Szybkie techniki wizualizacji coraz unieruchomionych komórek drożdży, tutaj stosowane do świetlówek dziennikarzom w cichej krycia loci HML i HMR
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Szybkie Technika Wizualizacja żywo unieruchomionych komórek drożdży
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Prezentujemy proste, szybkie i bardzo elastyczne technikę do immobilizacji i wizualizacji rosnących komórek drożdży epifluorescencją mikroskopii. Technika jest odpowiedni zarówno do wizualizacji statycznych populacji drożdży i eksperymentów kursy czas do dziesięciu godzin w długości. My mikroskopii bada Dziedziczenie epigenetyczne w cichej loci krycia w S. cerevisiae. Istnieją dwa ciche loci krycia, HML i HMR, które nie są normalnie wyrażane są one pakowane w heterochromatyny. W sir1 wyciszanie mutant tle jest osłabiony tak, że każdy locus może być w wyraźnych lub wyciszony stan epigenetyczne, więc w całej populacji jest połączenie komórki z różnych państw epigenetyczne dla HML i HMR. My mikroskopia wykazała, że nie ma żadnego związku między epigenetyczne stan HML i HMR w poszczególnych komórek. sir1 komórek stochastycznie przełącznik epigenetyczne państwa, ustanawiający wyciszania na wcześniej wyrażone locus lub wyrażając wcześniej wyciszony locus. My mikroskopii oczywiście czas śledzone poszczególnych sir1 komórek i ich potomstwa na zdobycie częstotliwości każdego z czterech możliwych przełączników epigenetyczne, a tym samym stabilność każdego z państw epigenetyczne w sir1 komórek. Zobacz także Xu et al. Mol. Piosenki 2006 roku.
Protokół
- Unieruchomionych komórek oczywiście mikroskopii czas epifluorescencją. Należy pamiętać, że protokół ten jest przydatna tylko gdy obiektywy swojego mikroskopu są pod sceną mikroskopem.
- Komórek miejsce pożądanego stężenia w płynie mediów na długo szkiełko (ok. 24x50mm)
- Cut bloku agar o pożądanej wielkości z syntetycznych płyta media (te mają niższe autofluorescencję) i umieścić w komórkach. Miejsce z boku bloku agar nie obsługiwane przez pincety w kontakcie z komórkami.
- W przypadku krótszych okresów czasu (do 3 godzin), takie ustawienie jest wystarczające. Jeżeli komórki są w ruchu, gdy wyświetlone na mikroskopem, zmniejszenie objętości komórek lub obszaru wzrost bloku agar.
- W przypadku dłuższych okresów czasu, miejsce spadek świeżych ciekłych na szczycie bloku agar, i umieścić szkiełka w górnej części bloku agar. Ten slajd zmniejsza parowanie przez szczyt bloku agar. W razie potrzeby, krawędzie bloku agar w kontakcie z poślizgu okładka może być zamknięte z wazeliną w celu dalszego zmniejszenia wilgoci. Używałem tego zestawu do filmów do 9 godzin, z dzielących się komórek w dzikie stawki typu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Jest to szybka technika, która unieruchamia komórek drożdży, umożliwiając jednocześnie wzrostu. Śledzimy rozwój drożdży do dziesięciu godzin, z drożdży wyświetlania dzikich stóp podział typu w trakcie eksperymentu. Zauważ, że ta instalacja wymaga obiektywu być pod sceną mikroskopem.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Oświadczenia
Autorzy nie mają nic do ujawnienia.
Podziękowania
Chcielibyśmy podziękować Pete Houston i Eugenia Xu za pomoc.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Xu, E. Y., Zawadzki, K. A., Broach, J. R. Single-cell observations reveal intermediate transcriptional silencing states. Mol. Cell. 23, 219-229 (2006).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
