Niniejsze wideo jest demonstracją techniczną protokołu hybrydyzacji dla zestawu CGH z płytkami o gęstym pokryciu całego genomu (whole genome tiling path array CGH), który pozwala na przeskanowanie całego ludzkiego genomu przy użyciu zaledwie 25-100 ng DNA, które można wyizolować z różnych źródeł, w tym z archiwalnego materiału utrwalonego w formalinie.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Demonstracja techniczna porównawczej hybrydyzacji genomowej całego genomu z wykorzystaniem macierzy (array CGH)
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Porównawcza hybrydyzacja genomowa na mikromacierzach (array CGH) jest metodą wykrywania przyrostów i ubytków fragmentów DNA lub zmian w dawce genów w genomie 1. Ostatnie postępy w tej technologii umożliwiły wysokorozdzielcze porównywanie całych genomów w celu identyfikacji zmian genetycznych w nowotworach i innych chorobach genetycznych 2. Macierz o rozdzielczości sub-megabazowej (SMRT) składa się z zestawu około trzydziestu tysięcy nakładających się klonów bakteryjnych chromosomów sztucznych (BAC), które pokrywają ludzki genom w segmentach o długości ~100 kilobaz (kb) 2. Te cele BAC są syntetyzowane indywidualnie i nanoszone w duplikacie na pojedynczą szklaną płytkę 2-4. Array CGH opiera się na zasadzie hybrydyzacji konkurencyjnej. DNA z próbki i DNA referencyjne są różnicowo znakowane fluorescencyjnymi barwnikami Cyanine-3 i Cyanine-5, a następnie współhybrydyzowane z macierzą. Po okresie inkubacji niezwiązane próbki są wypłukiwane z płytki, a macierz jest obrazowana. Do przetwarzania dużej ilości zgromadzonych danych – pojedynczy eksperyment generuje 53 892 punkty danych – wykorzystuje się bezpłatny, specjalistyczny pakiet oprogramowania SeeGH (www.flintbox.ca). SeeGH wizualizuje stosunek intensywności sygnału log2 między dwiema próbkami dla każdego celu BAC, który jest wyrównany pionowo z pozycją chromosomalną 5,6. Macierz SMRT może wykrywać zmiany o rozmiarach nawet 50 kb 7. Macierz SMRT pozwala na wykrycie różnorodnych zdarzeń rearanżacji DNA, w tym przyrostów DNA, ubytków, amplifikacji i delecji homozygotycznych. Wyjątkową zaletą macierzy SMRT jest możliwość wykorzystania DNA wyizolowanego z próbek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE). W połączeniu z niskim zapotrzebowaniem na nieamplifikowane DNA (25-100ng) umożliwia to profilowanie cennych próbek, takich jak te uzyskane metodą mikrodysekcji 7,8. Wynika to z dużego rozmiaru każdego celu hybrydyzacji BAC, co pozwala na związanie wystarczającej ilości znakowanych próbek w celu wytworzenia sygnałów możliwych do detekcji. Inną zaletą tej platformy jest tolerancja na heterogenność tkanki, co zmniejsza potrzebę żmudnej mikrodysekcji tkankowej 8. Niniejszy protokół wideo jest samouczkiem krok po kroku, obejmującym etapy od znakowania wejściowego DNA po akwizycję sygnału dla macierzy SMRT o pełnym pokryciu genomu.
Protokół
ZNAKOWANIE SOND
Uwaga: należy przez cały czas ograniczać ekspozycję barwników Cy na światło (można to osiągnąć pracując w zaciemnionym pomieszczeniu lub osłaniając probówki pokryciem, takim jak folia aluminiowa)
- Połączyć:
(Przygotować 1 probówkę reakcyjną dla referencji i 1 probówkę reakcyjną dla próbki)- DNA (25-400 ng)
- 5 µL buforu do starterów randomowych 5X (Stężenie końcowe: bufor Klenow 5X Promega i 7 µg/ µL randomowych oktamerów)
- Dopełnić do objętości całkowitej 17,0 µL wodą destylowaną H2O
- Gotować przez 10 minut w temperaturze 100°C. Natychmiast przenieść na lód na 1 minutę.
- Dodać 4 µL mieszaniny dNTP 10X (2mM dATP, dGTP, dTTP, 1,2mM dCTP).
- Dodać barwniki CyeDyes:
- Dodać 2 µL (2 nmoli) dCTP znakowanego Cy-3 do DNA próbki
- Dodać 2 µL (2 nmoli) dCTP znakowanego Cy-5 do DNA referencyjnego (np. ludzkiego DNA genomicznego Novagen)
- Dodać 2,5 µL fragmentu Klenowa (9 U/µL, Promega) i wymieszać.
- Inkubować w temperaturze 37°C przez noc* (~18 godzin).
*Czas hybrydyzacji nocnej można dostosować w zakresie od 14 do 24 godzin, aby dopasować go do harmonogramu pracy laboratorium, bez niekorzystnego wpływu na proces znakowania.
OCZYSZCZANIE PRÓBEK
(Łączne oczyszczanie sond i przygotowanie do hybrydyzacji)
- Przy użyciu kolumny Microcon YM-30:
- Do kolumny dodać 100 µL Cot-1 DNA (1µg/µL). Nie należy dotykać membrany końcówką pipety.
- Połączyć reakcje (referencyjną i próbkową) i przenieść do kolumny.
- Umieścić kolumnę w dołączonej probówce i wirować przy 13000 g przez 10 minut.
- Na membranę dodać 200 µL destylowanej H20 i powtórzyć wirowanie w celu przemycia.
- Probówkę usunąć i dodać 45 µL roztworu do hybrydyzacji (Roche DIG Easy).
- Odwrócić Microcon, umieścić w nowej, opisanej probówce i wirować przy 3000 g przez 3 minuty.
OBLICZANIE POZIOMU INCORPORACJI
- Pobrać 1,5 µL i zmierzyć poziom wbudowania fluoroforu za pomocą spektrofotometru NanoDrop. Używając buforu do hybrydyzacji (DIG Easy) jako próbki zerowej, należy postępować zgodnie z instrukcjami na ekranie. (Jeśli jest to konieczne, próbkę można odzyskać z podstawki po dokonaniu pomiaru.)
(Uwaga: Wartości wbudowania poniżej 3,0 pmol/µL w którymkolwiek kanale dawały zmienne wyniki.) - Denaturować w temperaturze 85°C przez 10 minut.
- Inkubować sondę w temperaturze 45°C od 30 minut do 1 godziny (pozwala to na wyżarzanie DNA Cot-1).
HYBRYDYZACJA MACIERZY
- Nanieś 44 µL roztworu sondy na szkiełko zakrywy (22 mm x 60 mm) (Fisher Scientific). Jeśli jest dostępny, umieść szkiełko zakrywy na podgrzewaczu do szkiełek lub bloku grzewczym rozgrzanym wstępnie do 45°C w celu utrzymania temperatury.
- Ustaw szkiełko podstawowe nad szkiełkiem zakrywy i roztworem sondy, a następnie opuść jedną krawędź szkiełka podstawowego, umożliwiając kontakt z roztworem hybrydyzacyjnym. Kontynuuj opuszczanie, aż szkiełko zakrywy przywrze do szkiełka podstawowego dzięki napięciu powierzchniowemu. Odwróć szkiełko.
- Umieść szkiełko w kasecie do hybrydyzacji (Telechem), rozgrzanej wstępnie do 45°C, i dodaj 10 µL wody do dolnego rowka (aby kontrolować wilgotność podczas hybrydyzacji).
- Uszczelnij kasetę i inkubuj przez 36 - 40 godzin w temperaturze 45°C.
PRANIE MATRYCY
Uwaga: Wszystkie roztwory do płukania mają pH 7.0
Kluczowym etapem jest wyjęcie szkiełka z kasety do hybrydyzacji. DIG Easy szybko krystalizuje w temperaturze pokojowej. Szkiełko należy natychmiast zanurzyć w roztworze płuczącym i usunąć szkiełko nakrywkowe.
- Przed otwarciem komory do hybrydyzacji nalać do słoika Coplina około 60 mL roztworu płuczącego 0.1XSSC, 0.1%SDS (pH 7.0, 45°C).
- Otworzyć komorę, umieścić preparat w roztworze płuczącym i zdjąć szkiełko nakrywkę (powinno ono samo zsunąć się z powierzchni).
- Przepłukać preparat 3 razy w roztworze 0.1XSSC + 0.1%SDS w temperaturze 45°C przez 1 minutę przy każdym cyklu, cały czas mieszając.
- Przepłukać preparat 3 razy w świeżym roztworze 0.1XSSC*. Nie powinny być widoczne żadne pęcherzyki pozostałe po płukaniu w SDS.
*Preparaty mogą pozostać w końcowym roztworze płuczącym do momentu rozpoczęcia wirowania i skanowania (~15 minut). - Wirować preparat w probówce Falcon 50 mL z prędkością 700 g przez 3 minuty.
- Niezwłocznie przeskanować preparaty (intensywność sygnału będzie z czasem malała).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Słaba jakość DNA nie zapewni prawidłowego profilu hybrydyzacji. Przed rozpoczęciem eksperymentu hybrydyzacyjnego niezbędne jest upewnienie się, że DNA próbki oraz DNA referencyjne są wolne od zanieczyszczeń, takich jak fenol, RNA, sole itp., które mogą zakłócić etap znakowania za pomocą random primerów. Na przykład nie zaleca się resuspensji DNA w buforze Tris-EDTA (TE) zamiast w wodzie, ponieważ wysokie stężenie soli może hamować reakcję znakowania. Zalecamy ocenę jakości DNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop w celu p...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Pragniemy podziękować członkom zespołu Wan Lam Lab BAC Array, w szczególności Miwie Suzuki i Bryanowi Chi, za przygotowanie tego artykułu. Praca ta była finansowana ze środków Canadian Institutes for Health Research, Genome Canada/Genome British Columbia oraz z grantu NIH/NIDCR RO1 DE15965-01.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Bufor Klenow 5X | Odczynnik | Promega Corp. | ||
| Losowe oktamery | Odczynnik | Alpha DNA | ||
| Mieszanina dNTP 10X | Odczynnik | Promega Corp. | 2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP | |
| dCTP znakowany Cy-3 | Odczynnik | GE Healthcare | ||
| dCTP znakowany Cy-5 | Odczynnik | GE Healthcare | ||
| Referencyjne ludzkie DNA genomiczne | Odczynnik | Novagen, EMD Millipore | Przykład możliwego standardu referencyjnego | |
| Klenow | Odczynnik | Promega Corp. | ||
| Kolumna YM-30 | Odczynnik | EMD Millipore | ||
| DNA Cot-1 | Odczynnik | Invitrogen | ||
| DIG Easy | Odczynnik | Roche Group | ||
| Sfragmentowane DNA spermiału śledzia | Odczynnik | Promega Corp. | ||
| Kryształy zakrywkowe | Odczynnik | Fisher Scientific | 22mm x 60mm | |
| Kaseta do hybrydyzacji | Narzędzie | Telechem |
Bibliografia
- Lockwood, W. W., Chari, R., Chi, B., Lam, W. L. Recent advances in array comparative genomic hybridization technologies and their applications in human genetics. European Journal of Human Genetics. 14, 139-1x`48 (2006).
- Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Watson, S. K., deLeeuw, R. J., Chi, B., Coe, B. P., Snijders, A., Albertson, D. G., Pinkel, D., Marra, M. A., Ling, V., MacAulay, C., Lam, W. L. A tiling resolution DNA microarray with complete coverage of the human genome. Nature Genetics. 36, 299-303 (2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Ishkanian, A. S., Malloff, C. A., Lam, W. L. Methods for high throughput validation of amplified fragment pools of BAC DNA for constructing high resolution CGH arrays. BMC Genomics. 5, 6(2004).
- Watson, S. K., DeLeeuw, R. J., Horsman, D. E., Squire, J. A., Lam, W. L. Cytogenetically balanced translocations are associated with focal copy number alterations. Human Genetics. 120, 795-805 (2007).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., MacAulay, C., Lam, W. L. SeeGH -- a software tool for visualization of whole genome array comparative genomic hybridization data. BMC Bioinformatics. 5, 13(2004).
- Chi, B., DeLeeuw, R. J., Coe, B. P., Ng, R. T., MacAulay, C., Lam, W. L. MD-SeeGH: a platform for integrative analysis of multi-dimensional genomic data. BMC Bioinformatics. 9, 243(2008).
- Coe, B. P., Ylstra, B., Carvalho, B., Meijer, G. A., Macaulay, C., Lam, W. L. Resolving the resolution of array CGH. Genomics. 89, 647-653 (2007).
- Garnis, C., Coe, B. P., Lam, S. L., MacAulay, C., Lam, W. L. High-resolution array CGH increases heterogeneity tolerance in the analysis of clinical samples. Genomics. 85, 790-793 (2005).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
