Techniczna demonstracja porównawczej hybrydyzacji genomowej całego genomu

Summary

Ten film jest techniczną demonstracją protokołu hybrydyzacji dla całego genomu układającego ścieżkę CGH, który skanuje cały ludzki genom przy użyciu tylko 25-100 ng DNA, które można wyizolować z różnych źródeł, w tym z archiwalnego materiału utrwalonego w formalinie.

Abstract

Porównawcza hybrydyzacja genomowa (tablica CGH) to metoda wykrywania zysków i strat segmentów DNA lub dawek genów w genomie ¹. Ostatnie postępy w tej technologii umożliwiły porównanie całych genomów w wysokiej rozdzielczości w celu identyfikacji zmian genetycznych w nowotworach i innych chorobach genetycznych ². Macierz SMRT (Sub-Megabase Resolution Tiling-set Array) składa się z zestawu około trzydziestu tysięcy nakładających się na siebie klonów sztucznych chromosomów bakteryjnych (BAC), które obejmują ludzki genom w segmentach ~100 kilozasad (kb) ². Te cele BAC są indywidualnie syntetyzowane i wykrywane w dwóch egzemplarzach na pojedynczym szklanym szkiełku ^2-4. Array CGH opiera się na zasadzie hybrydyzacji konkurencyjnej. Próbka i referencyjne DNA są różnicowo znakowane barwnikami fluorescencyjnymi cyjaniny-3 i cyjaniny-5 i hybrydyzowane z matrycą. Po okresie inkubacji niezwiązane próbki są wypłukiwane ze szkiełka, a matryca jest obrazowana. Do przetwarzania dużej ilości zebranych danych wykorzystywany jest ogólnodostępny pakiet oprogramowania o nazwie SeeGH (www.flintbox.ca) - pojedynczy eksperyment generuje 53 892 punkty danych. SeeGH wizualizuje stosunek intensywności sygnału log2 między 2 próbkami w każdym celu BAC, który jest wyrównany pionowo z pozycją chromosomów ^5,6. Macierz SMRT może wykrywać zmiany tak małe, jak 50 kb w rozmiarze ⁷. Macierz SMRT może wykrywać różne zdarzenia rearanżacji DNA, w tym przyrosty, ubytki DNA, amplifikacje i homozygotyczne delecje. Unikalną zaletą matrycy SMRT jest to, że można wykorzystać DNA wyizolowane z próbek zatopionych w parafinie utrwalonej w formalinie. W połączeniu z niskimi wymaganiami wejściowymi nieamplifikowanego DNA (25-100 ng), pozwala to na profilowanie cennych próbek, takich jak te powstałe w wyniku mikrodysekcji ^7,8. Przypisuje się to dużemu rozmiarowi każdego celu hybrydyzacji BAC, który umożliwia wiązanie wystarczającej ilości znakowanych próbek do wytworzenia sygnałów do wykrycia. Kolejną zaletą tej platformy jest tolerancja niejednorodności tkanek, co zmniejsza konieczność żmudnego mikrodysekcji tkanek ⁸. Ten protokół wideo jest samouczkiem krok po kroku, od znakowania wejściowego DNA do pozyskiwania sygnału dla całej ścieżki kafelkowania genomu w macierzy SMRT.

Protocol

ETYKIETOWANIE SONDY

Uwaga: ogranicz ekspozycję barwników Cye na światło przez cały czas (można to osiągnąć pracując w zaciemnionym miejscu lub osłaniając rurki osłoną, taką jak folia aluminiowa)

1. Łączenie:
   (Ustaw 1 probówkę reakcyjną dla odniesienia i 1 probówkę reakcyjną dla próbki)
   • DNA (25-400 ng)
   • 5 μL buforu 5X losowych starterów (Stężenie końcowe: 5X bufor Promega Klenow i 7 μg/ μL losowych oktamerów)
   • Rozcieńczyć do 17,0 μl całkowitej objętości destylowanym_H2O
2. Gotować przez 10 minut w temperaturze 100°C. Natychmiast przelać na lód na 1 minutę.
3. Dodaj 4 μl mieszanki 10X dNTP (2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP).
4. Dodaj barwniki CyeDyes:
   • Dodać 2 μl (2 nmole) dCTP znakowanego Cy-3 do próbki DNA
   • Dodaj 2 μl (2 nmole) dCTP znakowanego Cy-5 do referencyjnego DNA (np. ludzkiego genomowego DNA Novagen)
5. Dodać 2,5 μl leku Klenow (9 j/μl, Promega ) i wymieszać.
6. Inkubować w temperaturze 37°C przez noc* (~18 godzin).
   
   *Czas hybrydyzacji przez noc można dostosować w zakresie od 14 do 24 godzin bez negatywnego wpływu na proces etykietowania, aby dopasować go do harmonogramu laboratoryjnego.

CZYSZCZENIE PRÓBKI

(Połączone czyszczenie sondy i przygotowanie do hybrydyzacji)

1. Korzystanie z kolumny Microcon YM-30:
   • Dodać 100 μl DNA Cot-1 (1 μg/μl) do kolumny. Nie dotykać membrany końcówką pipety.
   • Połącz reakcje (odniesienie i próbkę) i dodaj do kolumny.
   • Umieść kolumnę w dołączonej tubie i wiruj z prędkością 13000 g przez 10 minut.
   • Dodać 200 μl destylowanego H₂0 do membrany i powtórzyć wirowanie do prania.
   • Wyrzuć probówkę i dodaj 45 μl roztworu do hybrydyzacji: (Roche DIG Easy)
   Opcjonalnie: dodać 5 μl DNA nasienia nasienia śledzia (jednostka 10 μg/μL, Promega)
   
   • Odwróć Microcon, umieść w nowej opisanej tubie i wiruj z prędkością 3000 g przez 3 minuty.

OBLICZANIE INKORPORACJI

1. Usuń 1,5 μl i zmierz włączenie fluoroforu za pomocą spektrofotometru NanoDrop.  Używając bufora hybrydyzacji jako ślepego miejsca (DIG Easy), postępuj zgodnie ze wskazówkami wyświetlanymi na ekranie. (W razie potrzeby można odzyskać próbkę z cokołu po pomiarze.)
   
   (Uwaga: Inkorporacje poniżej 3,0 pmol/μL w którymkolwiek kanale wykazały zmienne wyniki.)
   
   
2. Denaturacja w temperaturze 85°C przez 10 minut.
3. Umieść sondę w temperaturze 45°C na 30 minut do 1 godziny (umożliwia wyżarzanie DNA Cot-1).

HYBRYDYZACJA TABLICY

1. Umieścić 44 μl roztworu sondy na szkiełku nakrywkowym (22 mm x 60 mm) (Fisher Scientific). Jeśli to możliwe, umieść szkiełko nakrywkowe na podgrzewaczu do szkiełek lub bloku grzewczym wstępnie podgrzanym do 45°C, aby utrzymać temperaturę.
2. Wyrównaj szkiełko nakrywkowe i roztwór sondy, opuść jedną krawędź szkiełka, umożliwiając kontakt z roztworem hybrydyzacyjnym. Kontynuuj obniżanie, aż szkiełko nakrywkowe zostanie przymocowane do szkiełka z napięciem powierzchniowym. Odwróć suwak.
3. Umieść szkiełko w kasecie do hybrydyzacji (Telechem), wstępnie podgrzanej do 45°C i dodaj 10 μl wody do dolnego rowka (w celu kontrolowania wilgotności podczas hybrydyzacji).
4. Uszczelnić kasetę i inkubować przez 36 - 40 godzin w temperaturze 45°C.

MYCIE TABLICY

Uwaga: Wszystkie roztwory do mycia mają pH 7,0

Usunięcie szkiełka z kasety hybrydyzacyjnej jest krytyczne. DIG Easy szybko krystalizuje w temperaturze pokojowej. Szkiełko należy natychmiast zanurzyć, a szkiełko nakrywkowe usunąć w roztworze myjącym.

1. Dodaj około 60 ml roztworu myjącego 0,1XSSC, 0,1% SDS (pH 7,0, 45°C) do słoika Coplin przed otwarciem komory hybrydyzacyjnej.
2. Otwórz komorę, dodaj szkiełko do roztworu do przemywania i usuń szkiełko nakrywkowe (powinno się zsunąć).
3. Umyj szkiełko 3 razy w 0,1XSSC + 0,1% SDS w temperaturze 45°C przez 1 minutę każdy z mieszaniem.
4. Opłucz szkiełko 3 razy w świeżym 0,1XSSC*. Nie powinny być widoczne żadne resztki pęcherzyków z prania SDS.
   
   *Szkiełka mogą pozostać w końcowym roztworze do mycia, aż będą gotowe do odwirowania i skanowania (~15 minut). 
   
   
5. Odwirować szkiełko w 50 ml probówkach Falcon o masie 700 g przez 3 minuty.
6. Natychmiast zeskanuj slajdy (intensywność sygnału zmniejszy się z czasem).

Discussion

Słabej jakości DNA nie zapewni dobrego profilu hybrydyzacji. Konieczne jest upewnienie się, że próbka i referencyjne DNA są wolne od zanieczyszczeń, takich jak fenol, RNA, sól itp., które mogą zakłócać losowy etap znakowania pierwotnego przed rozpoczęciem eksperymentu hybrydyzacji. Na przykład ponowne zawieszenie DNA w Tris - EDTA (TE) zamiast w wodzie nie jest zalecane, ponieważ wysokie stężenie soli może hamować reakcję znakowania. Zalecamy oznaczenie jakości DNA za pomocą spektrofotometru Nanodrop w celu zmierzenia...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5X Odczynnik buforowy Klenow		Promega Corp.
Losowy odczynnik oktamerów		Alpha DNA
10X dNTP mix	Odczynnik	Promega Corp.		2mM dATP, dGTP, dTTP, 1.2mM dCTP
Cy-3 znakowany odczynnik dCTP		Healthcare
Cy-5 znakowany dCTP	Odczynnik	GE Healthcare
Human Genomic DNA Reference	Reagent	Novagen, EMD Millipore		Przykład możliwego odniesienia
Odczynnik Klenow		Promega Corp.
Odczynnik kolumnowy YM-30		EMD Millipore
Cot-1	Odczynnik	Invitrogen
DIG Easy	Odczynnik	Group
Sheared Herring DNA		Promega Corp.
Odczynnik do szkiełek nakrywkowych		Fisher Scientific		22mm x 60mm
Kaseta do hybrydyzacji		Telechem