Transgeniczne (Tg) modele mysie w chorobie Alzheimera (AD) stanowią doskonałą okazję do zbadania, w jaki sposób i dlaczego poziomy Aβ lub tau w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) zmieniają się wraz z postępem choroby u pacjentów. W niniejszej pracy prezentujemy udoskonaloną technikę punkcji cysterny wielkiej w celu seryjnego pobierania próbek CSF od myszy.
Subskrypcja JoVE jest wymagana do oglądania tego materiału. Zaloguj się lub rozpocznij bezpłatny okres próbny.
Artykuł metodologiczny
Technika seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z cysterny wielkiej u myszy
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Choroba Alzheimera (AD) jest postępującą chorobą neurodegeneracyjną, której obraz patologiczny charakteryzuje się zewnątrzkomórkowym odkładaniem peptydu β-amyloidu (Aβ) oraz wewnątrzneuronalną akumulacją hiperfosforylowanego białka tau. Ponieważ płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) pozostaje w bezpośrednim kontakcie z przestrzenią zewnątrzkomórkową mózgu, odzwierciedla on zmiany biochemiczne zachodzące w mózgu w odpowiedzi na procesy patologiczne. W CSF pacjentów z AD obserwuje się spadek poziomu 42-aminokwasowej formy Aβ (Aβ42) oraz wzrost całkowitego poziomu białka tau i tau hiperfosforylowanego, choć mechanizmy odpowiedzialne za te zmiany nie są jeszcze w pełni zrozumiałe. Transgeniczne (Tg) modele mysie AD stanowią doskonałą okazję do zbadania, w jaki sposób i dlaczego poziomy Aβ lub tau w CSF zmieniają się wraz z postępem choroby. W niniejszej pracy prezentujemy udoskonaloną technikę punkcji cysterny wielkiej w celu pobierania CSF od myszy. Ta niezwykle delikatna technika pobierania pozwala na pozyskiwanie seryjnych próbek CSF od tej samej myszy w odstępach 2-3 miesięcznych, co znacznie minimalizuje zakłócający wpływ zmienności międzyosobniczej poziomów Aβ lub tau, umożliwiając wykrycie subtelnych zmian w czasie. W połączeniu z testem ELISA dla Aβ i tau, technika ta będzie użyteczna w badaniach mających na celu analizę zależności między poziomami Aβ42 i tau w CSF a ich metabolizmem w mózgu w mysich modelach AD. Badania na myszach Tg mogą dostarczyć istotnej walidacji w kwestii potencjału wykorzystania poziomów Aβ lub tau w CSF jako markerów biologicznych do monitorowania postępu choroby oraz efektów interwencji terapeutycznych. Dzięki możliwości uśmiercenia myszy i zbadania mózgów pod kątem zmian biochemicznych lub histologicznych, można lepiej ocenić mechanizmy leżące u podstaw zmian w CSF. Dane te mogą być pomocne w interpretacji zmian w CSF u ludzi z chorobą Alzheimera.
Protokół
Wyciąganie szklanej rurki kapilarnej
- Szklaną rurkę kapilarną zakupiono w firmie The Sutter Instrument Inc (szkło borokrzemowe, B100-75-10).
- Rurki kapilarne należy wyciągnąć za pomocą wyprawiacza mikropipet Sutter P-87, ustawiając indeks ciepła na 300, a indeks ciśnienia na 330.
- Końcówkę szklanej rurki kapilarnej należy przyciąć nożyczkami tak, aby zwężona końcówka miała średnicę wewnętrzną około 0,5 mm.
Technika nakłucia cysterny wielkiej w celu pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego
Próbki płynu mózgowo-rdzeniowego pobiera się z cysterny wielkiej (Rysunek 1) metodą opisaną w poprzedniej publikacji 1.
Rysunek 1
1. Myszy są znieczulone ketaminą (100mg/kg) i ksylazyną (10mg/kg), podanymi wewnątrzbrzusznie. Podczas indukcji znieczulenia myszy są utrzymywane w inkubatorze w temperaturze 37oC.
2. Skórę szyi ogala się, a następnie mysz umieszcza się w pozycji brzusznej na aparacie stereotaksycznym w bezpośrednim kontakcie z matą grzewczą. Do odbytu wprowadza się sondę temperatury odbytniczej, aby ciepło generowane przez matę grzewczą było regulowane w odpowiedzi na zmiany temperatury ciała. Głowę unieruchamia się za pomocą adapterów głowowych. Pole operacyjne przeciera się 10% povidone iodine, a następnie 70% etanolem (powtórzyć 3 razy), po czym wykonuje się strzałkowe nacięcie skóry poniżej potylicy.
3. Pod mikroskopem stereoskopowym tkankę podskórną i mięśnie (m. biventer cervicis oraz m. rectus capitis dorsalis major) rozdziela się za pomocą tępego rozczepiania pęsetą. Do odsunięcia i utrzymania mięśni stosuje się parę mikroretraktorów.
4. Myszy kładzie się w taki sposób, aby głowa tworzyła z ciałem kąt wynoszący blisko 135o.
5. Pod mikroskopem stereoskopowym opona twarda w obrębie cysterny wielkiej (cisterna magna) widoczna jest jako lśniący i przejrzysty odwrócony trójkąt, przez który można dostrzec rdzeń przedłużony, główne naczynie krwionośne (arteria dorsalis spinalis) oraz przestrzeń wypełnioną CSF (Rycina 2).
Rycina 2
6. Oponę twardą osuszamy sterylnym patyczkiem bawełnianym. Wprowadzamy rurkę kapilarną do cysterny wielkiej (citerna magna) przez oponę twardą, bocznie w stosunku do tętnicy grzbietowej rdzenia (arteria dorsalis spinalis) (Rysunek 2). Po zauważalnej zmianie oporu podczas wprowadzania rurki kapilarnej, płyn mózgowo-rdzeniowy wpływa do rurki kapilarnej.
7. Ostrożnie wyjmij kapilarę i połącz ją ze strzykawką o pojemności 3 ml za pomocą rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 1 mm. Wstrzyknij CSF do uprzednio oznakowanej probówki eppendorfa o pojemności 0,5 ml, natychmiast zamroź probówkę na suchym lodzie, a następnie przenieś ją do zamrażarki w temperaturze -80°C.
8. Po pobraniu próbek CSF mięśnie są ponownie ustawiane w odpowiedniej pozycji, a skórę zszywa się (4-0, Ethicon, Johnson & Johnson). Podskórnie wstrzykuje się około 1 ml 0.9% NaCl, aby zapobiec odwodnieniu. Myszy przechowuje się w inkubatorze w celu utrzymania temperatury ciała aż do momentu wybudzenia; masę ciała myszy monitoruje się 1 dzień oraz 1 tydzień po zabiegu.
Wyniki i dyskusja
Opisaliśmy wysoce niezawodny protokół seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) od myszy bez wykrywalnego zanieczyszczenia osoczem.
1. Cała procedura trwa zazwyczaj 10 min na mysz (wliczając znieczulenie). Objętość uzyskanego CSF zależy od szczepu myszy. W przypadku myszy double Tg PS/APP 2, których używaliśmy, średnia objętość wynosi około 5 μl (od 3 do 7 μl), natomiast myszy P301L (JNPL3) 3 dają wydajność około 10 μl- 15 μl. W przypadku pobierania seryjnego, za każdym razem można bezpiecznie pobrać maksymalnie 7-8 μl w odstępach 2-3 miesięcy.
2. Podczas operacji ważne jest prawidłowe ustawienie głowy i ciała myszy w aparacie stereotaktycznym, aby umożliwić wystarczającą ekspozycję opony twardej w obrębie cysterny wielkiej. Należy zachować ostrożność i unikać naczyń krwionośnych podczas przebijania opony twardej kapilarą, aby zapobiec zanieczyszczeniu białkami osocza, co można monitorować w próbce CSF za pomocą immunoblottingu w kierunku ApoB 4.
3. Minimalizacja uszkodzeń tkanek podczas każdego zabiegu jest istotna, ponieważ zrosty tkankowe mogą utrudnić dalsze prace, zwiększając ryzyko krwawienia podczas kolejnych pobrań próbek.
4. Podczas operacji należy dbać o utrzymanie stałej temperatury ciała, ponieważ hipotermia wywołana znieczuleniem może bardzo szybko i znacząco wpłynąć na poziomy fosforylowanego białka tau w mózgu 5.
5. Protokół Ab ELISA oraz przeciwciała, których użyliśmy, zostały szczegółowo opisane w pracy Refolo et al. 6. Dwa μl płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) od myszy PS/APP dadzą satysfakcjonujące wyniki przy rozcieńczeniu 1:50-1:60. W przypadku tau ELISA, 4-5 μl CSF od myszy P301L (JNPL3) będzie wystarczające do wykrycia całkowitego białka tau lub białka tau fosforylowanego w treoninie 231 (zestachniki zakupiono w firmie Bio-Source).
6. Technikę tę można zastosować w innych modelach mysich chorób neurologicznych, w których niewielka objętość płynu mózgowo-rdzeniowego jest wystarczająca do przeprowadzenia wymaganych analiz.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Dyskusja
Opisaliśmy wysoce niezawodny protokół seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego od myszy bez wykrywalnej kontaminacji osoczem.
1. Cała procedura trwa zazwyczaj 10 min na mysz (wliczając znieczulenie). Objętość uzyskanego CSF zależy od szczepu myszy. W przypadku myszy double Tg PS/APP, których używaliśmy2, średnia objętość wynosi około 5 μl (od 3 do 7 μl), natomiast myszy P301L (JNPL3) 3 dają wydajność około 10 μl- 15 μl. W przypadku pobierania seryjnego, przy odstępach 2-3 miesięcy, możn...
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Podziękowania
Nasza praca jest finansowana z grantów NIH NS048447 i AG017216 przyznanych KD. Li Liu pragnie podziękować dr. Heikkiemu Tanili (University of Kuopio, Kuopio, Finlandia) za nadzór i wsparcie podczas opracowywania oryginalnego protokołu.
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Bibliografia
- Liu, L., et al. Longitudinal observation on CSF Abeta42 levels in young to middle-aged amyloid precursor protein/presenilin-1 doubly transgenic mice. Neurobiol Dis. 17, 516- (2004).
- Holcomb, L., et al. Accelerated Alzheimer-type phenotype in transgenic mice carrying both mutant amyloid precursor protein and presenilin 1 transgenes. Nat Med. 4, 97(1998).
- Lewis, J., et al. Neurofibrillary tangles, amyotrophy and progressive motor disturbance in mice expressing mutant (P301L) tau protein. Nat Genet. 25, 402- (2000).
- DeMattos, R. B., et al. Plaque-associated disruption of CSF and plasma amyloid-beta (Abeta) equilibrium in a mouse model of Alzheimer's disease. J Neurochem. 81, 229(2002).
- Planel, E., et al. Anesthesia leads to tau hyperphosphorylation through inhibition of phosphatase activity by hypothermia. J Neurosci. 27, 3090(2007).
- Refolo, L. M., et al. A cholesterol-lowering drug reduces beta-amyloid pathology in a transgenic mouse model of Alzheimer's disease. Neurobiol Dis. 8, 890(2001).
Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.
Przedruki i uprawnienia
