości ACh na BWM, zostają sparaliżowane przez PTZ. Indukowane przez PTZ fenotypy dyskretnych klas mutantów wskazują, że komplementarne podejście z paradygmatami ekspozycji na aldikarb i PTZ u C. elegans może przyspieszyć nasze zrozumienie neuroprzekaźnictwa. Co więcej, filmy pokazujące, w jaki sposób przeprowadzamy testy farmakologiczne, powinny ustanowić spójne metody badań nad C. elegans.

Protokół

Paradygmat ekspozycji na aldikarb

1. Pierwszego dnia należy upewnić się, że co najmniej trzydzieści młodych dorosłych robaków z każdego genotypu i każdej kontrpróby będzie dostępnych do testów na obecność aldikarbu w drugim dniu. Najlepiej jest, jeśli eksperymentator wybierze pięćdziesiąt lub więcej robaków w stadium L4 na świeże płytki NGM (najlepiej bez nystatyny), które zawierają E. coli (najlepiej OP50) jako źródło pożywienia, i hoduje je przez 12-24 godziny w stałej i dopuszczalnej temperaturze (najlepiej od 20°C do 22°C, chociaż 25°C jest w porządku).
   
   
2. Drugiego dnia przygotować 100 mM roztwór podstawowy aldikarbu z 70% etanolem (EtOH) i 30%_ddH2O. Rozprowadzić odpowiednią ilość aldikarbu na płytkach NGM minus nystatyna o określonych objętościach, aby osiągnąć pożądane stężenia aldikarbu. Konsekwentnie używamy 0,5 mM aldikarbu, posiewając 37,5 μl 100 mM aldikarbu na płytkach 7,5 ml NGM. Pozostaw płytki aldikarbu do wyschnięcia na około 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Nie ma potrzeby pękania pokrywek. Alternatywnie, aldikarb można dodać do NGM i przechowywać w temperaturze 4°C przez tydzień.
    
3. Po wysuszeniu umieść równomierne objętości E. coli (najlepiej OP50) na środku każdej płytki aldikarbu i susz przez kolejne 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Konsekwentnie nakładamy 25 μl OP50, co tworzy wystarczająco duży trawnik spożywczy, aby robaki były skoncentrowane w małym miejscu bez nadmiernego zatłoczenia.
    
4. Gdy trawnik spożywczy jest suchy, można przystąpić do testów aldikarbu. Ze względu na subiektywny charakter testów aldikarbu zdecydowanie zaleca się, aby eksperymenty były przeprowadzane "na ślepo". Kolega głównego eksperymentatora mógł ponownie oznaczyć oryginalne płytki robakami do testu. Podobnie, kolega mógł przenieść robaki z oryginalnych płytek na zaszyfrowane płytki aldikarbowe bezpośrednio przed uruchomieniem timera. Jeśli eksperymentator przewiduje oznaczenie określonego szczepu robaków o charakterystycznym fenotypie, takim jak brak koordynacji, musi istnieć również kontrola o podobnym fenotypie, aby zmniejszyć stronniczość. Co więcej, najlepiej jest, jeśli eksperymentator testuje równolegle szczep typu dzikiego, a także szczep oporny i szczep nadwrażliwy, aby pomóc w standaryzacji eksperymentów. Eksperymentator powinien dążyć do przeanalizowania stałej liczby robaków dla każdej repliki. Konsekwentnie analizujemy trzydzieści robaków o jednym genotypie dla każdej repliki. Wykonujemy również co najmniej trzy powtórzenia dla każdego eksperymentu. Doświadczony eksperymentator powinien być w stanie analizować co najmniej sześć szczepów jednocześnie.
    
5. Policz liczbę sparaliżowanych robaków, szturchając w konsekwentny sposób każdego robaka platynowym drutem. Konsekwentnie szturchamy nasze robaki dwa razy w głowę i dwa razy w ogon co 30 minut, w sumie przez trzy godziny. Zaprzestanie pompowania gardła może być również użyte do zdefiniowania paraliżu, ale tylko wtedy, gdy eksperymentator zastosuje spójną definicję paraliżu we wszystkich testach. Warto również zauważyć, że niektóre robaki, zwłaszcza te, które są odporne na aldikarb, mogą próbować zpełznąć z talerza. W takim przypadku eksperymentator może rozprowadzić stałą ilość kwasu palmitynowego, fizycznej bariery dla poruszania się robaków, wokół płytek aldikarbu. Rozprowadzamy 25 μL 10 mg kwasu palmitynowego/ml EtOH.

Paradygmat ekspozycji PTZ

1. Pierwszego dnia należy upewnić się, że co najmniej trzydzieści młodych dorosłych robaków o każdym genotypie i każdej kontrpróbie będzie dostępnych do testów PTZ w drugim dniu. Najlepiej jest, jeśli eksperymentator wybierze pięćdziesiąt lub więcej robaków w stadium L4 na świeże płytki NGM (najlepiej bez nystatyny), które zawierają E. coli (najlepiej OP50) jako źródło pożywienia, i hoduje je przez 12-24 godziny w stałej i dopuszczalnej temperaturze (najlepiej od 20°C do 22°C, chociaż 25°C jest w porządku).
   
   
2. Drugiego dnia przygotować 0,5 g PTZ/ml ddH₂O roztworu podstawowego PTZ. Rozprowadź odpowiednią ilość PTZ na płytkach NGM minus nystatyna o określonych objętościach, aby osiągnąć pożądane stężenia PTZ. Ponieważ preferujemy testy dawka-odpowiedź dla PTZ, nanosimy różne ilości PTZ na płytki NGM o pojemności 7,5 ml. Na przykład, można nanieść 37,5 μl roztworu podstawowego PTZ na płytkę o pojemności 7,5 ml NGM, aby uzyskać roztwór o stężeniu 5 mg PTZ/ml. Pozostaw płyty PTZ do wyschnięcia na około 60-120 minut w temperaturze pokojowej. Nie ma potrzeby pękania pokrywek. Alternatywnie, PTZ można dodać bezpośrednio do NGM, ale należy go natychmiast użyć do testów po zestaleniu. Stabilność PTZ jest znacznie mniejsza niż aldikarbu. Dlatego testy ze starszymi płytami PTZ są mniej wiarygodne. PTZ należy przed użyciem przechowywać w temperaturze -20°C w eksykatorze ze środkiem osuszającym. Preferujemy wyrzucenie PTZ około dwa miesiące po otwarciu, aby zapewnić stabilność.
   
   
3. Po wysuszeniu nanieś równomierne ilości E. coli (najlepiej OP50) na środek każdej płytki PTZ i susz przez kolejne 30-60 minut w temperaturze pokojowej. Konsekwentnie nakładamy 25 μl OP50, co tworzy wystarczająco duży trawnik spożywczy, aby robaki były skoncentrowane w małym miejscu bez nadmiernego zatłoczenia.
    
4. Gdy trawnik spożywczy jest suchy, można przystąpić do testów PTZ. Chociaż testy PTZ są mniej subiektywne niż testy aldikarbu, nadal zdecydowanie zaleca się, aby eksperymenty były wykonywane "na ślepo". Kolega głównego eksperymentatora mógł ponownie oznaczyć oryginalne płytki robakami do testu. Podobnie, kolega mógł przenieść robaki z oryginalnych tabliczek na zaszyfrowane tablice PTZ bezpośrednio przed uruchomieniem timera. Jeśli eksperymentator przewiduje oznaczenie określonego szczepu robaków o charakterystycznym fenotypie, takim jak brak koordynacji, musi istnieć również kontrola o podobnym fenotypie, aby zmniejszyć stronniczość. Co więcej, najlepiej jest, jeśli eksperymentator testuje szczep typu dzikiego, a także szczepy z drgawkami w przedniej części ciała lub na całe ciało, równolegle, aby pomóc w standaryzacji eksperymentów. Eksperymentator powinien dążyć do przeanalizowania stałej liczby robaków dla każdej repliki. Konsekwentnie analizujemy trzydzieści robaków o jednym genotypie dla każdej repliki. Wykonujemy również co najmniej trzy powtórzenia dla każdego eksperymentu. Doświadczony eksperymentator powinien być w stanie analizować co najmniej trzy szczepy na raz. Jednak częstotliwość i intensywność drgawek wywołanych przez PTZ zwykle osiąga szczyt między 15-30 minutami ekspozycji, a następnie słabnie, gdy robaki zostają sparaliżowane lub, w niektórych przypadkach, przyzwyczajają się do leku.
   
   
5. Policz liczbę "epileptycznych" konwulsyjnych robaków co 30 minut, w sumie przez jedną godzinę. Najlepiej jest ocenić liczbę robaków z drgawkami przednimi, które nazywamy "head-bobs", oddzielnie od liczby robaków z drgawkami całego ciała, paraliżem całego ciała, który nazywamy "tonicznym", lub kombinacją drgawek przednich z paraliżem BWM, który nazywamy "toniczno-klonicznym". Większość robaków o tym samym genotypie wykazuje tylko jeden rodzaj drgawek. Jednak robaki toniczno-kloniczne często stają się całkowicie toniczne, dlatego należy kontynuować test po 30 minutach, nawet jeśli wszystkie robaki już wykazały drgawki. Warto również zauważyć, że niektóre robaki mogą próbować wypełznąć z talerza. W takim przypadku eksperymentator może rozprowadzić stałą ilość kwasu palmitynowego wokół płytek PTZ. Rozprowadzamy 25 μL 10 mg kwasu palmitynowego/ml EtOH.

 

Reakcje behawioralne wybranych mutantów transmisji synaptycznej C. elegans na aldikarb i PTZ

Nazwa mutanta	Zachowanie roli synaptycznej	bez reakcji	behawioralnej leku na aldikarb (w porównaniu z N2 typu dzikiego)	Odpowiedź behawioralna na PTZ
Tomek-1(OK188)	hamuje przekaźnictwo synaptyczne	Nieskoordynowane	zwiększony wskaźnik paraliżu	Nie do odróżnienia od dzikiego typu
UNC-43(N498N1186)	kompleks	Nieskoordynowane	zwiększony wskaźnik paraliżu	drgawki całego ciała
UNC-25(E156)	wspomaga transmisję GABA	Nieskoordynowane	zwiększony wskaźnik paraliżu	drgawki przednie, paraliż całego ciała
SNB-1(MD247)	wspomaga przekaźnictwo synaptyczne	Nieskoordynowane	Zmniejszona częstość paraliżu	drgawki przednie
UNC-4(E120)	wspomaga transmisję ACh	Nieskoordynowane	Zmniejszona częstość paraliżu	Nie do odróżnienia od dzikiego typu

Dwa stymulanty neuronalne, inhibitor acetylocholinoesterazy, zwany aldikarbem, i antagonista receptora GABA, zwany pentylenotetrazolem (PTZ), mogą być używane w sposób komplementarny do charakteryzowania mutantów transmisji synaptycznej C. elegans. Nadmiar pobudzającej acetylocholiny (ACh) gromadzi się w połączeniach nerwowo-mięśniowych ściany ciała robaka (NMJ) w wyniku szkodliwych mutacji w ujemnych regulatorach transmisji ACh (np. tom-1 i unc-43) lub dodatnich regulatorach hamującej transmisji GABA (np. unc-25). I odwrotnie, pobudzające poziomy ACh w NMJ robaków są zmniejszane przez szkodliwe mutacje w pozytywnych regulatorach ogólnej transmisji synaptycznej (np. snb-1) lub genach transmisyjnych specyficznych dla ACh (np. unc-4). W porównaniu z robakami N2 typu dzikiego, zmutowane robaki z podwyższoną pobudzającą transmisją ACh w NMJ wykazują zwiększone wskaźniki paraliżu wywołanego aldikarbem, podczas gdy zmutowane robaki z obniżoną pobudzającą transmisją ACh wykazują zmniejszone wskaźniki paraliżu wywołanego aldikarbem. Chociaż PTZ zakłóca synchronizację neuronów w mięśniach ściany ciała C. elegans, podobnie jak aldikarb, PTZ antagonizuje również hamujący GABA w mięśniach głowy C. elegans. W związku z tym czułość aldikarbu nie może dokładnie przewidzieć czułości PTZ. Zmutowane robaki ze specyficznymi defektami w negatywnej lub pozytywnej regulacji transmisji ACh są nie do odróżnienia od robaków N2 typu dzikiego w obecności PTZ, podczas gdy zmutowane robaki z defektami pozytywnej regulacji ogólnej transmisji synaptycznej lub specyficznymi defektami w hamującej transmisji GABA wykazują silne drgawki przednie wywołane PTZ. Co więcej, mutanty unc-43 z utratą funkcji wykazują drgawki całego ciała w obecności PTZ i prawdopodobnie mają dodatkowe nieprawidłowości transmisji synaptycznej, które przyczyniają się do ich unikalnych odpowiedzi na leki.

Dyskusja

Obecne protokoły ekspozycji na aldikarb z C. elegans nie pozwalają eksperymentatorom na rozróżnienie mutantów ze specyficznymi deficytami w transmisji ACh i mutantów z uogólnionymi deficytami w transmisji synaptycznej, ponieważ obie klasy mutantów wykazują oporność na aldikarb. Podobnie, aldikarb nie może być stosowany do określenia, czy mutanty mają specyficzne deficyty w transmisji GABA lub uogólnione niepowodzenia w negatywnej regulacji transmisji ACh, ponieważ obie klasy mutantów wykazują nadwrażliwość na al...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Odczynnik Aldicarb		Supelco, Sigma-Aldrich	PS734	Do kupienia od Sigma
Pentylenotetrazol	Odczynnik	Sigma-Aldrich	P6500