Obrazowanie efektorowych limfocytów T pamięci w uchu po indukcji adoptywnego DTH

Summary

Tutaj demonstrujemy metodę wywoływania i rejestrowania postępu opóźnionej reakcji nadwrażliwości typu (DTH) w uchu szczura. Następnie przedstawiono przygotowanie tkanki ucha szczura do dwufotonowego obrazowania odpowiedzi efektorowej / pamięciowej limfocytów T.

Abstract

Nadwrażliwość typu opóźnionego (DTH) jest reakcją immunologiczną, w której głównymi graczami są limfocyty T ^efektorowe CCR7 / pamięci. Tutaj demonstrujemy metodę indukowania i rejestrowania postępu reakcji DTH w uchu szczura. Następnie przedstawiono sposób przygotowania tkanki ucha szczura do obrazowania dwufotonowego odpowiedzi komórek T efektora / pamięci CCR7.

Adopcja DTH jest indukowana przez dootrzewnowe wstrzyknięcie znakowanej GFP ^{linii komórek T} CCR7 / komórek pamięci specyficznych dla komórek jajowych (Beeton, C J. Visualized Experiments, Issue 8). Komórki następnie pozostawia się szczurowi do równowagi przez 48 godzin przed prowokacją poprzez wstrzyknięcie do jednego ucha soli fizjologicznej (ucho kontrolne), a do drugiego mieszanki 1:1 komórek jajowych i jajowych sprzężonych z Texas-Red (Ova-TR), aby umożliwić wizualizację rezydentnych komórek prezentujących antygen.

Opisujemy metodę przygotowania tkanek przydatną do obrazowania ruchliwości komórek w głębokiej warstwie skóry właściwej podczas odpowiedzi immunologicznej, w połączeniu z wizualizacją włókien kolagenowych przez generowanie drugiej harmonicznej. Tkanka ucha jest cięta na kwadraty o wymiarach 5 x 5 mm (im większy, tym lepiej) i montowana na plastikowych szkiełkach nakrywkowych za pomocą Vetbond™, które są następnie zabezpieczane za pomocą smaru silikonowego w komorze obrazowania i poddawane fuzji za pomocą pożywki do hodowli tkankowej z pęcherzykami tlenu w temperaturze 37°C.

Protocol

Wprowadzenie adopcyjnego DTH

Proszę zobaczyć artykuł JoVE: Indukcja i monitorowanie adopcyjnej nadwrażliwości typu opóźnionego u szczurów
Christine Beeton, George K. Chandy
Wydział Fizjologii i Biofizyki, Uniwersytet Kalifornijski, Irvine
J. Eksperymenty wizualizowane, wydanie 8

Tutaj zmodyfikowaliśmy ten protokół, używając antygenu (albuminy jaja kurzego) sprzężonego z Texas-Red w stosunku 1:1 z nieznakowanym antygenem, aby umożliwić wizualizację komórek prezentujących antygen fagocytarny.

Pobieranie tkanek ucha

1. Poddaj szczura eutanazji w pożądanym punkcie czasowym zgodnie z procedurami opisanymi w zatwierdzonym protokole dla zwierząt. W tym przypadku stosujemy przedawkowanie środka znieczulającego, izofluranu. Odbywa się to w zamkniętym pojemniku umieszczonym w dobrze wentylowanym kapturze. Upewnij się, że zwierzę jest martwe przez ścięcie głowy, otwierając klatkę piersiową i przecinając serce.
   
   
2. Za pomocą dużych nożyczek usuń ucho jednym cięciem, jak najbliżej ciała zwierzęcia (ryc. 1).
   
   
   Rysunek 1. Usunięcie ucha szczura
   
   
3. Umieść ucho w stożkowej probówce o pojemności 15 ml zawierającej ~10 ml lodowatego środka 1x PBS lub RPMI-1640. Próbki tkanek należy przechowywać na lodzie, dopóki nie będzie się gotowym do przygotowania tkanki do obrazowania.
   
   
4. Zobrazuj tkankę tak szybko, jak to możliwe; odkryjemy jednak, że 1 do 2 godzin na lodzie nie ma zauważalnego wpływu na ruchliwość komórek w tkance w porównaniu z tkanką pobraną i zobrazowaną natychmiast.

Przygotowanie tkanek do obrazowania

I. Usuwanie warstwy naskórka i skóry

właściwej

*Uwaga: Głęboka warstwa skóry musi pozostać nienaruszona. Jeśli zrobisz to prawidłowo, duże naczynia krwionośne pozostaną nienaruszone, a chrząstka ucha nie zostanie odsłonięta. Jest to trudna technika, zwłaszcza gdy nie ma stanu zapalnego (warunki kontrolne) i pomocne jest użycie mikroskopu preparacyjnego.

1. Umieść zarówno tkankę, jak i pożywkę ze stożkowej probówki w naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 10 cm.
   
   
2. Dłońmi w rękawiczkach delikatnie przytrzymuj ucho szczura za czubek ucha (dystalny) grzbietową stroną ucha skierowaną do góry (ryc. 2).
   
   
   Rysunek 2. Przyciąć sierść z ucha
   
   
3. Trzymając kciuk na czubku ucha, ustabilizuj tkankę, używając końcówki zamkniętych nożyczek Dumont #5, aby oddzielić skórę właściwą od głębokiej skóry właściwej. Alternatywnie, jeśli krawędź ucha ma zwis skóry/głębokiej skóry właściwej, można ją chwycić kleszczami i delikatnie pociągnąć, aby oddzielić ją od tkanki pod spodem (ryc. 3).
   
   
   Rysunek 3. Usunięcie górnej części skóry właściwej
   
   
4. Po oddzieleniu niewielkiego obszaru skóry od leżącej pod nim tkanki powtórz kroki oddzielania na przemian, używając nożyczek do cięcia między warstwami skóry i kleszczy, aby delikatnie usunąć i odkleić usuniętą skórę.
   
   
5. Odsłoń obszar tkanki ucha o wymiarach 5 x 5 mm lub większy, który znajduje się co najmniej 3 mm od początkowego miejsca wstrzyknięcia antygenu (ryc. 4).
   
   
   Rysunek 4. Tkanka poddana do obrazowania
   

II. Zabezpieczanie tkanki do etapu obrazowania

1. Przytnij plastikowe szkiełko nakrywkowe do rozmiaru nieco większego niż przygotowana chusteczka.
   
   
2. Rozprowadź cienką warstwę bezpiecznego dla tkanek kleju 3M Vetbond™ na szkiełku.
   
   
3. Chwyć róg przygotowanej chusteczki (w miejscu, w którym prawdopodobnie nie zrobisz obrazu), wyjmij z nośnika i przetrzyj spód chusteczki papierem do soczewek lub chusteczką Gym, aby usunąć nadmiar pożywki.
   
   
4. Przyłóż krawędź chusteczki do szkiełka pokrytego klejem (Vetbond utwardza się natychmiast na mokrej chusteczce). Delikatnie rozciągnij tkankę płasko, tak aby przeciwległy koniec był ostatnim, który dotyka szkiełka (Rysunek 5)
   
   
   Rysunek 5. Zamontuj chusteczkę do szkiełka nakrywkowego
   
   
5. Utwardź Vetbond™, odwracając próbkę/szkiełko tkanki i zanurzając ją w zbiorniku pożywki tak, aby tkanka i szkiełko były skierowane w dół i mniej więcej pod kątem 45 stopni. Trzymanie tkanki do góry nogami pod kątem pomaga zapobiec utwardzaniu się nadmiaru kleju na odsłoniętej powierzchni tkanki. Klej na powierzchni tkanki zablokuje laser (ryc. 6).
   
   
   Rysunek 6. Utwardź klej tkankowy vetbond, zanurzając go w mediach
   
   Uwaga: Kroki 2-5 mogą wymagać trochę praktyki, aby je opanować. Spróbuj poćwiczyć z wyrzuconymi lub dodatkowymi kawałkami tkanek przed pierwszą próbą.
   
   
6. Nanieś niewielką ilość smaru silikonowego na spód szkiełka.
   
   
7. Umieść szkiełko w komorze perfuzyjnej. Upewnij się, że podłoże perfuzyjne płynie w temperaturze 37°C i jest natlenione przed dodaniem tkanki. Delikatnie dociśnij krawędzie szkiełka, uszczelniając smarem silikonowym dno komory perfuzyjnej a plastikową szkiełko nakrywkowe.

III. Obrazowanie dwufotonowe

1. Korzystając ze światła przechodzącego w jasnym polu, skup się na górnej części tkanki. Wyłącz wszystkie światła.
   
   
2. Włącz laser, PMT zgodnie z wymaganiami systemu mikroskopu wielofotonowego.
   
   
3. Generacja drugiej harmonicznej (SHG) w wysoce uporządkowanych białkach włóknistych (kolagen i miozyna) wytwarza sygnał o połowie długości fali lasera wzbudzającego. Używamy wzbudzenia przy 900 nM, prowadzącego do SHG przy 450 nm, które można zobrazować za pomocą "niebieskiego" kanału mikroskopu. Generowanie SHG jest procesem nieliniowym (dwufotonowym), a zatem zapewnia optyczny efekt "przekroju" podobny do wzbudzenia fluorescencji dwoma fotonami. Szczytowa wydajność SHG występuje, gdy fibryle są prostopadłe do lasera, podczas gdy włókienka biegnące równolegle nie zostaną uwidocznione. ¹
   
   
4. Zlokalizuj dobry obszar obrazowania z dużą ilością komórek, ustaw obszar akwizycji tak, aby większość komórek znajdowała się w środku i rozpocznij obrazowanie. Uwaga: W reakcjach DTH często stwierdza się, że limfocyty T i inne nacieki komórkowe są skoncentrowane razem, podczas gdy inne obszary są pozbawione komórek naciekających². W związku z tym przeszukanie tkanki może zająć trochę czasu, aby znaleźć najlepszy obszar do zobrazowania.
   
   
5. Sprawdź żywotność komórek, oceniając prędkość i polaryzację komórek podczas obrazowania. Użyj najniższej mocy lasera, która zapewnia akceptowalną jakość obrazu, aby zminimalizować uszkodzenia fotograficzne.
   
   
6. W razie potrzeby zamień nowy preparat tkankowy.