Method Article

Selektywne znakowanie białek powierzchniowych komórek przy użyciu barwników CyDye DIGE Fluor Minimal

DOI:

10.3791/945

⸱

November 26th, 2008

 ,  ,  , 
1Research and Development, GE Healthcare Bio-Sciences AB

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pokazano prostą i specyficzną metodę znakowania fluorescencyjnego i ulepszonego wykrywania białek powierzchniowych komórek bez etapu frakcjonowania. Zróżnicowaną liczebność białek powierzchniowych komórek analizowano za pomocą elektroforezy dwuwymiarowej (2D) i technologii Ettan™ DIGE.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Białka powierzchniowe mają kluczowe znaczenie dla zdolności komórki do reagowania na środowisko i interakcji z sąsiednimi komórkami. Wiadomo, że są induktorami prawie całej sygnalizacji wewnątrzkomórkowej. Ponadto odgrywają ważną rolę w adaptacji do środowiska i leczeniu farmakologicznym, a także często biorą udział w patogenezie i patologii choroby (1). Interakcje białko-białko są nieodłącznie związane ze szlakami sygnałowymi i aby uzyskać lepszy wgląd w te złożone procesy biologiczne, potrzebne są czułe i niezawodne metody badania białek powierzchniowych komórek. Elektroforeza dwuwymiarowa (2D) jest szeroko stosowana do wykrywania biomarkerów i innych celów w złożonych próbkach białek w celu badania zmian różnicowych. Białka powierzchniowe komórek, częściowo ze względu na ich niską liczebność (1-2% białek komórkowych), są trudne do wykrycia w żelu 2D bez frakcjonowania lub innego rodzaju wzbogacania. Są one również często słabo reprezentowane w żelach 2D ze względu na ich hydrofobowy charakter i wysoką masę cząsteczkową (2). W tym badaniu przedstawiamy nowy protokół dla nienaruszonych komórek przy użyciu minimalnych barwników CyDye DIGE Fluor do specyficznego znakowania i wykrywania tej ważnej grupy białek. Wyniki wykazały specyficzne znakowanie dużej liczby białek powierzchniowych komórek przy minimalnym znakowaniu białek wewnątrzkomórkowych. Protokół ten jest szybki, prosty w użyciu, a wszystkie trzy minimalne barwniki CyDye DIGE Fluor (Cy 2, Cy 3 i Cy 5) mogą być używane do znakowania białek na powierzchni komórki. Cechy te pozwalają na multipleksowanie przy użyciu elektroforezy żelowej 2-D Fluorescence Difference (2-D DIGE) z technologią Ettan DIGE oraz analizę zmian ekspresji białek za pomocą oprogramowania do analizy różnicowej DeCyder 2-D. Poziom białek powierzchniowych komórek obserwowano podczas głodu komórek CHO w surowicy przez różny okres czasu (patrz Tabela 1). Niewielkie zmiany liczebności wykryto z dużą dokładnością, a wyniki są poparte zdefiniowanymi metodami statystycznymi.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla komórkowa

  1. Hoduj komórki jajnika chomika chińskiego (CHO-K1) przy użyciu standardowych procedur hodowli komórkowej w pożywce F-12 Ham z GlutaMAX I zawierającym 10% płodowej surowicy cielęcej, 50 U/ml penicyliny i 50 μg/ml siarczanu streptomycyny (Invitrogen).
  2. Zamień pożywkę hodowlaną na pożywkę bez surowicy. Oznacz białka na powierzchni komórki w różnych punktach czasowych za pomocą minimalnych barwników CyDye DIGE Fluor Cy3 lub Cy5 (patrz sekcja Znakowanie powierzchni komórki poniżej).
  3. Połącz równą liczbę komórek z każdego punktu czasowego i oznacz za pomocą CyDye DIGE Fluor Cy2. Używaj ich jako wewnętrznego wzorca dla każdego żelu 2D.
  4. Większość eksperymentów można przeprowadzić z komórkami CHO-K1, ale można również użyć mysich fibroblastów zarodkowych (3T3 L1) i mysich limfoblastów chłoniaka wodobrzusza (EL4) (dane nie pokazane).
  5. Hoduj dwa ostatnie typy komórek w pożywce DMEM z GlutaMAX II, ale poza tym użyj identycznych warunków stosowanych dla komórek CHO-K1.

Etykietowanie powierzchni komórki

  1. Ostrożnie odłącz przylegające komórki nieenzymatycznie, licząc i dzieląc na porcje po 5–10 komórek x106. W przypadku komórek rosnących w zawiesinie należy pominąć etap odłączania.
  2. Odwirować zawiesiny komórkowe o stężeniu około 800 x g przez 5 minut. Usunąć supernatanty zawierające pożywkę.
  3. Umyj granulki przez ponowne zawieszenie w 1 ml lodowatego roztworu soli Hanka (HBSS) o pH 8,5. Odwirowywać w temperaturze 800 x g w temperaturze 4°C przez 2 minuty.
  4. Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek w 200 μl lodowatego buforu do znakowania (HBSS pH 8,5, 1 M mocznik).
  5. Oznacz nienaruszone komórki minimalnymi barwnikami CyDye DIGE Fluor o minimalnej zawartości 600 pmol przez 20 minut na lodzie w ciemności.
  6. Ugasić reakcję, dodając 20 μl 10 mM lizyny. Inkubować przez 10 minut.
  7. Dwukrotnie przepłukać znakowane na powierzchni komórki przez ponowne zawieszenie w 500 μl HBSS o pH 7,4, a następnie odwirować w temperaturze 800 x g w temperaturze 4°C przez 2 minuty.

Liza i frakcjonowanie komórek

  1. Komórki znakowane powierzchniowo poddać lizie w 150 μl buforu do lizy na zimno (7 M mocznika, 2 M tiomocznik, 4% CHAPS, 30 mM Tris, 5 mM octan magnezu o pH 8,5). Pozostawić na lodzie na co najmniej 1 godzinę z okazjonalnym wirowaniem.
  2. Odwirować lizaty w temperaturze 10 000 x g w temperaturze 4°C przez 5 minut. Przenieść supernatant do nowej probówki. Ta próbka jest próbką niefrakcjonowaną zawierającą wszystkie białka komórkowe.
  3. Równolegle umyj granulki komórek, jak powyżej, a następnie frakcjonuj (za pomocą zestawu do frakcjonowania membranowego, Pierce) na frakcje błonowe i cytozolowe przed elektroforezą żelową 2-D. Frakcja błonowa zawiera białka błony wewnętrznej i powierzchniowej komórki.
  4. Dla porównania, postępuj zgodnie ze standardową procedurą Ettan DIGE 3 i poddaj je lizie, znakowaniu, a na końcu frakcjonowaniu. Określ stężenie białka w próbkach za pomocą zestawu 2-D Quant Kit (GE Healthcare).

Elektroforeza 2-D

  1. Żele Immobiline DryStrip, pH 3–11NL (24 cm) należy nawodnić za pomocą tacki do pęcznienia Immobiline DryStrip, 24 cm w 450 μl roztworu nawadniającego DeStreak (0,5% buforu IPG) przez noc.
  2. Nanieść próbki znakowane CyDye (odpowiadające 50 μg białka całkowitego) do żeli Immobiline DryStrip poprzez anodowe obciążenie kubka w kolektorze i przeprowadzić ogniskowanie izoelektryczne (IEF) za pomocą systemu Ettan IPGphor II IEF zgodnie z instrukcją.
  3. Po IEF zrównoważyć paski w dwóch krokach i umieścić na nich duże (26 x 20 cm) 12,5% żele poliakryloamidowe (SDS-PAGE). Nakładka z 0,5% agarozą (w buforze bieżącym zawierającym błękit bromofenolowy). Przeprowadzić elektroforezę 2D przy użyciu dużego pionowego systemu Ettan DALTtwelve przy 5 W/żel przez 30 minut, a następnie przy 15 W/żel, aż czoło barwnika dotrze do dna żelu.

Obrazowanie i analiza danych

  1. Po zakończeniu elektroforezy 2D zeskanuj żele w poszukiwaniu Cy2, Cy3 lub Cy5 za pomocą kamery Typhoon 9410 Variable Mode Imager.
  2. Porównaj mapy punktowe z frakcji błonowych, frakcji cytozolowych i próbek niefrakcjonowanych za pomocą oprogramowania do analizy różnicowej DeCyder 2-D 4.

Po barwieniu

  1. Po zobrazowaniu srebrem zabarwić żele zgodnie ze standardową procedurą 5.

Identyfikacja białka

  1. Hodować, zbierać, przemywać i lizować preparatywne ilości (około 1 mg białka całkowitego z 10 komórek CHO x106) komórek, jak opisano powyżej dla próbki niefrakcjonowanej. Użyj próbki znakowanej powierzchnią komórek Cy5 (patrz wyżej) jako kolca i nałóż razem z nieznakowanymi ilościami preparatywnymi białka.
  2. Przeprowadź elektroforezę 2D, jak opisano powyżej, ale tym razem dodaj 600 μg nieznakowanego lizatu komórkowego wraz z 50 μg znakowanego kolca na powierzchni komórki za pomocą aplikacji kubka anodowego. Użyj znaczników referencyjnych, aby umożliwić prawidłowe pobranie miejsca i umieść między szklanymi płytkami przed odlewaniem żelu zgodnie z zaleceniami 3.
  3. Zeskanuj żel w kanale Cy5, aby uzyskać mapę plamki powierzchni komórki Cy5, a następnie wybarwić całkowite białko za pomocą ciemnofioletowego całkowitego barwnika białkowego 3.
  4. Dopasuj do siebie dwie mapy plamek za pomocą oprogramowania DeCyder 2-D i utwórz listę wyboru dla wszystkich miejsc odpowiadających białkom powierzchniowym komórek znakowanych Cy 5. Pobrać białka powierzchniowe komórek za pomocą stacji obsługi plamek Ettan, wyekstrahować z czopów żelowych i trypsynować za pomocą komory fermentacyjnej Ettan. Identyfikacja za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF.

Tabela 1. Eksperyment Ettan DIGE przeprowadzono przy użyciu próbek z komórek zubożonych w surowicy znakowanych zgodnie z protokołem znakowania białek na powierzchni komórki na rycinie 1.

PróbkaCzas wyczerpania surowicyOznakowane CyDyeNumer żelu 
1-Cy 3, Cy 21
230 minutCy 5, Cy 21
32 godzinyCy 3, Cy 22
44 godzinyCy 5, Cy 22
516 godzinCy 5, Cy 23

 

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stężenie białka

Omówienie dwóch przepływów pracy etykietowania przedstawiono na rysunku 1. Ponieważ komórki są nadal nienaruszone, gdy są znakowane zgodnie z protokołem znakowania białek na powierzchni komórki, tylko białka powierzchniowe komórki są wystawione na działanie barwnika. W standardowym protokole Ettan DIGE komórki są poddawane lizie przed znakowaniem, a białka wewnątrz i na zewnątrz komórki są znakowane (ryc. 1). Względna ilość barwnika w stosunku do białka w protokole znakowania bia...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy profesorowi Dontscho Kerjaschki, Corinie Mayrhofer i Sigurdowi Kriegerowi z Instytutu Patologii Klinicznej Uniwersytetu Wiedeńskiego, Austria za współpracę.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
CyDye DIGE Kit,odczynnikGE Healthcare28-9345-30
Zestaw 2-D Quant OdczynnikGE Healthcare80-6484-51
IPG Bufor pH 3-11NLOdczynnikGE Healthcare17-6004-40
Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cmOdczynnikGE Healthcare17-6003-77
IPGboxToolGE Healthcare28-9334-65
Zestaw IPGboxNarzędzieGE Healthcare28-9334-92
Odczynnik do roztworu nawadniającego DeStreakGE Healthcare17-6003-19
Odczynnik do płynów Immobiline DryStrip Cover GEHealthcare17-1335-01
Ettan IPGphor 3 Instrument jednostki IEFGE Healthcare11-0033-64
Ettan IPGphor ElementprzyrząduGE Healthcare80-6498-38
Ettan DALTtwelve Gel Caster ToolGE Healthcare80-6467-22
Ettan DALTtwelve Jednostka separująca i jednostka zasilająca/sterującaGE Healthcare80-6466-46Jednostka 230 V: 80-6466-27
Kamera o zmiennym trybie pracy Typhoon 9410InstrumentGE Healthcare63-0055-81
Ettan Spot PickerInstrumentGE Healthcare18-1145-28
Przyrząd do fermentacji EttanGEHealthcare18-1142-68
Ettan SpotterInstrumentGE Healthcare18-1142-67
Ettan MALDI-TOFInstrumentGE Healthcare18-1142-33
Oprogramowanie do analizy różnicowej 2-D DeCyderInneHealthcare28-4012-01
ImageQuant InneGE Healthcare28-9236-62
Odczynnik mocznikowyGE Healthcare17-1319-01
Odczynnik CHAPSGE Healthcare17-1314-01
PlusOne Odczynnik ditiotreitol (DTT)GE Healthcare17-1318-01
Odczynnik Błękit BromofenolowyGE Healthcare17-1329-01
Odczynnik TrisGE Healthcare17-1321-01
Odczynnik Dodecylosiarczan sodu (SDS)GE Healthcare17-1313-01
Odczynnik PlusOne Glicerol 87%GEHealthcare17-1325-01
Odczynnik PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% CGE Healthcare17-1310-01
Odczynnik PlusOne TEMEDGE Healthcare17-1312-01
Odczynnik nadsiarczanu amonu PlusOneGE Healthcare17-1311-01
Odczynnik glicynowy PlusOne GE Healthcare17-1323-01
Przygotowanie próbki 2D do białek błonowychOdczynnikPierce, Thermo Scientific89864
Odczynnik siarczanu streptomycynyInvitrogen15140-122
2 nmol do kolektora oprogramowanie do analizy GE

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jang, J. H., Hanash, S. M. Profiling of the cell surface proteome. Proteomics. 3, 1947-1954 (2003).
  2. Shin, B. K. Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function. J Biol Chem. 9, 7607-7616 (2003).
  3. Ettan DIGE System User Manual. GE Healthcare user manual 18-1164-40. , (2006).
  4. DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA. , (2004).
  5. 2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods. GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB. , (2002).
  6. CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB. , (2003).
  7. Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo. Proteomics. 2, 579-5785 (2006).
  8. Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB. , (2005).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Surface ProteinsCyDye DIGE Fluor2D DIGEEttan DIGEDeCyder AnalysisIntact Cell LabelingMembrane Protein DetectionSerum Starvation CHOFluorescent ImagingSilver Staining

Related Articles