Opracowaliśmy metodę odpowiedzi wizualno-motorycznej (Visual-Motor Response), aby ilościowo określić reakcję motoryczną larw zebrafish w odpowiedzi na przyrosty i spadki natężenia światła. Zbadaliśmy również mutanty wzroku zebrafish, w tym mutanty z brakiem odpowiedzi optokinetycznej (nrc), które uznano za całkowicie niewidome podczas testowania za pomocą innego badania wzroku – odruchu optokinetycznego.
Artykuł metodologiczny
Test behawioralny do pomiaru reaktywności rybek zebrafish na zmiany natężenia światła
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Odruch optokinetyczny (OKR) to podstawowy odruch wzrokowy występujący u większości kręgowców, który odgrywa istotną rolę w stabilizacji oka względem sceny wizualnej. OKR wymaga jednak, aby zwierzę wykryło ruchome pasy, w związku z czym jest możliwe, że ryby niewykazujące OKR nie są całkowicie ślepe. Jeden z mutantów danio-ostrosejanów, no optokinetic response c (nrc), nie wykazuje OKR w żadnych testowanych warunkach oświetleniowych i według doniesień jest całkowicie ślepy. Wcześniej wykazaliśmy, że u tych mutantów można zarejestrować aktywność komórek zwojowych typu OFF. Aby ustalić, czy ryby mutanty bez OKR, takie jak mutant nrc, potrafią wykrywać proste przyrosty i spadki natężenia światła, opracowaliśmy test behawioralny reakcji motorycznej na światło (VMR). W tym teście pojedyncze larwy danio-ostrosejanów umieszcza się w poszczególnych dołkach płytki 96-dołkowej, co pozwala na jednoczesny monitoring larw przy użyciu zautomatyzowanego systemu śledzenia wideo. Zarejestrowano i ilościowo określono odpowiedzi lokomocyjne każdej larwy na 30 minut włączenia światła (light ON) oraz 30 minut wyłączenia światła (light OFF). Ryby typu dzikiego (WT) wykazują krótki skok aktywności motorycznej po włączeniu światła, znany jako reakcja przestrachu (startle response), po którym następuje powrót do aktywności niższej niż bazowa, nazywany zamrożeniem (freeze). Ryby WT gwałtownie zwiększają również aktywność lokomocyjną bezpośrednio po wyłączeniu światła i dopiero stopniowo (w ciągu kilku minut) wracają do bazowej aktywności lokomocyjnej. Mutanty nrc reagują na wyłączenie światła podobnie jak ryby WT, jednak wykazują niewielki spadek średniej aktywności w porównaniu z rybami WT. Aktywność motoryczna w odpowiedzi na włączenie światła u mutantów nrc jest opóźniona i powolna. Czas narastania odpowiedzi mutantów nrc na włączenie światła jest dłuższy w porównaniu z odpowiedzią ryb WT. Wyniki te wskazują, że ryby nrc nie są całkowicie ślepe. Ponieważ ryby kostrasteowe mogą wykrywać światło za pomocą tkanek pozasiatkówkowych, potwierdziliśmy, że natychmiastowe reakcje behawioralne na zmiany natężenia światła wymagają nienaruszonych oczu, wykorzystując mutanty chokh (chk), które całkowicie nie posiadają oczu od najwcześniejszych stadiów rozwoju. W naszym teście VMR mutanty chk nie wykazują reakcji przestrachu ani na włączenie, ani na wyłączenie światła, co dowodzi, że oczy boczne pośredniczą w tym zachowaniu. Opisany tutaj test VMR uzupełnia uznany test OKR, który nie sprawdza zdolności larw danio-ostrosejanów do reagowania na zmiany natężenia światła. Dodatkowo automatyzacja testu VMR sprzyja wysokoprzepustowemu przesiewowi w kierunku wad w odpowiedziach wzrokowych wywołanych natężeniem światła.
Protokół
Niniejszy protokół przedstawia kroki niezbędne do przeprowadzenia badania odpowiedzi wzrokowo-motorycznej larw danio pręgowanego na zwiększenia i zmniejszenia natężenia światła we własnym laboratorium. Danio pręgowany stanowi doskonały model do badań behawioralnych. Ryby te są łatwe w utrzymaniu, mają liczne mioty i szybko się rozwijają. Przykładowo, oczy larw danio pręgowanego reagują na światło już w 3. dniu rozwoju, kiedy to wykazują reakcję przestrachu.
Część 1: Umieszczanie poszczególnych ryb w płytce 96-dołkowej
- Hodować larwy WT w cyklu ciemno-jasnym w temperaturze 28°C do co najmniej 4 dni po zapłodnieniu (dpf). Typowy cykl światła:ciemności stosowany w naszym laboratorium to 14 godzin włączonego światła zaczynając od 9:00 oraz 10 godzin wyłączonego światła zaczynając od 23:00. Aby uzyskać najlepsze wyniki behawioralne, należy unikać przepełnienia naczyń; zazwyczaj utrzymujemy nie więcej niż 50 larw w jednej płytce Petriego.
- Po 4 dpf zebrafishy są gotowe do przeniesienia do płytki 96-dołkowej. Aby zapewnić larwom większą przestrzeń do pływania, zazwyczaj używamy płytki 96-dołkowej z dużymi dołkami o pojemności 650 µl; jednak standardowe płytki 96-dołkowe również sprawdzają się dobrze. Używając plastikowej pipety transferowej, ostrożnie przenieś jedną larwę do każdego dołka.
- Po przeniesieniu ryb do dołków, wypełnij każdy z nich odpowiednią ilością wody z rybami, tak aby powierzchnia wody była niemal zlicowana z górną krawędzią dołków. Zbyt wysoki lub zbyt niski poziom wody w dołku może powodować problemy optyczne podczas rejestracji obrazu przez kamerę. Należy również uważać, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza do dołków.
Część 2: Przegląd aparatury pomiarowej
W tej części protokołu prosimy o zapoznanie się z filmem w celu zidentyfikowania poszczególnych elementów oraz zapoznania się z konfiguracją aparatury pomiarowej.
- Wewnątrz komory rejestracyjnej znajduje się wyraźnie określone miejsce na umieszczenie płytki 96-dołkowej.
- Kamera jest umieszczona z tyłu i jest ogniskowana na płytce za pomocą luster znajdujących się na obudowie. Kąt ustawienia tych luster można regulować, obracając śruby mocujące lustra.
- Komora rejestracyjna jest oświetlona od dołu diodami LED emitującymi światło podczerwone (IR). Pozwala to kamerze widzieć ryby nawet w ciemności. Larwy nie wykrywają światła IR, więc stałe oświetlenie podczerwienią nie wpływa na przebieg eksperymentu. Komora jest również oświetlona od dołu białymi diodami LED, które są sterowane niezależnie od świateł IR. Oświetlenie komory białym światłem z góry lub z boków jest oczywiście możliwe, jednak w takich przypadkach należy zachować ostrożność, aby uniknąć silnych odblasków od powierzchni wody, które mogą zakłócać obraz z kamery.
- W przypadku eksperymentów trwających dłużej niż kilka godzin, należy napełnić komorę delikatnie przepływającą wodą, aby pomóc w utrzymaniu stałej temperatury przez cały czas trwania badania. Jednym ze sposobów na zapewnienie stałego przepływu wody jest pompowanie jej z zbiornika za pomocą małej pompy akwariowej, podgrzewanej do 28°C typową grzałką akwariową.
- Aby zminimalizować niepożądane wibracje przenoszone z pomieszczenia, cała jednostka rejestracyjna powinna spoczywać na ciężkim stole antywibracyjnym.
Część 3: Dopasowanie płytki 96-dołkowej do siatki komputerowej systemu śledzenia wideo
- Umieść płytkę 96-dołkową zawierającą ryby w komorze rejestracyjnej.
- W przypadku użycia kąpieli wodnej, powoli zanurz płytkę w wodzie, pozwalając na dostosowanie poziomu wody, aby uniknąć jej rozlania się na płytkę. Alternatywnie można wyłączyć przepływ wody, włożyć płytkę, a następnie wznowić przepływ. Należy również upewnić się, że płytka 96-dołkowa jest stabilnie utrzymana na miejscu za pomocą sprężyny lub gumki recepturki.
- W oprogramowaniu Viewpoint Videotrack sprawdź, czy wszystkie larwy biorące udział w eksperymencie są widoczne na ekranie komputera. Używając elementów sterujących oprogramowania, dopasuj siatkę programu do śledzenia wideo do dołków w płytce w taki sposób, aby każda ryba znajdowała się wewnątrz kwadratu siatki. Komputer śledzący będzie obliczał ruch oddzielnie dla każdego z tych pól, dlatego w przypadku błędnego dopasowania siatki niektóre ruchy ryb mogą zostać pominięte. Co gorsza, dwie sąsiednie ryby mogą zająć ten sam obszar i zostać policzone jako jedna ryba. Ten krok jest bardzo ważny dla wszystkich rejestracji.
- Po dopasowaniu zaprogramuj czas włączania i wyłączania świateł. Zazwyczaj stosujemy 3 godziny adaptacji do światła lub ciemności w komorze, aby uzyskać podstawowy poziom aktywności, ale także dać larwom możliwość uspokojenia się po pipetowaniu i manipulacji. Po etapie bazowym wprowadzamy naprzemiennie 30 minut zapalonego światła (ON), a następnie 30 minut zgaszonego światła (OFF), powtarzając ten cykl kilka razy.
- Następnie zamknij drzwi komory rejestracyjnej i rozpocznij nagrywanie.
- W praktyce rejestrujemy aktywność każdej ryby na sekundę, jednak oprogramowanie Viewpoint rejestruje dane klatka po klatce (zapoznaj się z filmem w celu zaprezentowania procesu gromadzenia danych). Ustalenie wartości progowej minimalnej zmiany pikseli na klatkę zależy w pewnym stopniu od konkretnej kamery i ustawień oświetlenia. W naszej konfiguracji zazwyczaj stosujemy próg 4 pikseli; oznacza to, że jeśli zmienia się mniej niż 4 piksele, jest to uznawane za tło. Jeśli porusza się więcej niż 4 piksele, wskazuje to na ruch ryby. Doświadczalnie ustaliliśmy, że ta granica wykrywa niemal wszystkie ruchy pływające i obrotowe larw.
- Mimo że pola rejestracyjne dość dobrze izolują larwy, wyłącz światło w pomieszczeniu i zadbaj o zminimalizowanie zakłóceń w postaci hałasów mechanicznych, takich jak otwieranie i zamykanie drzwi w pokoju, huczne imprezy czy ćwiczenia fizyczne.
Część 4: Analiza danych
- Po zakończeniu eksperymentu przenieś zebrane dane do arkusza Excel lub do preferowanego pakietu analitycznego.
- Załączony arkusz Excel jest przykładem tego, jak mogą wyglądać dane: zawiera czas w sekundach od początku eksperymentu oraz aktywność każdej larwy na sekundę dla wszystkich ryb przez cały czas trwania eksperymentu (patrz plik uzupełniający Example Data w sekcji Files na tej stronie).
- Rysunek 1 przedstawia przykład aktywności pojedynczej larwy. Rysunek 2 to reprezentatywny ślad średniej z 40 larw zebrafish WT. Uśrednione odpowiedzi ON i OFF są wyraźne i spójne.
Rysunek 1: Aktywność pojedynczej ryby. Aktywność pojedynczej ryby WT w 5 dpf w odpowiedzi na naprzemienne 30-minutowe okresy włączania (ON) i wyłączania (OFF) światła. Odpowiedzi ON zaznaczono czarnymi strzałkami, a odpowiedzi OFF czerwonymi strzałkami.
Rysunek 2: Średnia aktywność 40 ryb. Średnia aktywność 40 ryb WT w 5 dpf w odpowiedzi na naprzemienne 30-minutowe okresy włączania (ON) i wyłączania (OFF) światła. Uśrednione odpowiedzi ON (czarne strzałki) i OFF (czerwone strzałki) są wyraźne i spójne.
5. Reprezentatywne wyniki
Rycina 3 przedstawia schematyczny zarys procedury eksperymentalnej zastosowanej we wszystkich naszych badaniach.
Rycina 3. Projekt eksperymentalny testu odpowiedzi wizualno-motorycznej (VMR). A) Pojedyncze ryby umieszczone są w komorze rejestracyjnej w płytce 96-dołkowej. Aktywność każdej ryby jest mierzona w każdej sekundzie. B) Ryby poddawane są okresowi adaptacji w ciemności lub w świetle, aby ustabilizować ich stan i uzyskać bazowy poziom aktywności. Okresy 30 minut z włączonym i wyłączonym światłem są wprowadzane kolejno przez łącznie 3 godziny. Ten schemat został opracowany na podstawie pracy Prober et al., 2006.
Jak wyglądają wykresy odpowiedzi wizualno-motorycznej?
Zmierzyliśmy odpowiedzi typu ON i OFF ryb WT na przyrosty i spadki natężenia światła. Aby potwierdzić, że odpowiedzi te zależą od funkcji oczu, zmierzyliśmy aktywność mutantów chk, które nie rozwijają oczu. Rycina 4 przedstawia średnią aktywność uzyskaną od zwierząt WT oraz mutantów chk.
Rycina 4: Ryby WT wykazują wyraźne odpowiedzi ON i OFF, które są pośredniczone przez oczy boczne. Zachowanie lokomocyjne larw zebrafish w 5 dpf w odpowiedzi na 30 minut włączonego światła (ON) i 30 minut wyłączonego światła (OFF) jest rejestrowane w odstępach sekundowych. Każda linia reprezentuje średnią z 480 odpowiedzi od 120 poszczególnych larw WT (linia niebieska) lub mutantów chk (linia pomarańczowa) zarejestrowanych w ciągu 3 eksperymentów. Mutanty chk nie zwiększają znacząco swojej aktywności ani w odpowiedzi na przyrosty, ani na spadki natężenia światła i wykazują niski bazowy poziom aktywności. Rycina ta została opracowana na podstawie pracy Emran et al., 2007.
Reakcje wzrokowo-ruchowe u ryb z mutacją nrc.
Na podstawie testu OKR uważano, że mutant nrc jest całkowicie ślepy. U mutanta nrc zakończenia fotoreceptorów nie tworzą się prawidłowo, a szlak wzrokowy On jest poważnie zaburzony 1. Rejestracje z komórek zwojowych siatkówki u tych mutantów wykazały, że wykazują one głównie odpowiedzi komórek zwojowych typu OFF, niektóre nieprawidłowe odpowiedzi ON-OFF, ale żadnych czystych odpowiedzi typu On 2.
Za pomocą testu VMR wykazaliśmy, że mutant nrc wykazuje prawidłową odpowiedź na wyłączenie światła (OFF-response) oraz opóźnioną i powolną odpowiedź na włączenie światła (ON-response) (patrz Rysunek 5). Zatem mutant nrc nie jest całkowicie ślepy, jak wcześniej sądzono 2.
Rysunek 5: Mutanty Nrc zwiększają swoją aktywność w odpowiedzi na zmiany natężenia światła. Reakcje behawioralne na włączenie (ON) i wyłączenie (OFF) światła u larw WT oraz mutantów nrc w 5 dpf. Każda linia reprezentuje średnią z 480 reakcji od 120 poszczególnych ryb każdego genotypu. Średnia aktywność lokomotoryczna mutantów nrc (różowe linie) jest nieznacznie obniżona w porównaniu z rybami WT (niebieskie linie), lecz pozostaje intensywna po bodźcu wyłączenia światła. Zwróć uwagę na powolny czas narastania odpowiedzi mutantów nrc na włączenie światła w porównaniu z odpowiedzią ryb WT na włączenie światła.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Procedury eksperymentalne przedstawione w filmie są reprezentatywne dla ryb typu WT. Jednakże eksperymenty te można przeprowadzić analogicznie również na rybach mutantach (patrz sekcja wyników reprezentatywnych). W celu optymalizacji kontroli sugerujemy rozmieszczenie ryb typu WT i mutantów na tej samej płytce w układzie szachownicy.
Podczas używania ryb mutantów na tej samej płytce co ryby WT należy upewnić się, że zapisano, jaki typ ryby został umieszczony w każdej studzience. Oto sugestia,...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Praca ta była wspierana przez granty National Institute of Health EY0081 i 5T32UY07145 oraz przez Knights Templar Eye Foundation. Jason Rihel jest stypendystą Bristol-Squibb w Life Sciences Research Foundation.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze | |
|---|---|---|---|---|
| Urządzenia do mikropłytek | Narzędzie | Whatman, GE Healthcare | 7701-1651 | |
| Pipety transferowe | Narzędzie | VWR international | 202205 | |
| Woda dla ryb | Odczynnik | patrz odniesienie #4 | ||
| Komory rejestracyjne (Zebrabox) | Narzędzie | Viewpoint Lifesciences | ||
| Oprogramowanie Videotrack | Narzędzie | Viewpoint Lifesciences |
Bibliografia
- Allwardt, A. B., Lall, B. A., Brockerhoff, S. E. Synapse formation is arrested in retinal photoreceptors of the zebrafish nrc mutant. J Neurosci. 21, 2330-2330 (2001).
- Emran, F., Rihel, J., Adolph, A. R. OFF ganglion cells cannot drive the optokinetic reflex in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 19126-19126 (2007).
- Prober, D. A., Rihel, J., Onah, A. A. Hypocretin/orexin overexpression induces an insomnia-like phenotype in zebrafish. J Neurosci. 26, 13400-13400 (2006).
- Westerfield, M. The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish. , University of Oregon Press. Eugene, OR. (2000).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie