Protokół hodowli neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych (SCG) szczura

Podsumowanie

Niniejszy protokół opisuje sposób izolacji i hodowli pierwotnych neuronów współczulnych z zwojów szyjnych górnych (SCG) nowo narodzonych szczurów.

Streszczenie

Zgorzele szyjne górne (SCG) u szczurów to małe, błyszczące, migdałowate struktury zawierające neurony współczulne. Neurony te zapewniają unerwienie współczulne obszarów głowy i szyi oraz stanowią dobrze scharakteryzowaną i stosunkowo jednorodną populację (4). Neurony współczulne są zależne od czynnika wzrostu nerwów (NGF) w zakresie przeżywalności, różnicowania i wzrostu aksonów, a szeroka dostępność NGF ułatwia ich hodowlę oraz manipulacje eksperymentalne (2, 3, 6). Z tych reasons hodowlane neurony współczulne były wykorzystywane w szerokim zakresie badań, w tym nad rozwojem i różnicowaniem neuronów, mechanizmami programowanej i patologicznej śmierci komórek oraz transdukcją sygnału (1, 2, 5 i 6). Wyizolowanie SCG od nowonarodzonych szczurów i hodowla neuronów współczulnych nie są skomplikowane i można w nich szybko osiągnąć biegłość. W niniejszym artykule szczegółowo opiszemy sposób wyizolowania SCG z nowonarodzonych szczurząt oraz ich wykorzystania do tworzenia kultur neuronów współczulnych. W artykule opisane zostaną również kroki przygotowawcze oraz różnorodne odczynniki i sprzęt niezbędne do osiągnięcia tego celu.

Protokół

1. Przygotowanie do sekcji:

1. Wybierz odpowiednie naczynie hodowlane (płytki 10 cm, 6-dołkowe lub 24-dołkowe itp.) w zależności od charakteru przeprowadzanych doświadczeń i pokryj je kolagenem z ogona szczura na 24 godziny przed sekcją. Metody przygotowania kolagenu z ogona szczura i jego wykorzystania do pokrywania naczyń hodowlanych zostały opisane w innym opracowaniu (1).
2. Przygotuj 0,25% roztwór trypsyny w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS) (bez EDTA) i wysterylizuj go przez filtrację. Przygotuj alikwoty po 1 ml i przechowuj w temperaturze -20ºC.
3. Przygotuj roztwór zawierający po 2,5 mM urydyny i 5-FDU w destylowanej/dejonizowanej H₂O. Wysterylizuj go przez filtrację i przygotuj alikwoty po 50 µl. Przechowuj w temperaturze -20ºC.
4. Przygotuj pożywkę kompletną: pożywka hodowlana RPMI 1640 z 10% inaktywowaną termicznie surowicą konia (inaktywacja termiczna poprzez inkubację w kąpieli wodnej o temperaturze 56ºC przez 30 minut) i 5% płodową surowicą bydlęcą.
5. Przygotuj pożywkę końcową: pożywka hodowlana RPMI 1640 z 1% inaktywowaną termicznie surowicą konia + NGF (stężenie końcowe 100ηg/ml) + penicylina/streptomycyna (1/250) + 1/250 roztworu urydyny/5-FDU (stężenie końcowe 10 µM). Uwaga: pożywkę tę należy przygotowywać świeżo przed każdym użyciem. W przypadku doświadczenia w formacie płytki 24-dołkowej konieczne będzie przygotowanie 12 ml tej pożywki. Zaleca się przygotowanie niewielkiej nadwyżki. NGF można nabyć z różnych źródeł komercyjnych (patrz tabela na końcu protokołu).
6. Sprzęt: Niezbędny będzie mikroskop sekcyjny i źródło światła. Preferowany jest podwójny światłowodowy oświetlacz typu „gęsia szyja” z końcówkami skupiającymi. Ponadto należy oczyścić i wysterylizować (poprzez autoklawowanie lub moczenie w 70% etanolu przez co najmniej 20 minut) następujące narzędzia sekcyjne: dwie pary mikro-pincet sekcyjnych ze stali nierdzewnej oraz parę nożyczek sekcyjnych (również ze stali nierdzewnej, obie marki Roboz). Przydadzą się również dwie sterylne igły do strzykawek (rozmiar 26 G x 1 ½ cala lub podobne). Należy przygotować deskę sekcyjną, która stanowi kawałek styropianu o wymiarach 3”x3”, owinięty folią aluminiową i przykryty chusteczką Kimwipe. Spryskaj deskę 70% etanolem w celu dekontaminacji. Na koniec przygotuj szklaną pipetę Pasteura polerowaną ogniowo. Aby przeprowadzić polerowanie ogniowe, weź szklaną pipetę i trzymaj jej końcówkę w płomieniu przez kilka sekund, obracając nią. Po sprawdzeniu końcówka powinna być gładsza, a otwór węższy. Jest to niezbędne do etapu dysocjacji komórek. Polerowanie ogniowe wykonaj pod wyciągiem do hodowli komórkowych, aby pipeta pozostała sterylna.

2. Disekcja zwojów szyjnych górnych:

1. Pobierz noworodki szczura w wieku P0 lub P1.
2. Szybko przemyj noworodka 70% etanolem przed sekcją, aby zmniejszyć ryzyko kontaminacji.
3. Szybko dokonaj dekapitacji noworodka za pomocą ostrych nożyczek (ten etap nie zostanie pokazany na filmie). Przytrzymaj głowę za pomocą sterylnej pęsety przeciwko sterylnej gazie, aby krótko odprowadzić nadmiar krwi.
4. Umieść głowę na podkładce sekcyjnej stroną brzuszną do góry, a końcem ogonowym skierowanym w Twoją stronę. Przecięta tchawica powinna być wyraźnie widoczna. Użyj sterylnych igieł ze strzykawki, aby przymocować odciętą głowę do podkładki sekcyjnej w następujący sposób: wbij jedną szpilkę przez podniebienie w podkładkę, a drugą szpilkę przez przeciętą tchawicę w podkładkę. Umieść podkładkę pod mikroskopem sekcyjnym i rozpocznij sekcję.
5. Używając obu pęset (jedna w każdej ręce), usuń skórę i tkankę tłuszczową wokół tchawicy, uważając, aby nie zagłębić się zbyt mocno. Pozwoli to odsłonić parę mięśni biegnących niemal równolegle do siebie po obu stronach tchawicy. Uwaga: podczas sekcji konieczne będzie przemywanie zimnym, sterylnym PBS lub zimną pożywką RPMI 1640 bez surowicy, podawaną sterylną pipetą Pasteura, w celu usunięcia nadmiaru krwi oraz utrzymania obszaru w czystości i wilgotności. Można to zrobić raz lub wielokrotnie, w zależności od tempa pracy. Doświadczonemu sekcjonerowi wypreparowanie pary zwojów zajmuje około dwóch do trzech minut.
6. Użyj pęsety, aby przeciąć i usunąć mięsień najpierw po jednej stronie.
7. Po usunięciu mięśnia widoczna stanie się tętnica szyjna wspólna. Często ma ona jasnoróżowy kolor i zawiera krew. Może wydawać się jaśniejsza od innych naczyń krwionośnych widocznych w sąsiedztwie, przez co tętnica szyjna wspólna może nie być od razu zauważalna. Tętnica ta biegnie wzdłuż tchawicy i rozwidla się w kształt przypominający literę „Y”. To rozwidlenie jest ważnym punktem orientacyjnym i po jego zlokalizowaniu stosunkowo łatwo będzie odnaleźć SCG.
8. Przetnij tętnicę na najbardziej ogonowym końcu i lekko unieś ją pęsetą (drugi koniec pozostaje przyczepiony). Po wykonaniu tej czynności zobaczysz migdałowatą, lśniącą, małą masę tkanki, która jest luźno przytwierdzona do tętnicy dokładnie w punkcie rozwidlenia i posiada nitkowate połączenia przed- i/lub pozwojowe. Jest to górny zwoj szyjny. Użyj drugiej pęsety w drugiej ręce, aby delikatnie go oddzielić i umieścić w małej płytce hodowlanej (35 mm) zawierającej zimną pożywkę RPMI 1640 bez surowicy.
9. Następnie wypreparuj zwoj po drugiej stronie tchawicy, postępując zgodnie z tym samym protokołem.

3. Oczyszczanie zwojów:

1. Po wypreparowaniu wszystkich zwojów należy je w maksymalnym stopniu oczyścić z tkanek obcych.
2. Pod mikroskopem sekcyjnym można zauważyć, że do zwojów przyłączone są fragmenty tętnicy szyjnej, tkanka tłuszczowa lub inne tkanki. Używając pęset w obu dłoniach, należy ostrożnie usunąć te niepożądane materiały. Oczyszczone zwoje należy umieścić w sterylnej, stożkowej probówce polipropylenowej o pojemności 15ml, zawierającej pożywkę RPMI 1640.
3. Należy również odciąć łączniki przed- i/lub pozazwojowe. Każdy zwój zawiera około 10 000 neuronów. Po wysianiu na podłoże neurony odtworzą swoje neuryty.

4. Zakładanie hodowli neuronów współczulnych:

1. Odwiruj zwoje przy 200xg przez 2 minuty i odlej supernatant.
2. Resuspenduj zwoje w 0,5 do 1 ml 0,25% roztworu trypsyny. Umieść w kąpieli wodnej lub inkubatorze w temperaturze 37˚C na 30 minut. Pomoże to w dysocjacji komórek w zwojach.
3. Po 30 minutach dodaj 10 ml Pożywki Kompleksowej (Complete Medium), aby rozcieńczyć i zneutralizować trypsynę, a następnie odwiruj przy 200xg przez 2 minuty.
4. Odlej supernatant i resuspenduj w 2 ml Pożywki Końcowej (Final Medium).
5. Dalszą dysocjację komórek przeprowadź poprzez tryturację zwojów za pomocą wypalanej szklanej pipety Pasteura. Tryturuj zwoje 20 razy, a następnie umieść probówkę na lodzie na kilka minut.
6. W międzyczasie dodatkowo wypal pipetę, aby zwęzić otwór (do średnicy około 2/3 do 1/2 mm). Odczekaj kilka minut do ostygnięcia i ponownie tryturuj zwoje 20 razy. W miarę kontynuowania procesu pożywka będzie stawać się coraz bardziej mętna, co wskazuje na dysocjację komórek. Powtórz ten krok raz lub dwa razy więcej, w zależności od stopnia dysocjacji komórek. Po pewnym czasie zauważysz, że wszystkie zwoje uległy dysocjacji do neuronów i w probówce nie widać już nienaruszonych zwojów. Może pozostać niewielka ilość materiału tkankowego, który nie uległ dysocjacji. W tym momencie pozostaw probówkę na lodzie na kilka minut, aby niedysocjowane resztki opadły na dno. Następnie ostrożnie zbierz prawie całą pożywkę z góry i przelej do innej probówki. Aby uniknąć zebrania niedysocjowanych resztek, pozostaw około 50 µl na dnie probówki. Do probówki z dysocjowanymi komórkami dodaj więcej Pożywki Końcowej: objętość ta zależy od rodzaju płytki inkubacyjnej używanej do hodowli neuronów. Na przykład: jeśli używany jest wypływek 24-dołkowy, wysiej 0,5 zwoju na dołek (~10 000 neuronów na dołek) w 0,5 ml Pożywki Końcowej na dołek. Typowy miot szczura składa się z 12 młodych, co daje 24 zwoje. Jest to wystarczająca ilość, aby zasiać jedną płytkę 24-dołkową, a całkowita objętość Pożywki Końcowej wynosi 12 ml. Uwaga: zwoje zawierają również niewielką populację glii i innych typów komórek, które będą obecne w hodowli. Zastosowanie Uridyny/5-FDU w Pożywce Końcowej zapobiegnie ich proliferacji i przyspieszy ich obumieranie.
7. Dokarmiaj komórki co 48 godzin, wymieniając 2/3 pożywki na świeże RPMI + 1% surowicy konskiej + NGF oraz urydynę/5-FDU. Uwaga: Na początku hodowla zawiera neurony współczulne, które wyglądają na okrągłe i nie posiadają neurytów. Krótkie neuryty stają się widoczne 24 godziny po wyizolowaniu i z czasem stają się coraz gęstsze i bardziej rozgałęzione.

Dyskusja

Do naszych hodowli wykorzystujemy szczury Sprague Dawley.

Czyszczenie zwojów należy przeprowadzić starannie i z należytą uwagą. Należy usunąć wszystkie zanieczyszczenia, naczynia krwionośne oraz tkankę tłuszczową. Krok ten jest istotny dla uzyskania kultury w miarę jednorodnej i wolnej od obcych typów komórek. Dodatek uridine/5-FDU w znacznym stopniu wyeliminuje wszelkie pozostałe nieneuronalne (mitotyczne) komórki zanieczyszczające kulturę lub przynajmniej zahamuje ich proliferację.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pęseta stalowa, nr 5	Narzędzie	Roboz Surgical Instruments Co.	RS4976
Nożyczki DEAVER proste, ostra-tępa krawędź, ostrza 43mm - 5,5	Narzędzie	Roboz Surgical Instruments Co.	RS6760
RPMI 1640 z L-glutaminą	Odczynnik	Cellgro	10-040-CV
Płodowa surowica bydlęca	Odczynnik	SAFC Global	12103c
Surowica końska od dawcy	Odczynnik	JRH Biosciences	12449	Inaktywować termicznie, inkubując w kąpieli wodnej o temperaturze 56°C przez 30 minut.
Penicylina/streptomycyna	Odczynnik	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
Trypsyna bez EDTA	Odczynnik	Difco Laboratories	MT 25-050-CI
Urydyna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	U3003
5-Fluoro-5’-deoksyurydyna	Odczynnik	Sigma-Aldrich	F-8791
NGF	Odczynnik	Harlan Laboratories	BT-5025
Mikroskop stereoskopowy i źródło światła	Mikroskop
Probówki polipropylenowe 15 ml	Narzędzie	BD Biosciences	352096
Szalki do hodowli komórkowych	Narzędzie	Corning