Technika seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego z cysterny wielkiej u myszy

Podsumowanie

Transgeniczne (Tg) modele mysie choroby Alzheimera (AD) stanowią doskonałą okazję do zbadania, w jaki sposób i dlaczego poziomy Aβ lub tau w płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) zmieniają się wraz z postępem choroby u pacjentów. W niniejszej pracy prezentujemy udoskonaloną technikę punkcji cysterny wielkiej w celu seryjnego pobierania próbek CSF od myszy.

Streszczenie

Choroba Alzheimera (AD) jest postępującą chorobą neurodegeneracyjną, charakteryzującą się patologicznie pozakomórkowym odkładaniem peptydu β-amyloidu (Aβ) oraz wewnątrzneuronalną akumulacją hiperfosforylowanego białka tau. Ponieważ płyn mózgowo-rdzeniowy (CSF) pozostaje w bezpośrednim kontakcie z przestrzenią pozakomórkową mózgu, odzwierciedla on zmiany biochemiczne w mózgu zachodzące w odpowiedzi na procesy patologiczne. W CSF pacjentów z AD obserwuje się spadek poziomu formy Aβ składającej się z 42 aminokwasów (Aβ42) oraz wzrost całkowitego białka tau i białka tau hiperfosforylowanego, choć mechanizmy odpowiedzialne za te zmiany nie są jeszcze w pełni zrozumiałe. Transgeniczne (Tg) modele mysie AD stwarzają doskonałą okazję do zbadania, w jaki sposób i dlaczego poziomy Aβ lub tau w CSF zmieniają się wraz z postępem choroby. W niniejszej pracy prezentujemy udoskonaloną technikę punkcji cysterny wielkiej do pobierania CSF od myszy. Ta niezwykle delikatna metoda pobierania próbek pozwala na seryjne uzyskiwanie próbek CSF od tej samej myszy w odstępach 2-3 miesięcznych, co znacznie minimalizuje wpływ zmienności międzyosobniczej poziomów Aβ lub tau i umożliwia wykrycie subtelnych zmian w czasie. W połączeniu z testem ELISA dla Aβ i tau, technika ta będzie przydatna w badaniach mających na celu analizę związku między poziomami Aβ42 i tau w CSF a ich metabolizmem w mózgu w mysich modelach AD. Badania na myszach Tg mogą dostarczyć ważnej walidacji w zakresie potencjału wykorzystania poziomów Aβ lub tau w CSF jako biomarkerów do monitorowania postępu choroby oraz oceny efektów interwencji terapeutycznych. Ponieważ myszy mogą zostać uśpione, a ich mózgi poddane badaniu pod kątem zmian biochemicznych lub histologicznych, można lepiej ocenić mechanizmy leżące u podstaw zmian w CSF. Dane te mogą być pomocne w interpretacji zmian w CSF u ludzi z chorobą Alzheimera.

Protokół

Wyciąganie szklanej rurki kapilarnej

1. Szklane kapilary zakupiono w firmie The Sutter Instrument Inc (szkło borokrzemianowe, B100-75-10).
2. Kapilary należy wyciągnąć za pomocą wyciągarki do mikropipet Sutter P-87, ustawiając wskaźnik ciepła (heat index) na 300 oraz wskaźnik ciśnienia (pressure index) na 330.
3. Koniec szklanej kapilary należy przyciąć nożyczkami w taki sposób, aby zwężająca się końcówka miała średnicę wewnętrzną około 0.5 mm.

Technika nakłucia cysterny wielkiej w celu pobrania płynu mózgowo-rdzeniowego

Próbki CSF pobiera się z cysterny wielkiej (rycina 1), stosując metodę opublikowaną wcześniej ¹.



Rycina 1

1. Myszy są znieczulane ketaminą (100mg/kg) i ksylazyną (10mg/kg), podawanymi domięśniowo. Podczas indukcji znieczulenia myszy są utrzymywane w inkubatorze w temperaturze 37^oC.

2. Skórę szyi ogala się, a następnie mysz umieszcza się w pozycji brzusznej na aparacie stereotaksycznym w bezpośrednim kontakcie z matą grzewczą. Do odbytu wprowadza się sondę temperatury rektalne, aby możliwe było dostosowanie ciepła generowanego przez matę grzewczą w odpowiedzi na zmiany temperatury ciała. Głowę unieruchamia się za pomocą adapterów głowowych. Miejsce operacyjne przemywa się 10% povidone jodem, a następnie 70% etanolem (powtórzyć 3 razy), po czym wykonuje się strzałowe nacięcie skóry poniżej potylicy.

3. Pod mikroskopem sekcyjnym tkankę podskórną oraz mięśnie (m. biventer cervicis i m. rectus capitis dorsalis major) rozdziela się metodą tępej dyssekcji za pomocą pęsety. Do rozsunięcia mięśni wykorzystuje się parę mikroretraktorów.

4. Myszkę ułożono tak, aby głowa tworzyła z ciałem kąt bliski 135^o.

5. Pod mikroskopem sekcyjnym opona twarda w obrębie cysterny wielkiej (cisterna magna) jawi się jako lśniący i przejrzysty odwrócony trójkąt, przez który widoczny jest rdzeń przedłużony, główne naczynie krwionośne (arteria dorsalis spinalis) oraz przestrzeń płynu mózgowo-rdzeniowego (Rysunek 2).



Rysunek 2

6. Oponę twardą osusza się sterylnym patyczkiem bawełnianym. Kapilarną rurkę wprowadza się do cisterna magna przez oponę twardą, bocznie w stosunku do arteria dorsalis spinalis (Rycina 2). Po zauważalnej zmianie oporu podczas wprowadzania rurki kapilarnej, płyn mózgowo-rdzeniowy zaczyna wpływać do rurki.

7. Ostrożnie wyjmij kapilarę i połącz ją z strzykawką o pojemności 3 ml za pomocą rurki polietylenowej o średnicy wewnętrznej 1 mm. Wstrzyknij CSF do wcześniej oznakowanej probówki Eppendorf o pojemności 0,5 ml, natychmiast zamroź probówkę na suchym lodzie, a następnie przenieś ją do zamrażarki o temperaturze -80°C.

8. Po pobraniu próbek CSF mięśnie są ponownie ustawione w odpowiedniej pozycji, a skórę zaszywa się (4-0, Ethicon, Johnson & Johnson). Aby zapobiec odwodnieniu, podskórnie wstrzykuje się około 1 ml 0,9% NaCl. Myszy utrzymuje się w inkubatorze w celu zachowania temperatury ciała do czasu wyzdrowienia; masę ciała myszy monitoruje się 1 dzień i 1 tydzień po zabiegu.

Wyniki i dyskusja

Opisaliśmy wysoce niezawodny protokół seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) od myszy bez wykrywalnej kontaminacji plazmą.

1. Cała procedura zwykle trwa 10 min na mysz (wliczając znieczulenie). Objętość uzyskanego CSF zależy od szczepu myszy. W przypadku myszy podwójnie transgenicznych PS/APP ², których użyliśmy, średnia objętość wynosi około 5 μl (od 3 do 7 μl), natomiast myszy P301L (JNPL3) ³ dają uzysk około 10 μl- 15 μl. W przypadku pobierania seryjnego, można bezpiecznie pobrać maksymalnie 7-8 μl podczas każdego procesu w odstępach 2-3 miesięcy.

2. Podczas operacji ważne jest odpowiednie ustawienie głowy i ciała myszy w ramie stereotaktycznej, tak aby opona twarda cysterny wielkiej była wystarczająco odsłonięta. Należy ostrożnie omijać naczynia krwionośne podczas przebijania opony twardej rurką kapilarną, aby zapobiec zanieczyszczeniu białkami osocza, co można monitorować w próbce CSF za pomocą immunoblottingu przeciwciałem przeciwko ApoB ⁴.

3. Minimalizacja uszkodzeń tkanek podczas każdego zabiegu jest istotna, ponieważ zrosty tkankowe mogą zwiększyć stopień trudności, predysponując do krwawień podczas kolejnych pobrań próbek.

4. Podczas operacji należy dbać o utrzymanie prawidłowej temperatury ciała, ponieważ hipotermia wywołana znieczuleniem może bardzo szybko i znacząco wpłynąć na poziom fosforylowanego białka tau w mózgu ⁵.

5. Protokół badania ELISA dla Ab oraz przeciwciała, których użyliśmy, zostały szczegółowo opisane w pracy Refolo i wsp. ⁶. Dwa μl płynu mózgowo-rdzeniowego (CSF) od myszy PS/APP dadzą satysfakcjonujące wyniki po rozcieńczeniu 1:50-1:60. W przypadku badania ELISA dla białka tau, 4-5 μl CSF od myszy P301L (JNPL3) będzie wystarczające do wykrycia całkowitego poziomu tau lub tau fosforylowanego w treoninie 231 (zestawy zakupiono w Bio-Source).

6. Technikę tę można zastosować w innych modelach mysich chorób neurologicznych, w których niewielka objętość CSF jest wystarczająca do przeprowadzenia wymaganych analiz.

Dyskusja

Opisaliśmy wysoce niezawodny protokół seryjnego pobierania płynu mózgowo-rdzeniowego od myszy bez wykrywalnej kontaminacji osoczem.

1. Cała procedura zazwyczaj trwa 10 min na mysz (wliczając znieczulenie). Objętość uzyskanego CSF zależy od szczepu myszy. W przypadku użytych przez nas myszy PS/APP double Tg 2, średnia objętość wynosi około 5 μl (od 3 do 7 μl), natomiast myszy P301L (JNPL3) 3 dają wydajność około 10 μl- 15 μl. W przypadku pobierania seryjnego, bezpiecznie można pobrać maksymaln...