Obsługiwane dwuwarstwy płaskie do tworzenia badania synaps immunologicznych i kinaps

Summary

Obsługiwane dwuwarstwy płaskie to potężne narzędzia, które mogą być używane do modelowania oddziaływań molekularnych w synapsie immunologicznej. Tutaj pokazujemy metody zakotwiczania białek adhezyjnych komórek, o których wiadomo, że modulują tworzenie synaps do górnego płatka lipidowego bilyera i wizualizujemy tworzenie synaps za pomocą mikroskopii TIRF.

Abstract

Obsługiwane dwuwarstwy płaskie to potężne narzędzia, które można wykorzystać do modelowania interakcji molekularnych w synapsie immunologicznej. Aby naśladować interakcje między limfocytami a komórkami prezentującymi antygen, używamy lipidów chelatujących Ni2 + do zakotwiczenia adhezji komórek rekombinowanych i białek MHC do górnego płata dwuwarstwy ze znacznikami polihistydyny. Dwuwarstwy płaskie są generowane przez przygotowanie lipidu, obróbkę szklanych powierzchni, na których utworzy się dwuwarstwa, a następnie uformowanie dwuwarstwy w specjalistycznej komorze zawierającej komórkę przepływową, do której zostaną dodane limfocyty. Następnie dwuwarstwy są ładowane Ni i dodawane są znakowane przez niego rekombinowane białka. Na koniec limfocyty są wstrzykiwane do komórki przepływowej, a mikroskopia TIRF może być wykorzystana do zobrazowania tworzenia synaps i mechanizmów kontrolujących lokomocję limfocytów T, miejsc sortowania receptorów i miejsc degradacji receptora.

Protocol

1. Przygotowanie lipidów

1. W celu połączenia białek z górnym płatkiem dwuwarstwy używamy lipidów chelatujących Ni²⁺, które zakotwiczają białka rekombinowane ze znacznikami polihistydyny. Niektóre typy komórek mogą przylegać niespecyficznie do dwuwarstw pokrytych Ni²⁺, ale limfocyty T na ogół tego nie robią, co czyni tę metodę optymalną do badania aktywacji limfocytów T.
2. Dwuwarstwowy roztwór lipidowy wytwarza się poprzez przygotowanie roztworu 20% lipidu chelatującego Ni²⁺ i 80% fosfatydylocholiny w odpowiednich ilościach w szklanej probówce z 1-2 ml chloroformu-metanolu.
   1. Odparować rozpuszczalnik pod strumieniem azotu gazowego w ciepłej (30-37°C) łaźni wodnej. Zwykle zajmuje to około 15 minut.
   2. Usuń pozostały rozpuszczalnik w wysokiej próżni, używając liofilizatora przez 90 minut.
3. Rozpuść lipidy w 2% detergencie N-oktyloglukozydowym w buforze tris-solnym, który tworzy roztwór mieszaniny miceli detergentowo-fosfolipidowej. Końcowe stężenie fosfolipidów powinno wynosić 0,4 mM. Aby utworzyć liposomy, dializuj ten roztwór przeciwko 3 zmianom tris-soli fizjologicznej, aby usunąć detergent i utworzyć liposomy. Zazwyczaj pracujemy z objętościami rzędu 1 ml z rurkami Spectra/por #2 o średnicy 6 mm z odcięciem około 10 kDa. Zwracamy uwagę, aby wykluczyć wszelkie pęcherzyki powietrzas podczas zaciskania rurki. Zazwyczaj sterylnie filtrujemy ten roztwór i przeprowadzamy dializę w czystych warunkach, używając rękawiczek wysterylizowanych w 70% etanolem.
4. To rozwiązanie powinno być krystalicznie czyste. Jest przechowywany pod gazem argonowym, aby zapobiec utlenianiu. Jeśli roztwór jest mętny, powstały wielościenne pęcherzyki i będziesz musiał zacząć od nowa.

2. Określanie, ile ICAM-1 i MHC są zdeponowane na płaskiej dwuwarstwie

1. Aby przygotować się do eksperymentu, należy najpierw określić, ile ICAM-1 i MHC osadza się na danej powierzchni dwuwarstwy chelatującej Ni²⁺ przy danym stężeniu rozpuszczalnego białka. Aby to zrobić, umieść dwuwarstwy na szklanych kulkach o średnicy 5 mikrometrów, inkubuj szklane kulki z roztworami białkowymi w warunkach zbliżonych do tych w komórkach przepływowych używanych do obrazowania i odczytaj gęstość związanego białka za pomocą testu immunofluorometrycznego przepływu.
2. Przeciwciała znakowane FITC o znanej liczbie fluoresceiny na cząsteczkę są używane do wykrywania białek związanych z powierzchnią. Standardowe kulki fluoresceiny służą do kalibracji mikrofluorymetru przepływowego.
3. Ustalimy warunki zbliżone do tych na komórkach prezentujących antygen z 200 cząsteczkami/μm2 ICAM-1 i 0,2-20 cząsteczkami/μm2 kompleksu I-Ek-MCC91-103.
   

3. Czyszczenie szkiełek nakrywkowych do formowania płaskich dwuwarstw

1. Płaskie dwuwarstwy tworzą się spontanicznie, gdy liposomy łączą się ze szkłem, ale tylko wtedy, gdy szkło jest odpowiednio oczyszczone.
2. Podczas pracy z Piranha nosimy pełną odzież ochronną, w tym fartuch kwasowy oraz ciężkie, kwasoodporne rękawice. Ostrożnie segreguj odpady od odpadów organicznych i odpowiednio zutylizuj.
3. Aby przygotować kwaśny roztwór piranii, dodaj 75 ml stężonego kwasu siarkowego do suchej zlewki i ostrożnie dodaj 25 ml 30% nadtlenku wodoru. Roztwór szybko nagrzewa się do temperatury przekraczającej 100°C.
4. Zanurz suche szkiełka nakrywkowe w roztworze na 15 minut. Wyjmij z roztworu i płucz w oczyszczonej wodzie przez minutę z każdej strony. Wysuszyć szkiełka nakrywkowe za pomocą źródła podciśnienia, aby spuścić oczyszczoną wodę. Poczekaj, aż roztwór Piranha ostygnie i dodaj do pojemnika na odpady Piranha, który pozostawia się z luźną nakrętką, dobrze zaznaczoną w okapie wyciągowym. Kiedy wszystkie liposomy, szkiełka nakrywkowe i białka są przygotowane, synapsa immunologiczna jest gotowa do utworzenia.
   

4. Formowanie dwuwarstw

1. Do formowania dwuwarstw nasze laboratorium wykorzystuje komory FCSII firmy Bioptechs, które mają zalety zintegrowanego ogrzewania. System FCSII znajduje się na podstawie ze stali nierdzewnej, która zaciska ze sobą kolektor mikroprzepływowy z uszczelką górną 0,5 mm, zjeżdżalnią mikroakweduktu pokrytą tlenkiem indu cyny do ogrzewania z jednej strony, z rowkiem płynnym po drugiej stronie, bezpyłową uszczelką 0,25 mm, która określa wysokość komory przepływowej oraz 40 mm okrągłą szkiełkiem nakrywkowym oczyszczoną przez Piranha, na której tworzy się dwuwarstwa.
2. Podczas gdy szkiełko nakrywkowe, na którym tworzy się dwuwarstwa, musi być wysoce hydrofilowe i czyste, zjeżdżalnia z mikroakweduktem działa lepiej, jeśli jest bardziej hydrofobowa. Uczynienie mikroakweduktu bardziej hydrofobowym uzyskuje się poprzez traktowanie go 1% HSA przez 60 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umycie czystą wodą i całkowite wysuszenie po tym procesie kondycjonowania, a także między użyciami. Powłoka zdenaturowanych białek pozostawiona przez tę procedurę pozwala 1 μl zawiesiny liposomowej utworzyć okrągłą, półkulistą kroplę o wysokości >0,25 mm.
3. Aby zmontować komórkę przepływową i utworzyć płaskie dwuwarstwy, umieść kolektor z rurkami skierowanymi do góry na płaskiej powierzchni. Następnie umieść wartość 0. Uszczelka 5 mm z otworami umieszczonymi nad rurkami fluidycznymi, upewniając się, że jest osadzona płasko. Delikatnie umieść stronę mikroakweduktu na uszczelce z kanałami płynowymi skierowanymi do góry i upewnij się, że jest osadzona płasko bez wywierania nacisku w dół, aż do sprawdzenia, czy otwory w suwaku są wyrównane z rurkami mikroprzepływowymi. Ułóż bezpyłową uszczelkę 0,25 mm z prostokątnym wycięciem na górze zjeżdżalni mikroakweduktu tak, aby kanał był wyrównany z kanałami płynowymi i nie było większych przestrzeni powietrznych.
4. Umieść do 5 x 1 μl kropli zawiesiny liposomowej na powierzchni zjeżdżalni mikroakweduktu w taki sposób, aby odległość od środka do środka między każdą kroplą wynosiła 2,5 mm. 5 kropli liposomowych może mieć różny skład, ale w tym przypadku utworzymy tylko dwie dwuwarstwy, jedną bez lipidów chelatujących Ni²⁺+ i jedną z 10% lipidów chelatujących Ni²⁺+.
5. Gdy te krople znajdą się na miejscu, ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na powierzchni jednym ruchem. Clamp na podstawie tak szybko, jak to możliwe. Krople liposomu powinny stykać się ze szkiełkiem nakrywkowym. Ten kontakt nie powinien zostać przerwany, ponieważ dwuwarstwy prawdopodobnie już się uformowały; Wszelkie zakłócenia mogą skutkować wadliwymi warstwami.
6. Ważne jest, aby pamiętać o oznaczeniu pozycji dwuwarstw kilkoma małymi plamkami atramentu na szkiełku mikroakweduktu, aby ułatwić ustawienie szkiełka nakrywkowego na mikroskopie. Odczekaj 20 minut, aby upewnić się, że system się zrównoważył. Wszystkie roztwory przenieść za pomocą strzykawki o pojemności 20 ml podłączonej do około 20 cm elastycznego rurki i 3-kierunkowego kranu. Podłącz inny port zaworu odcinającego do komory przepływowej za pomocą krótkiego odcinka rurki, aby zminimalizować martwą objętość między kranem a komorą przepływową. Napełnić strzykawkę solą fizjologiczną buforowaną przez HEPES zawierającą 2 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 5 mM glukozy i 1% albuminy surowicy ludzkiej.
7. Zalać rurkę i kurek, aby nie było pęcherzyków powietrza. Podłącz go do komórek przepływowych i przeciśnij 5 ml jednym ruchem, obserwując, czy żadne pęcherzyki powietrza nie przechodzą przez dwuwarstwę. Teraz będziesz miał swoje dwuwarstwy.

Ten artykuł wideo wspiera "Hunter to Gatherer and Back: Immunologiczne synapsy i kinapsy jako wariacje na temat ameboidalnej lokomocji" autorstwa Roczny przegląd biologii komórki i rozwoju, tom 24, 2008.