Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.

Artykuł metodologiczny

Selektywne znakowanie białek powierzchni komórkowych z użyciem minimalnych barwników fluorescencyjnych CyDye DIGE Fluor

14.6K wyświetleń

⸱

DOI:

10.3791/945

⸱

26 listopada 2008

 ,  ,  , 
1Research and Development, GE Healthcare Bio-Sciences AB

W tym artykule

Podsumowanie

Zaprezentowano prostą i specyficzną metodę fluorescencyjnego znakowania oraz zwiększonej detekcji białek powierzchniowych komórek bez konieczności przeprowadzenia etapu frakcjonowania. Różnice w zawartości białek powierzchniowych komórek analizowano przy użyciu elektroforezy dwuwymiarowej (2-D) oraz technologii Ettan™ DIGE.

Streszczenie

Białka powierzchniowe są kluczowe dla zdolności komórki do reagowania na otoczenie oraz do oddziaływania z sąsiednimi komórkami. Wiadomo, że indukują one niemal wszystkie sygnały wewnątrzkomórkowe. Ponadto odgrywają istotną rolę w adaptacji do środowiska i odpowiedzi na leczenie farmakologiczne, a często są zaangażowane w patogenezę i patologię chorób (1). Oddziaływania białko-białko są immanentną cechą szlaków sygnałowych, a aby uzyskać głębszy wgląd w te złożone procesy biologiczne, niezbędne są czułe i niezawodne metody badania białek powierzchniowych komórek. Elektroforeza dwuwymiarowa (2-D) jest szeroko stosowana do detekcji biomarkerów i innych celów w złożonych próbkach białek w celu badania zmian różnicowych. Białka powierzchniowe komórek, częściowo ze względu na ich niską zawartość (1–2% białek komórkowych), są trudne do wykrycia w żelu 2-D bez frakcjonowania lub innego rodzaju wzbogacania. Ze względu na ich hydrofobową naturę i wysoką masę cząsteczkową są one również często słabo reprezentowane w żelach 2-D (2). W niniejszym badaniu przedstawiamy nowy protokół dla całych komórek, wykorzystujący minimalne barwniki CyDye DIGE Fluor do specyficznego znakowania i detekcji tej ważnej grupy białek. Wyniki wykazały specyficzne znakowanie licznych białek powierzchniowych komórek przy minimalnym znakowaniu białek wewnątrzkomórkowych. Protokół ten jest szybki, prosty w użyciu, a wszystkie trzy minimalne barwniki CyDye DIGE Fluor (Cy2, Cy3 i Cy5) mogą być stosowane do znakowania białek powierzchniowych komórek. Cechy te umożliwiają multipleksowanie z wykorzystaniem dwuwymiarowej różnicowej elektroforezy żelowej z fluorescencją (2-D DIGE) przy użyciu technologii Ettan DIGE oraz analizę zmian w ekspresji białek za pomocą oprogramowania DeCyder 2-D Differential Analysis Software. Poziom białek powierzchniowych komórek monitorowano podczas deprywacji surowicy w komórkach CHO przez różne okresy czasu (patrz. Tabela 1). Niewielkie zmiany w zawartości białek wykryto z wysoką dokładnością, a wyniki zostały potwierdzone określonymi metodami statystycznymi.

Protokół

Hodowla komórkowa

  1. Hodować komórki jajnika chomika chińskiego (CHO-K1) przy użyciu standardowych procedur hodowli komórkowej w pożywce F-12 Ham z GlutaMAX I zawierającej 10% płodowego surowicy cielęcej, 50 U/ml penicyliny i 50 µg/ml siarczanu streptomycyny (Invitrogen).
  2. Wymienić pożywkę hodowlaną na pożywkę bezsurowiczą. Znakować białka powierzchni komórkowych w różnych punktach czasowych za pomocą minimalnych barwników CyDye DIGE Fluor Cy3 lub Cy5 (patrz sekcja Znakowanie powierzchni komórkowej poniżej).
  3. Połączyć równe liczby komórek z każdego punktu czasowego i znakować za pomocą CyDye DIGE Fluor Cy2. Wykorzystać je jako standard wewnętrzny dla każdego żelu 2-D.
  4. Większość eksperymentów można przeprowadzić z komórkami CHO-K1, ale można również zastosować fibroblasty zarodkowe myszy (3T3 L1) oraz limfoblasty chłoniaka wodniczakowego myszy (EL4) (dane nie zostały przedstawione).
  5. Hodować dwa ostatnie typy komórek w pożywce DMEM z GlutaMAX II, natomiast w pozostałych kwestiach stosować warunki identyczne z tymi zastosowanymi dla komórek CHO-K1.

Znakowanie powierzchni komórek

  1. Ostrożnie oddziel adherentne komórki metodą nieenzymatyczną, policz je i podziel na alikwoty po 5–10 x106 komórek. W przypadku komórek rosnących w zawiesinie pomiń etap oddzielania.
  2. Odwirowuj zawiesiny komórkowe przy ok. 800 x g przez 5 minut. Usuń nadnadłoża zawierające pożywkę.
  3. Przemyj osady poprzez resuspensję w 1 ml lodowatego zrównoważonego roztworu soli Hank’a (HBSS) o pH 8.5. Odwirowuj przy 800 x g w temperaturze 4°C przez 2 minuty.
  4. Usuń nadnadłoż i resuspenduj osad komórkowy w 200 µl lodowatego buforu do znakowania (HBSS pH 8.5, 1 M mocznika).
  5. Znakuj nienaruszone komórki przy użyciu 600 pmol barwników CyDye DIGE Fluor minimal przez 20 minut na lodzie w ciemności.
  6. Zatrzymaj reakcję, dodając 20 µl 10 mM lizyny. Inkubuj przez 10 minut.
  7. Przemyj komórki znakowane powierzchniowo dwukrotnie poprzez resuspensję w 500 µl HBSS pH 7.4, a następnie odwirowuj przy 800 x g w temperaturze 4°C przez 2 minuty.

Lizja i frakcjonowanie komórek

  1. Zlizuj komórki z oznakowaną powierzchnią w 150 μl zimnego buforu do lizy (7 M mocznika, 2 M tiomocznika, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM octanu magnezu pH 8,5). Pozostaw w lodzie przez co najmniej 1 h, sporadycznie mieszając na wirówce typu vortex.
  2. Odwiruj lizaty przy 10 000 x g w temperaturze 4°C przez 5 minut. Przenieś nadjad do nowej probówki. Próbka ta jest próbką niefrakcjonowaną, zawierającą wszystkie białka komórkowe.
  3. Równolegle przemyj osady komórkowe, jak opisano powyżej, a następnie poddaj frakcjonowaniu (używając zestawu do frakcjonowania błonowego, Pierce) na frakcję błonową i cytozolową przed elektroforezą żelową 2-D. Frakcja błonowa zawiera białka błon wewnętrznych i powierzchniowych komórki.
  4. W celu porównania zastosuj standardową procedurę Ettan DIGE 3: zlizuj, oznakuj, a na koniec poddaj komórki frakcjonowaniu. Określ stężenie białka w próbkach za pomocą zestawu 2- D Quant Kit (GE Healthcare).

Elektroforeza 2-D

  1. Rehydratyzuj żele Immobiline DryStrip, pH 3–11NL (24 cm), używając kuwety do rehydratyzacji Immobiline DryStrip Reswelling tray, 24 cm, w 450 µl roztworu DeStreak Rehydration solution (0,5% IPG Buffer) przez noc.
  2. Nanieś próbki znakowane CyDye (odpowiadające 50 µg całkowitego białka) na żele Immobiline DryStrip poprzez ładowanie do kubeczków anodowych w kolektorze i przeprowadź skupianie izoelektryczne (IEF) za pomocą systemu Ettan IPGphor II IEF System zgodnie z instrukcją.
  3. Po IEF zrównoważ paski w dwóch krokach i umieść je na powierzchni dużych (26 x 20 cm) żeli poliakrylamidowych 12,5% (SDS-PAGE). Przykryj warstwą 0,5% agarozy (w buforze do elektroforezy zawierającym błękit bromofenolowy). Przeprowadź elektroforezę 2-D przy użyciu systemu Ettan DALTtwelve Large Vertical System przy 5 W/żel przez 30 min, a następnie przy 15 W/żel, aż front barwnika dotrze do dolnej krawędzi żelu.

Obrazowanie i analiza danych

  1. Po zakończeniu elektroforezy 2-D przeskanuj żele pod kątem obecności Cy2, Cy3 lub Cy5, używając obrazownika Typhoon 9410 Variable Mode Imager.
  2. Porównaj mapy plamek z frakcji błonowych, frakcji cytozolowych oraz próbek niefrakcjonowanych, korzystając z oprogramowania DeCyder 2-D Differential Analysis Software 4.

Barwienie po elektroforezie

  1. Po obrazowaniu poddaj żele barwieniu srebrem zgodnie ze standardową procedurą 5.

Identyfikacja białek

  1. Hodować, zebrać, przemyć i poddać lizie preparatywne ilości komórek (około 1 mg białka całkowitego z 10 x106 komórek CHO), zgodnie z opisem powyżej dla próbki niefrakcjonowanej. Użyć próbki z oznakowanymi białkami powierzchniowymi Cy5 (patrz powyżej) jako standardu wewnętrznego (spike) i nanieść ją wraz z nieoznakowanymi preparatywnymi ilościami białka.
  2. Przeprowadzić elektroforezę 2-D zgodnie z opisem powyżej, jednak tym razem nanieść 600 µg nieoznakowanego lizatu komórkowego wraz z 50 µg oznakowanego standardu białek powierzchniowych za pomocą aplikacji w kubku anodowym. Użyć markerów referencyjnych w celu umożliwienia prawidłowego wycinania plamek, umieszczając je pomiędzy szklanymi płytkami przed odlewaniem żelu zgodnie z zaleceniami 3.
  3. Zeskanować żel w kanale Cy5, aby uzyskać mapę plamek białek powierzchniowych Cy5, a następnie przeprowadzić barwienie białek całkowitych przy użyciu barwnika do białek całkowitych Deep purple 3.
  4. Zestawić obie mapy plamek za pomocą oprogramowania DeCyder 2-D i stworzyć listę wycinania dla wszystkich plamek odpowiadających oznakowanym Cy5 białkom powierzchniowym. Wyciąć białka powierzchniowe za pomocą stacji obsługi plamek Ettan, wyekstrahować je z fragmentów żelu i poddać trawieniu trypsyną w digesterze Ettan. Zidentyfikować białka za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.

Tabela 1. Przeprowadzono eksperyment Ettan DIGE z wykorzystaniem próbek z komórek z głodzenia seryjnego, znakowanych zgodnie z protokołem znakowania białek powierzchniowych komórek przedstawionym na rysunku 1.

PróbkaCzas deplecji serumZnakowanie CyDyeNumer żelu 
1-Cy 3, Cy 21
230 minutCy 5, Cy 21
32 godzinyCy 3, Cy 22
44 godzinyCy 5, Cy 22
516 godzinCy 5, Cy 23

 

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

Stężenie białka

Przegląd dwóch schematów znakowania przedstawiono na Rysunku 1. Ponieważ komórki pozostają nienaruszone podczas znakowania zgodnie z protokołem znakowania białek powierzchniowych, barwnik ma dostęp jedynie do białek powierzchni komórki. W standardowym protokole Ettan DIGE komórki są lizowane przed znakowaniem, przez co znakowane są białka zarówno wewnątrz, jak i na zewnątrz komórki (Rys 1). Względna ilość barwnika w stosunku do białka w protokole znakowania białek powierzchniowyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Podziękowania

Dziękujemy profesorowi Dontscho Kerjaschki, Corinie Mayrhofer oraz Sigurdowi Kriegerowi z Instytutu Patologii Klinicznej Uniwersytetu Wiedeńskiego w Austrii za współpracę.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
CyDye DIGE Kit, 2 nmolOdczynnikGE Healthcare28-9345-30
2-D Quant KitOdczynnikGE Healthcare80-6484-51
Bufor IPG pH 3-11NLOdczynnikGE Healthcare17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cmOdczynnikGE Healthcare17-6003-77
IPGboxNarzędzieGE Healthcare28-9334-65
Zestaw IPGboxNarzędzieGE Healthcare28-9334-92
Roztwór rehydratacyjny DeStreakOdczynnikGE Healthcare17-6003-19
Płyn do pokrywania Immobiline DryStripOdczynnikGE Healthcare17-1335-01
Urządzenie IEF Ettan IPGphor 3InstrumentGE Healthcare11-0033-64
Rozdzielacz Ettan IPGphorKomponent instrumentuGE Healthcare80-6498-38
Odlewarka żeli Ettan DALTtwelveNarzędzieGE Healthcare80-6467-22
Urządzenie rozdzielcze i zasilacz/jednostka sterująca Ettan DALTtwelveInstrumentGE Healthcare80-6466-46Urządzenie 230 V: 80-6466-27
Skaner obrazujący Typhoon 9410 Variable ModeInstrumentGE Healthcare63-0055-81
Ettan Spot PickerInstrumentGE Healthcare18-1145-28
Ettan DigesterInstrumentGE Healthcare18-1142-68
Ettan SpotterInstrumentGE Healthcare18-1142-67
Ettan MALDI-TOFInstrumentGE Healthcare18-1142-33
Oprogramowanie do analizy różnicowej 2-D DeCyderInneGE Healthcare28-4012-01
Oprogramowanie analityczne ImageQuantInneGE Healthcare28-9236-62
MocznikOdczynnikGE Healthcare17-1319-01
CHAPSOdczynnikGE Healthcare17-1314-01
PlusOne ditiotreitol (DTT)OdczynnikGE Healthcare17-1318-01
Błękit bromofenolowyOdczynnikGE Healthcare17-1329-01
TrisOdczynnikGE Healthcare17-1321-01
Dodecylsiarczan sodu (SDS)OdczynnikGE Healthcare17-1313-01
PlusOne glicerol 87%OdczynnikGE Healthcare17-1325-01
PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% COdczynnikGE Healthcare17-1310-01
PlusOne TEMEDOdczynnikGE Healthcare17-1312-01
PlusOne wersenian amonuOdczynnikGE Healthcare17-1311-01
PlusOne glicynaOdczynnikGE Healthcare17-1323-01
2-D Sample Prep dla białek błonowychOdczynnikPierce, Thermo Scientific89864
Siarczan streptomycynyOdczynnikInvitrogen15140-122

Bibliografia

  1. Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
  2. Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
  3. Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
  4. DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
  5. 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
  6. CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
  7. Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
  8. Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Tagi

2D DIGEEttan DIGEanaliza DeCyderznakowanie całych komórekdetekcja białek błonowychgłodzenie surowicze komórek CHOobrazowanie fluorescencyjnebarwienie srebrem
Selektywne znakowanie białek powierzchni komórkowych z użyciem minimalnych barwników fluorescencyjnych CyDye DIGE Fluor
Skontaktuj się z nami
Poleć bibliotece

Prywatność

Warunki korzystania z usługi

Zasady

Prawa autorskie © 2026 MyJoVE Corporation. Wszelkie prawa zastrzeżone.