Wspierane dwuwarstwy płaskie do tworzenia i badania synaps immunologicznych oraz kinaps

Podsumowanie

Wsparte płaskie dwuwarstwy są potężnymi narzędziami, które mogą być wykorzystywane do modelowania oddziaływań molekularnych w synapsie immunologicznej. W niniejszej pracy przedstawiamy metody zakotwiczenia białek adhezyjnych komórek, o których wiadomo, że modulują one tworzenie synaps, w górnej warstwie dwuwarstwy lipidowej oraz wizualizacji procesu tworzenia synapsy za pomocą mikroskopii TIRF.

Streszczenie

Wspierane płaskie dwuwarstwy lipidowe są potężnymi narzędziami, które mogą być wykorzystywane do modelowania oddziaływań molekularnych w synapsie immunologicznej. Aby naśladować oddziaływania między limfocytami a komórkami prezentującymi antygen, wykorzystujemy lipidy chelatujące jony Ni2+ do zakotwiczenia rekombinowanych białek adhezji komórkowej oraz białek MHC z poli-histydynowymi znacznikami w górnej warstwie dwuwarstwy. Płaskie dwuwarstwy generuje się poprzez przygotowanie lipidów, przygotowanie powierzchni szklanych, na których powstanie dwuwarstwa, a następnie formowanie dwuwarstwy w specjalnej komorze zawierającej przepływową komórkę pomiarową, do której dodawane są limfocyty. Następnie dwuwarstwy nasyca się niklem i dodaje rekombinowane białka z histydynowym znacznikiem. Na koniec do komórki przepływowej wstrzykuje się limfocyty, a następnie za pomocą mikroskopii TIRF można obrazować tworzenie się synapsy oraz mechanizmy kontrolujące lokomocję limfocytów T, miejsca segregacji receptorów oraz miejsca ich degradacji.

Protokół

1. Przygotowanie lipidów

1. W celu przywiązania białek do górnej warstwy dwuwarstwy lipidowej stosujemy lipidy chelatujące Ni²⁺ , które kotwiczą białka rekombinowane z poli-histydynowymi znacznikami. Niektóre typy komórek mogą przylegać niespecyficznie do dwuwarstw powlekanych Ni²⁺, lecz limfocyty T zazwyczaj tego nie robią, co sprawia, że ta metoda jest optymalna do badania aktywacji limfocytów T.
2. Roztwór dwuwarstwy lipidowej przygotowuje się poprzez odważenie odpowiednich ilości 20% lipidów chelatujących Ni²⁺ oraz 80% fosfatydylocholiny do probówki szklanej z 1-2 ml chloroformu i metanolu.
   1. Odparuj rozpuszczalnik w strumieniu azotu w ciepłej (30-37°C) kąpieli wodnej. Zazwyczaj zajmuje to około 15 minut.
   2. Usuń pozostały rozpuszczalnik w wysokiej próżni, korzystając z liofilizatora przez 90 minut.
3. Rozpuść lipidy w 2% detergencie N-oktyloglukozydzie w buforze Tris-solnym, co tworzy roztwór mieszanych miceli detergentowo-fosfolipidowych. Końcowe stężenie fosfolipidów powinno wynosić 0.4 mM. Aby utworzyć liposomy, poddaj ten roztwór dializie przeciwko trzem zmianom buforu Tris-solnego w celu usunięcia detergentu i sformowania liposomów. Zazwyczaj pracujemy z objętościami rzędu 1 ml, używając membran Spectra/por #2 o średnicy 6 mm i progu odcięcia około 10 kDa. Należy uważać, aby podczas zaciskania rurek nie wprowadzić pęcherzyków powietrzas. Zazwyczaj filtrujemy ten roztwór sterylnie i przeprowadzamy dializę w warunkach czystych, operując w rękawicach sterylizowanych 70% etanolem.
4. Roztwór ten powinien być krystalicznie przejrzysty. Przechowuje się go pod gazem argonowym, aby zapobiec utlenianiu. Jeśli roztwór jest mętny, oznacza to, że powstały pęcherzyki wielowarstwowe i należy powtórzyć procedurę.

2. Określanie ilości ICAM-1 i MHC osadzonych na płaskiej dwuwarstwie

1. W celu przygotowania eksperymentu konieczne jest najpierw określenie, jaka ilość ICAM-1 i MHC jest osadzona na danej powierzchni dwuwarstwy chelatującej Ni²⁺ przy określonym stężeniu białka rozpuszczalnego. Aby to osiągnąć, należy osadzić dwuwarstwy na szklanych kuleczkach o średnicy 5 mikrometrów, inkubować kuleczki z roztworami białek w warunkach zbliżonych do tych w komorach przepływowych używanych do obrazowania, a następnie odczytać gęstość związanego białka za pomocą przepływowego testu immunofluorymetrycznego.
2. Do wykrywania białek związanych z powierzchnią wykorzystuje się przeciwciała znakowane FITC o znanej liczbie cząsteczek fluoresceiny na jedną cząsteczkę. Do kalibracji mikrofluorymetru przepływowego używa się standardowych kuleczek fluoresceiny.
3. Ustanowimy warunki zbliżone do tych występujących na komórkach prezentujących antygen, z 200 cząsteczkami/μm2 ICAM-1 oraz 0,2-20 cząsteczkami/μm2 kompleksu I-Ek-MCC91-103.
   

3. Czyszczenie szkiełek podstawowych do tworzenia planarnych dwuwarstw

1. Planarne dwuwarstwy tworzą się spontanicznie, gdy liposomy łączą się ze szkłem, ale tylko wtedy, gdy szkło jest odpowiednio oczyszczone.
2. Podczas pracy z odczynnikiem Piranha nosimy pełną odzież ochronną, w tym fartuch kwasoodporny oraz ciężkie, kwasoodporne rękawice. Należy starannie oddzielić  odpady od odpadów organicznych i zutylizować je w odpowiedni sposób.
3. Aby przygotować roztwór Piranha, do suchego zlewka należy wlać 75 ml stężonego kwasu siarkowego, a następnie ostrożnie dodać 25 ml 30% nadtlenku wodoru. Roztwór gwałtownie nagrzewa się do temperatury powyżej 100°C.
4. Suche szkiełka zakrywowe należy zanurzyć w roztworze na 15 minut. Następnie wyjąć je z roztworu i płukać w wodzie oczyszczonej przez minutę z każdej strony. Wysuszyć szkiełka zakrywowe, używając odsysania próżniowego do odprowadzenia wody oczyszczonej. Pozostawić roztwór Piranha do ochłonięcia, a następnie przelać go do pojemnika na odpady z odczynnikiem Piranha, który pozostaje z luźno zakręconą zakrętką i jest wyraźnie oznakowany w dygestorium. Po przygotowaniu wszystkich liposomów, szkiełek zakrywowych i białek synapsa immunologiczna jest gotowa do utworzenia.
   

4. Formowanie dwuwarstw

1. W celu utworzenia dwuwarstw, w naszym laboratorium stosujemy komory Bioptechs FCSII, które oferują zaletę w postaci zintegrowanego systemu grzewczego. System FCSII opiera się na podstawie ze stali nierdzewnej, która zaciska razem rozdzielacz mikroprzepływowy z górną uszczelką o grubości 0,5 mm, szkiełko mikroakweduktowe powlekone tlenkiem indu i cyny w celu ogrzewania jednej z powierzchni (z rowkiem płynowym po drugiej stronie), beztlenową uszczelką o grubości 0,25 mm definiującą wysokość komory przepływowej oraz oczyszczone w roztworze Piranha okrągłe szkiełko nakrywkowe o średnicy 40 mm, na którym tworzona jest dwuwarstwa.
2. Podczas gdy szkiełko nakrywkowe, na którym tworzona jest dwuwarstwa, musi być silnie hydrofilowe i czyste, szkiełko mikroakweduktowe w rzeczywistości działa lepiej, gdy jest bardziej hydrofobowe. Zwiększenie hydrofobowości mikroakweduktu osiąga się poprzez traktowanie go 1% HSA przez 60 minut w temperaturze pokojowej, a następnie płukanie czystą wodą i całkowite wysuszenie po tym procesie kondycjonowania, a także pomiędzy kolejnymi użyciami. Powłoka z denaturowanych białek pozostawiona po tej procedurze pozwala 1 μl zawiesiny liposomów utworzyć okrągłą, półsferyczną kroplę o wysokości >0,25 mm.
3. Aby złożyć ogniwo przepływowe i utworzyć płaskie dwuwarstwy, należy umieścić rozdzielacz z rurkami skierowanymi do góry na płaskiej powierzchni. Następnie należy położyć uszczelkę 0,5 mm tak, aby otwory znajdowały się nad rurkami płynowymi, upewniając się, że przylega ona płasko. Delikatnie należy położyć szkiełko mikroakweduktowe na uszczelce kanałami płynowymi do góry, dbając o to, by osiadło płasko bez wywierania nacisku w dół, aż do momentu potwierdzenia, że otwory w szkiełku pokrywają się z rurkami mikroprzływowymi. Na wierzchu szkiełka mikroakweduktowego należy położyć beztlenową uszczelkę 0,25 mm z prostokątnym wycięciem w taki sposób, aby kanał był wyrównany z kanałami płynowymi i nie występowały duże przestrzenie powietrzne.
4. Na powierzchni szkiełka mikroakweduktowego należy nanieść do 5 kropli zawiesiny liposomów o objętości 1 μl każda, w taki sposób, aby odległość od środka do środka między każdą kroplą wynosiła 2,5 mm. Pięć kropli liposomów może mieć różny skład, ale w tym przypadku utworzymy tylko dwie dwuwarstwy: jedną bez lipidów chelatujących Ni²⁺+ i jedną z 10% lipidów chelatujących Ni²⁺+.
5. Po umieszczeniu kropli należy ostrożnie i jednym ruchem położyć szkiełko nakrywkowe na powierzchni. Należy jak najszybciej zacisnąć całość na podstawie. Krople liposomów powinny zetknąć się ze szkiełkiem nakrywkowym. Kontakt ten nie może zostać przerwany, ponieważ dwuwarstwy prawdopodobnie już się utworzyły; jakiekolwiek zaburzenia mogą doprowadzić do powstania wadliwych dwuwarstw.
6. Ważne jest, aby zaznaczyć pozycje dwuwarstw za pomocą kilku małych plamek tuszu na szkiełku mikroakweduktowym, co ułatwi pozycjonowanie szkiełka nakrywkowego pod mikroskopem. Należy odczekać 20 minut, aby system osiągnął stan równowagi. Wszystkie roztwory należy przesyłać za pomocą strzykawki 20 ml podłączonej do około 20 cm elastycznej rurki i trójdrożnego kranu. Inny port kranu należy połączyć z ogniwem przepływowym krótkim odcinkiem rurki, aby zminimalizować objętość martwą między kranem a ogniwem. Strzykawkę należy napełnić roztworem soli w buforze HEPES zawierającym 2 mM MgCl₂, 1 mM CaCl₂, 5 mM glukozy i 1% albuminy surowicy ludzkiej.
7. Należy przepłukać rurkę i kran, aby nie było w nich pęcherzyków powietrza. Po podłączeniu do ogniw przepływowych należy jednym ruchem przepchnąć 5 ml cieczy, upewniając się, że żadne pęcherzyki powietrza nie przechodzą nad dwuwarstwą. W ten sposób dwuwarstwy są gotowe.

Niniejszy artykuł wideo uzupełnia publikację „Hunter to Gatherer and Back: Immunological Synapses and Kinapses as Variations on the Theme of Amoeboid Locomotion” autorstwa Michael L. Dustin, opublikowaną w Annual Review of Cell and Developmental Biology, tom 24, 2008.