Przeżywalna operacja stereotaktyczna u gryzoni

Podsumowanie

Monitorowanie poziomów neurotransmiterów pozakomórkowych w określonych obszarach mózgu swobodnie poruszających się zwierząt dostarcza wiedzy na temat związku między uwalnianiem neurotransmiterów a zachowaniem. Mikrodializa in vivo w połączeniu z detekcją elektrochemiczną zapewnia doskonałą rozdzielczość anatomiczną i chemiczną, a także informacje o tym, w jaki sposób podstawowa neurotransmisja ulega zmianom pod wpływem manipulacji farmakologicznych lub fizjologicznych.

Streszczenie

Zdolność do pomiaru podstawowych pozakomórkowych poziomów neurotransmiterów w mózgu przebudzonych zwierząt pozwala na określenie skutków różnych wyzwań systemowych (farmakologicznych lub fizjologicznych) dla OUN. Na przykład można bezpośrednio zmierzyć, w jaki sposób projekcje dopaminergiczne w śródmózgowiu zwierzęcia reagują na leki uwalniające dopaminę, takie jak d-amfetamina, lub na bodźce naturalne, np. pokarm. W tym filmie pokazujemy, jak implantować kaniule prowadzące skierowane do konkretnych obszarów mózgu szczura, jak wprowadzać i implantować sondę do mikrodializy oraz jak wykorzystać wysokosprawną chromatografię cieczową sprzężoną z detekcją elektrochemiczną (HPLC-EC) do pomiaru pozakomórkowych poziomów utlenialnych neurotransmiterów i metabolitów. Precyzyjne miejscowe podawanie leków za pomocą sondy do mikrodializy umożliwia szczegółowe badania nad specyficznością miejsca działania w mechanizmie działania związku. Technika ta charakteryzuje się doskonałą rozdzielczością anatomiczną i chemiczną, ale jedynie umiarkowaną rozdzielczością czasową, ponieważ próbki z mikrodializy są zazwyczaj przetwarzane co 20-30 minut, aby zapewnić wykrywalne poziomy neurotransmiterów. Komplementarne narzędzia ex vivo (np. elektrofizjologia plastrów mózgu i hodowli komórkowych) mogą pomóc w monitorowaniu neurotransmisji w czasie rzeczywistym.

Protokół

Podsumowanie

Myszy C57BL/6J w średnim wieku dwóch miesięcy lub odpowiedniki, bądź szczury Sprague Dawley w średnim wieku trzech miesięcy lub odpowiedniki, są znieczulane ketaminą (60 mg/kg i.p. dla szczurów; 100 mg/kg i.p. dla myszy) i ksylazyną (10 mg/kg, i.p. dla obu gatunków). Sedację monitoruje się za pomocą łagodnego odruchu wycofania po uciśnięciu palca stopy, opisanego przez Walantusa i wsp.(JoVE, 6, 2007) oraz Szota i wsp.(JoVE, 9, 2007).  Termoregulację zapewnia mata grzewcza sterowana termostatem (ALA Instruments Inc.), a temperaturę monitoruje się za pomocą termometru rektalnego. Przed nacięciem skórę głowy ogala się z futra i odkaża jodyną. Po wykonaniu nacięcia skóry (2 cm długości dla szczurów, 1 cm dla myszy) i usunięciu wszystkich tkanek miękkich z powierzchni czaszki, wyznacza się miejsce umieszczenia kaniuli prowadzącej w odniesieniu do bregmy. W czaszce wierci się otwór o średnicy 6 mm za pomocą wiertarki akumulatorowej przeznaczonej do chirurgii gryzoni (Fine Science Tools, Inc.). Należy zachować ostrożność, aby wiertło nie przebiło opon mózgowych ani naczyń krwionośnych. W czaszce implantuje się obustronnie prowadnice z 21-gauge stali nierdzewnej o długości 5 mm, prowadzące do tylnego jądra półleżącego, grzbietowego prążkowia lub kory przedczołowej. Współrzędne stereotaktyczne ustala się zgodnie z Franklin i Paxinos, 1997 (The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press) lub Paxinos i Watson, 2006 (The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates, Academic Press). Implanty stabilizuje się cementem dentystycznym. Na koniec zabiegu podaje się dawkę objętościową mleczanu Ringera lub soli fizjologicznej 0,9% (5 ml SC u szczurów i 1 ml SC u myszy, po ogrzaniu płynów do normalnej temperatury ciała), aby zapobiec odwodnieniu. Buprenorfinę (0,1-0,5 mg/kg SC) podaje się dwa razy dziennie, a następnie w razie potrzeby, jeśli zwierzę wydaje się odczuwać ból. W przypadku wystąpienia infekcji pooperacyjnych stosuje się miejscowe leczenie antybiotykowe (maść bacytraminowa) oraz systemowe leczenie antybiotykowe (penicylina 100 000 IU/kg IM co 12 godzin przez pierwsze 48 godzin po operacji).

Po operacji zwierzęta są przetrzymywane w indywidualnych klatkach z dostępem do pokarmu i wody ad libitum. Przed rozpoczęciem mikrodializy i eutanazją przewiduje się co najmniej tydzień na rekonwalescencję. Po powrocie do zdrowia po zabiegu zwierzęta są przenoszone do klatek do mikrodializy, a sondy do mikrodializy są wprowadzane i cementowane w prowadnicach zainstalowanych podczas operacji. Wprowadzenie sondy nie powoduje bólu ani dyskomfortu, ponieważ sonda omija skórę, mięśnie i tkankę oponową dzięki zastosowaniu prowadnicy. W związku z tym wprowadzanie sondy odbywa się bez znieczulenia, co pozwala uniknąć efektów znieczulenia na neurochemię lub zachowanie. Pozostawiamy sondy do stabilizacji na 12 godzin, a następnie rozpoczynamy pobieranie próbek co 30 minut przez kolejne 8-12 godzin, w zależności od eksperymentu. Monitorujemy zachowanie lokomotoryczne zwierzęcia za pomocą fotokomórek lub poprzez manualną rejestrację ruchu przez eksperymentatora. Próbki mikrodializatu są wstrzykiwane do urządzenia do wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detekcją elektrochemiczną (HPLC-EC) w celu detekcji i analizy neurochemicznej. Analizujemy wpływ na podstawową neurochemię oraz zachowanie lokomotoryczne. Na koniec eksperymentu zwierzę jest uśmiercane poprzez podanie przedawki ketaminy systemowej (200 mg/kg i.p.) i ksylazyny (20 mg/kg, i.p.). Następnie serce jest przepłukiwane 0,9% roztworem soli fizjologicznej, a następnie 4% paraformaldehydem. Mózgi są pobierane, mrożone i przecinane wzdłuż toru sondy do mikrodializy w celu weryfikacji prawidłowego umiejscowienia sondy.

Procedura

1. Przygotować instrument stereotaksyczny oraz wszystkie niezbędne materiały. Upewnić się, że obszar i narzędzia są oczyszczone i wysterylizowane.
   
   
2. Ogolić futro maszynką elektryczną. Golić od uszu aż do miejsca pomiędzy oczami, przesuwając maszynkę w różnych kierunkach, aby skutecznie oczyścić obszar z futra. Na ogoloną powierzchnię nanieść povidine/jod, chroniąc przy tym oczy.
   
   
3. Zamocować zwierzę w aparacie stereotaksycznym, wprowadzając pręty uszne do kanałów słuchowych i mocno je dokręcając. Najpierw zamocować jeden pręt w kanale słuchowym, a następnie przytrzymać go i wsunąć drugi pręt. Prawidłowe ustawienie jest osiągnięte, gdy głowa nie może być już poruszana na boki. Zabezpieczyć pysk przednim uchwytem urządzenia stereotaksycznego i upewnić się za pomocą linijki, że głowa jest wypoziomowana. Ustawić linijkę w pozycji pionowej względem platformy instrumentu stereotaksycznego i sprawdzić, czy między linijką a środkiem skóry głowy zwierzęcia znajduje się kąt 90°. Potwierdzić to za pomocą instrumentu stereotaksycznego, jeśli posiada on taką funkcję.
   
   
4. Za pomocą sterylnego skalpela wykonać cięcie przednio-tylne na skórze głowy, rozciągając je od lambda do miejsca pomiędzy oczami zwierzęcia. Użyć wysterylizowanych kleszczyków hemostatycznych do odciągnięcia skóry i utrzymania nacięcia w otwarciu. Za pomocą kilku sterylnych patyczków bawełnianych osuszyć odsłoniętą powierzchnię czaszki.
   
   
5. Umieścić kaniulę prowadzącą w uchwycie, zlokalizować bregma na czaszce i ustawić kaniulę prowadzącą dokładnie nad tym miejscem. Zapisać współrzędne przednio-tylne i boczne. Korzystając z atlasu stereotaksycznego, wyznaczyć od bregma odpowiednie współrzędne niezbędne do umieszczenia sondy. Ustawić kaniulę prowadzącą na właściwe współrzędne, odejmując lub dodając wartości względem bregma. Obniżyć kaniulę prowadzącą aż do kontaktu z czaszką, a następnie zapisać tę współrzędną brzuszną. Zaznaczyć to miejsce na czaszce sterylnym ołówkiem; w tym miejscu wykonane zostanie wiercenie.
   
   
6. Zdjąć kaniulę prowadzącą i wysterylizować wiertło. Ostrożnie wywiercić otwór w miejscu zaznaczenia ołówkiem , aż do przebicia grubości czaszki. Sprawdzić za pomocą kaniuli prowadzącej, czy przechodzi ona przez otwór bez dotykania ścianek. Kontynuować wiercenie i sprawdzanie do momentu, aż kaniula będzie mogła przejść w linii prostej. Po wykonaniu otworu użyć sterylnej igły, aby delikatnie przebić oponę twardą, co umożliwi niezakłócone wprowadzenie kaniuli.
   
   
7. Następnie, za pomocą wiertarki ręcznej, wykonać sześć otworów pod śruby czaszkowe: dwa przed otworem kaniuli, dwa bocznie od otworu kaniuli i dwa z tyłu po bokach. Wysterylizować sześć śrub i umieścić je w czaszce, aż zostaną mocno zakotwiczone.
   
   
8. Oczyścić kaniulę prowadzącą etanolem i solą fizjologiczną, zamontować i powoli opuścić do właściwej współrzędnej brzusznej. Upewnić się, że ścianki nie dotykają czaszki i że kaniula wchodzi idealnie pionowo.
   
   
9. Umieścić śrubę kotwiczącą przyśrodkowo i za tylnymi śrubami czaszkowymi, przytrzymując ją pęsetą. Przygotować cienką warstwę ciekłego cementu stomatologicznego i za pomocą sterylnej szpatułki pokryć kaniulę prowadzącą, śruby oraz resztę czaszki. Przygotować kolejną, tym razem gęstszą porcję i całkowicie pokryć obszar, kaniulę oraz śrubę kotwiczącą w stopniu zapewniającym stabilne mocowanie.
   
   
10. Gdy cement zacznie gęstnieć, ale przed jego całkowitym utwardzeniem, oddzielić skórę od kopułki cementowej i uformować ją szpatułką, aby upewnić się, że nasadka z cementu jest gładka z każdej strony i nie będzie później podrażniać skóry.
    
    
11. Pozostawić cement stomatologiczny do całkowitego wyschnięcia przed zdjęciem zwierzęcia z aparatu. Usunąć kleszczyki hemostatyczne. Nanieść bacitracynę wokół całej nasadki cementowej.
    
    
12. Po zdjęciu zwierzęcia z instrumentu stereotaksycznego wstrzyknąć mu 0.25 ml penicyliny IM (domięśniowo), a następnie 1 ml soli fizjologicznej SC (podskórnie).
    
    
13. Umieścić zwierzę we własnej klatce i monitorować je do czasu odzyskania przytomności, przed powrotem do pomieszczenia w celu rekonwalescencji.
    
    
14. Monitorować zwierzęta do momentu wybudzenia z narkozy w dniu operacji oraz codziennie po zabiegu, aż do końca eksperymentu, pod kątem objawów infekcji oraz oceny bólu/stresu. Obejmuje to weekendy i święta. Mała aktywność spontaniczna, wokalizacja stresowa podczas manipulacji, zgarbiona postawa, biegunka, obrzęk i wydzielina w obszarze mocowania głowy oraz brak jedzenia/picia są objawami bólu i stresu. Buprenorfinę (0.1-0.5mg/kg SC) podaje się dwa razy dziennie, a następnie w razie potrzeby, jeśli zwierzę wydaje się odczuwać ból. Miejscowe leczenie antybiotykowe (maść bacitracynowa) i ogólnoustrojowe leczenie antybiotykowe (penicylina 100,000 IU/kg IM co 12 godzin przez pierwsze 48 godzin po operacji) są stosowane w przypadku wystąpienia infekcji pooperacyjnych. Jeśli którykolwiek z tych objawów utrzymuje się po podaniu buprenorfiny, dodatkowych płynów i leczenia antybiotykowego w ciągu 12 godzin od operacji, zwierzę zostaje poddane eutanazji.

 

Dyskusja

Mikrodializa in vivo jest preferowanym narzędziem do pomiaru wielu neuroprzekaźników i metabolitów w określonych obszarach mózgu żywego zwierzęcia. Monitoruje ona jednak jedynie pozakomórkowe poziomy neurochemikaliów i nie zapewnia rozdzielczości czasowej pozwalającej na monitorowanie egzocytozy neuroprzekaźników w czasie rzeczywistym. Dzięki zastosowaniu wersji tej techniki nazywanej „net-flux” (przepływem netto) możliwe jest obliczenie rzeczywistego stężenia neuroprzekaźnika w danym miejscu, co z kolei pozwala na dokła...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Materiały opisano w dokumencie z protokołem.