W niniejszym materiale prezentujemy metodę indukowania oraz rejestrowania przebiegu reakcji nadwrażliwości opóźnionej (DTH) w uchu szczura. Następnie demonstrujemy przygotowanie tkanki ucha szczura do obrazowania dwufotonowego odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie limfocytów T pamięci efektorowej w uchu po indukcji adoptywnej reakcji nadwrażliwości opóźnionej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Opóźniona nadwrażliwość (DTH) to reakcja immunologiczna, w której główną rolę odgrywają efektorowe i pamięciowe limfocyty T CCR7-. W niniejszym materiale prezentujemy metodę indukowania i rejestrowania przebiegu reakcji DTH w uchu szczura. Następnie przedstawiamy sposób przygotowania tkanki ucha szczura do obrazowania dwufotonowego odpowiedzi efektorowych i pamięciowych limfocytów T CCR7-.
Adaptacyjną reakcję nadwrażliwości opóźnionej (DTH) indukuje się poprzez doszpikowe wstrzyknięcie znakowanej GFP linii efektorowych/pamięciowych limfocytów T specyficznych dla Ova i CCR7- (Beeton, C J. Visualized Experiments, Issue 8). Następnie pozostawia się komórki na 48 godzin w organizmie szczura w celu ich equilibracji, po czym przeprowadza się próbę prowokacyjną, wstrzykując do jednego ucha sól fizjologiczną (ucho kontrolne), a do drugiego mieszaninę Ova oraz Ova skoniugowanego z Texas-Red (Ova-TR) w stosunku 1:1, co umożliwia wizualizację rezydentnych komórek prezentujących antygen.
Opisujemy metodę przygotowania tkanki przydatną do obrazowania ruchliwości komórek w głębokiej warstwie skóry właściwej podczas odpowiedzi immunologicznej, w połączeniu z wizualizacją włókien kolagenu za pomocą generacji drugiej harmonicznej. Tkanka ucha jest wycinana w kwadraty o wymiarach 5 x 5 mm (lepiej, jeśli są nieco większe) i montowana na plastikowych szkiełkach nakrywkowych za pomocą Vetbond™, które następnie są mocowane smarem silikonowym w komorze obrazującej i przepłukiwane pożywką hodowlaną nasyconą tlenem w temperaturze 37°C.
Protokół
Indukcja adopcyjnej reakcji nadwrażliwości opóźnionej (DTH)
Prosimy o zapoznanie się z artykułem JoVE: Indukcja i monitorowanie adoptacyjnej nadwrażliwości opóźnionej u szczurów
Christine Beeton, George K. Chandy
Department of Physiology and Biophysics, University of California, Irvine
J. Visualized Experiments, Wydanie 8
W niniejszym przypadku zmodyfikowaliśmy ten protokół, stosując antygen (owalbuminę) sprzężony z Texas-Red w stosunku 1:1 z nieznakowanym antygenem, aby umożliwić wizualizację fagocytujących komórek prezentujących antygen.
Pobieranie tkanki ucha
- Uśmierć szczura w wybranym punkcie czasowym zgodnie z procedurami opisanymi w zatwierdzonym protokole dotyczącym zwierząt. W tej metodzie stosujemy przedawkowanie środka anestetycznego, izofluranu. Zabieg ten wykonuje się w zamkniętym pojemniku umieszczonym w dobrze wentylowanym wyciągu. Potwierdź śmierć zwierzęcia poprzez dekapitację lub otwarcie klatki piersiowej i przecięcie serca.
- Używając dużych nożyczek, usuń ucho jednym cięciem, jak najbliżej ciała zwierzęcia (Rycina 1).
Rycina 1. Usuwanie ucha szczura - Umieść ucho w probówce stożkowej o pojemności 15 ml zawierającej ~10 ml lodowatego 1x PBS lub RPMI-1640. Przechowuj próbki tkanki na lodzie do momentu przygotowania tkanki do obrazowania.
- Wykonaj obrazowanie tkanki jak najszybciej; stwierdziliśmy jednak, że przechowywanie na lodzie przez 1 do 2 godzin nie wywiera zauważalnego wpływu na ruchliwość komórek w tkance w porównaniu do tkanki pobranej i obrazowanej natychmiast.
Przygotowanie tkanek do obrazowania
I. Usunięcie warstwy naskórka i skóry właściwej
*Uwaga: Głęboka warstwa skóry właściwej musi pozostać nienaruszona. Przy prawidłowym wykonaniu duże naczynia krwionośne nie zostaną uszkodzone, a chrząstka ucha nie zostanie odsłonięta. Jest to trudna technika, zwłaszcza w przypadku braku stanu zapalnego (warunki kontrolne), dlatego pomocne jest użycie mikroskopu sekcyjnego.
- Przenieść zarówno tkankę, jak i podłoże z probówki stożkowej do 10 cm naczynia hodowlanego.
- W rękawiczkach delikatnie przytrzymaj ucho szczura za jego końcówkę (część dystalna), stroną grzbietową skierowaną do góry (Rysunek 2).
Rysunek 2. Przycinanie futra z ucha - Kciukiem opierając się na górnej części ucha, unieruchom tkankę, a następnie za pomocą czubka zamkniętych nożyczek Dumont #5 oddziel skórę właściwą od głębokiej warstwy skóry właściwej. Alternatywnie, jeśli krawędź ucha posiada nawis skóry/głębokiej skóry właściwej, można go uchwycić pęsetą i delikatnie odciągnąć, aby oddzielić go od tkanki znajdującej się poniżej (Rysunek 3).
Rysunek 3. Usuwanie górnej warstwy skóry właściwej - Po oddzieleniu niewielkiego obszaru skóry od tkanki podścielającej, powtarzaj kroki separacji, naprzemiennie używając nożyczek do rozcinania warstw skóry właściwej oraz pęsety do delikatnego usuwania i odwarstwiania oddzielonej skóry.
- Odsłoń obszar tkanki ucha o wymiarach 5 x 5 mm lub większy, znajdujący się w odległości co najmniej 3 mm od początkowego miejsca wstrzyknięcia antygenu (Rysunek 4).
Rysunek 4. Tkanka odsłonięta do obrazowania
II. Mocowanie tkanki do stolika obrazującego
- Dotnij plastikową kasetkę do rozmiaru nieco większego niż przygotowana tkanka.
- Rozprowadź cienką warstwę bezpiecznego dla tkanek kleju 3M Vetbond™ na szkiełku.
- Chwyć róg przygotowanej tkanki (w miejscu, którego prawdopodobnie nie będziesz obrazować), wyjmij ją z medium i osusz spód tkanki za pomocą papieru soczewkowego lub chusteczki Kym wipe, aby usunąć nadmiar medium.
- Dotknij krawędzi tkanki szkiełka pokrytego klejem (Vetbond utwardza się natychmiastowo w kontakcie z mokrą tkanką). Delikatnie rozprostuj tkankę na płasko, tak aby przeciwny koniec dotknął szkiełka jako ostatni (Rysunek 5)
Rysunek 5. Montaż tkanki do kasetki - Utwardź Vetbond™, odwracając próbkę tkanki/szkiełko i zanurzając je w zbiorniku z medium w taki sposób, aby tkanka i szkiełko znajdowały się stroną skierowaną w dół pod kątem około 45 stopni. Trzymanie tkanki do góry nogami pod kątem pomaga zapobiec utwardzaniu się nadmiaru kleju na odsłoniętej powierzchni tkanki. Klej na powierzchni tkanki zablokuje laser (Rysunek 6).
Rysunek 6. Utwardzanie kleju do tkanek Vetbond poprzez zanurzenie w medium
Uwaga: Opanowanie kroków 2-5 może wymagać pewnej wprawy. Przed pierwszą próbą warto poćwiczyć na odrzuconych lub dodatkowych fragmentach tkanki. - Nałóż niewielką ilość smaru silikonowego na spód szkiełka.
- Umieść szkiełko w komorze perfuzyjnej. Przed dodaniem tkanki upewnij się, że medium perfuzyjne przepływa, ma temperaturę 37°C i jest natlenione. Delikatnie dociśnij krawędzie szkiełka, tworząc uszczelnienie ze smarem silikonowym między dnem komory perfuzyjnej a plastikową kasetką.
III. Obrazowanie dwufotonowe
- Korzystając z przeświecania w świetle jasnym, ustaw ostrość na górnej powierzchni tkanki. Wyłącz wszystkie źródła światła.
- Włącz laser oraz PMT-y, zgodnie z wymogami systemu mikroskopu wielofotonowego.
- Generacja drugiej harmonicznej (SHG) w silnie uporządkowanych białkach włóknistych (kolagenie i miozynie) wytwarza sygnał o połowie długości fali lasera wzbudzającego. Stosujemy wzbudzenie przy 900 nM, co prowadzi do powstania SHG przy 450 nm, którą można wizualizować za pomocą „niebieskiego” kanału mikroskopu. Generacja SHG jest procesem nieliniowym (dwufotonowym), co zapewnia efekt optycznego „przekroju” podobny do dwufotonowego wzbudzenia fluorescencji. Maksymalna wydajność SHG występuje, gdy włókna są prostopadłe do wiązki lasera, natomiast włókna biegnące równolegle nie będą widoczne1.
- Zlokalizuj odpowiedni obszar do obrazowania z dużą liczbą komórek; ustaw pole akwizycji tak, aby większość komórek znajdowała się w centrum, a następnie rozpocznij obrazowanie. Uwaga: w reakcjach DTH limfocyty T oraz inne nacieki komórkowe są często skoncentrowane w jednym miejscu, podczas gdy inne obszary są pozbawione komórek naciekających2. W związku z tym przeszukiwanie tkanki w celu znalezienia najlepszego obszaru do obrazowania może zająć trochę czasu.
- Sprawdź żywotność komórek, oceniając ich prędkość i polarność podczas obrazowania. Używaj najniższej mocy lasera, która zapewnia akceptowalną jakość obrazu, aby zminimalizować fotouszkodzenia.
- W razie potrzeby wymień preparat tkanki na nowy.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Koo, G. C., et al. Blockade of the voltage-gated potassium channel Kv1.3 inhibits immune responses in vivo. J Immunol. 158, 5120-5128 (1997).
- Gaga, M., Frew, A. J., Varney, V. A., Kay, A. B. Eosinophil activation and T lymphocyte infiltration in allergen-induced late phase skin reactions and classical delayed-type hypersensitivity. J Immunol. 147, 816-822 (1991).
- Flugel, A., Odoardi, F., Nosov, M., Kawakami, N. Autoaggressive effector T cells in the course of experimental autoimmune encephalomyelitis visualized in the light of two-photon microscopy. J Neuroimmunol. 191, 86-97 (2007).
- Kawakami, N., et al. Live imaging of effector cell trafficking and autoantigen recognition within the unfolding autoimmune encephalomyelitis lesion. J Exp Med. 201, 1805-1814 (2005).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1873 (2002).
- Matheu, M. P. B., A, C. G. arcia, Chi, V., Rangaraju, S., Safrina, O., Monaghan, K., Uemura, M. I., Li, D., Pal, S., Monuki, E., Flugel, A., Pennington, M. W., Parker, I., Chandy, G. K., Calahan, M. D. In Situ Imaging of Effector/Memory T Cells During DTH and Suppression by Kv1.3 Channel Block. Immunity. , In Press (2008).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
