Pełny protokół tekstowy dla tej metody eksperymentalnej jest dostępny w <a href="http://www.mrw.interscience.wiley.com/emrw/9780471143031/cp/cpcb/article/cb1110/current/abstract ">Current Protocols in Cellular Biology</a>.

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

montaż jądra in vitro z wykorzystaniem frakcjonowanych ekstraktów z jaj xenopus

Montaż błony jądrowej jest kluczowym etapem cyklu podziału komórkowego; proces ten można odtworzyć in vitro, łącząc chromatynę plemników Xenopus, cytosol oraz lekkie frakcje błonowe. W wyniku tego procesu powstają kompletne jądra, w tym błony jądrowe z kompleksami porowymi, a tak zrekonstytuowane jądra są zdolne do przeprowadzania normalnych procesów jądrowych.

Montaż otoczki jądrowej jest kluczowym etapem cyklu podziału komórkowego; proces ten można zreplikować in vitro, łącząc chromatynę plemników Xenopus, cytosol oraz lekkie frakcje błonowe. Powstają w pełni uformowane jądra, zawierające otoczki jądrowe z kompleksami porów, a tak zrekonstytuowane jądra są zdolne do przeprowadzania prawidłowych procesów jądrowych.

Montaż jądra in vitro z wykorzystaniem frakcjonowanych ekstraktów z jaj Xenopus

Montaż błony jądrowej jest niezbędnym etapem cyklu podziału komórki; proces ten można odtworzyć w probówce, łącząc plemniki Xenopus ...

Ekstrakty z jaj *Xenopus laevis* są użyteczne jako materiał cytoplazmatyczny i organellowy do rekonstrukcji in vitro zdarzeń komórkowych, takich jak montaż jądra oraz import białek jądrowych. Po dodaniu chromatyny DNA plemników do surowych lub frakcjonowanych ekstraktów z jaj XUS, pęcherzyki błonowe obecne w ekstrakcie wiążą się z powierzchnią chromatyny, łączą i włączają komponenty porów jądrowych, tworząc w pełni funkcjonalne syntetyczne jądra. Charakterystyka molekularnych podstaw tych procesów jest następnie możliwa poprzez immunodeplecję ekstraktów oraz edycję białek.Witajcie, nazywam się Marie Cross i jestem doktorantką w laboratorium dr Maureen Power w Departamencie Biologii Komórki na Uniwersytecie Emory w Atlancie w stanie Georgia. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak formować jądra komórkowe in vitro, wykorzystując frakcjonowane ekstrakty z jaj Xenopus. Procedura ta obejmuje następujące etapy: przeprowadzenie reakcji montażu jądra oraz ocenę formowania się jąder.Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć montaż jąder, pobierz alikwot frakcjonowanego cytosolu i dodaj fosfokreatynę z roztworu stokowego 0,2 M do stężenia końcowego 20 mM. Następnie dodaj kinazę kreatynową z roztworu stokowego 5 mg/mL do stężenia końcowego 50 µg/mL.Na koniec dodaj 20 µM ATP, korzystając ze stoku 0,2 M. Następnie dodaj membrany lekkie do cytozolu w rozcieńczeniu 1:10. Przybliża to ilość błony obecną w oryginalnym ekstrakcie surowym.Wymieszaj wszystkie składniki, pipetując ciecz w górę i w dół, aby rozprzestrzenić błony w ekstrakcie. Należy to zrobić przed dodaniem chromatyny plemnikowej. Następnie dodaj chromatynę plemnikową do frakcjonowanego ekstraktu w pożądanej stężeniu i natychmiast wymieszaj ekstrakt z plemnikami, delikatnie pipetując w górę i w dół przy użyciu końcówki z odciętym końcem.Po dodaniu chromatyny plemników do ekstraktu natychmiast zaczyna ona ulegać dekondensacji, kondensować i stawać się podatną na ścinanie. Zazwyczaj reakcje te przeprowadza się w probówkach do wirówek o pojemności 500 µL, przy całkowitej objętości poniżej 100 µL. Ekstrakty z oocytów umożliwiają utworzenie od 8 000 do 9 000.Liczba jąder na mikrolitr; inkubuj mieszaninę od jednej do dwóch godzin w temperaturze pokojowej, aby umożliwić formowanie się jąder. Jądra są wizualizowane przy użyciu barwienia. Po około 30 minutach nowo powstałe jądra będą małe i owalne.DNA jest wciąż dość skondensowany, a jądro powinno wydawać się jednolicie jasnoniebieskie podczas wirowania haczyka, gdy obserwuje się je w kanale UV w miarę kondensacji DNA. Ponadto barwienie na niebiesko stanie się mniej homogeniczne, a z czasem zaczną pojawiać się czarne przerwy. Formowanie się błony jądrowej można zwizualizować, dodając do utrwalacza jeden mikrogram na samca 3,3-diaminocykloheksanokarbonylo-diimidu lub DHCC.DHCC jest fluorescencyjnym barwnikiem lipofilnym, który jest wizualizowany w kanale fluoresceiny. We wczesnych etapach składania jąder komórkowych pęcherzyki błonowe wiążą się z powierzchnią chromatyny i zaczynają fuzować w obrębie plam. Skutkuje to nierównym i nieciągłym wyglądem formującej się błony.Po utworzeniu się błony, wygładza się ona na powierzchni jądra i pojawia się jako równa, nieprzerwana obwódka wokół DNA. W otaczającym cytosolu wystąpi znaczna ilość fluorescencji tła z powodu pęcherzyków błonowych, które nie zostały wbudowane do jąder. Przedstawiliśmy właśnie in vitro rekonstrukcję jądra z wykorzystaniem rozpuszczalnych i lekkich frakcji błonowych z ekstraktu z jajgo Xenopus.Należy pamiętać, że ekstrakt surowy można wykorzystać do montażu jąder, jednak nie po zamrożeniu i rozmrożeniu. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

in-vitro-nuclear-assembly-using-fractionated-xenopus-egg-extracts

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Montaż jądrowy in vitro przy użyciu frakcjonowanych ekstraktów jaj ksenopus

Emory University.  Montaż błony jądrowej jest niezbędnym krokiem w cyklu podziału komórki; proces ten można odtworzyć w probówce, łącząc chromatynę plemników Xenopus, cytozol i frakcje błony świetlnej. Powstają całe jądra, w tym błony jądrowe z kompleksami porowymi, a te odtworzone jądra są zdolne do normalnych procesów jądrowych.

Summary

Montaż błony jądrowej jest kluczowym etapem cyklu podziału komórkowego; proces ten można odtworzyć in vitro, łącząc chromatynę plemników Xenopus, cytosol oraz lekkie frakcje błonowe. W wyniku tego procesu powstają kompletne jądra, w tym błony jądrowe z kompleksami porowymi, a tak zrekonstytuowane jądra są zdolne do przeprowadzania normalnych procesów jądrowych.

Montaż jądra in vitro z wykorzystaniem frakcjonowanych ekstraktów z jaj Xenopus

W tym artykule

Podsumowanie

Streszczenie

Protokół

Oświadczenia

Przedruki i uprawnienia

Tagi

Powiązane artykuły