2.10: Analiza jakości wody za pomocą organizmów wskaźnikowych

1. Test obecności – nieobecności Colilert (P – A)

1. Otwórz plastikową butelkę Colilert o pojemności 100 ml. W butelce znajduje się niewielka ilość sproszkowanego odczynnika, który jest niezbędny do prawidłowych reakcji, nie należy wyrzucać tego proszku.
2. Dodaj 100 ml próbki wody do butelki Colilert.
3. Otwórz rurkę poduszki zawierającą substrat odżywczy i wlej zawartość do próbki wody znajdującej się w butelce Colilert.
4. Zakręć i zamknij butelkę Colilert. Energicznie wstrząsnąć butelką, kilkakrotnie odwracając butelkę, aż podłoże całkowicie się rozpuści.
5. Inkubować mieszaninę odczynnika/próbki wody w butelce w temperaturze 35 ± 0,5 °C przez 24 godziny.
6. Obserwuj zmianę koloru żółtego w mieszaninie odczynnik/woda próbki. Żółty kolor oznacza, że występuje bakteria z grupy coli. Czysta woda lub brak zmiany koloru wskazują, że bakterie z grupy coli są nieobecne.
7. Wystawić próbkę odczynnika/wody na działanie światła ultrafioletowego i obserwować niebieską fluorescencję. Niebieska fluorescencja wskazuje, że E. coli jest obecny. Brak fluorescencji wskazuje, że E. coli jest nieobecny (Rysunek 3).

Rysunek 3. Ujemny wynik testu P-A (po lewej), dodatni wynik testu na bakterie z grupy coli (w środku) i dodatni wynik testu E. coli (po prawej).

2. Colilert MPN: Quanti-tray 2000

1. Otwórz butelkę Colilert i wlej 100 ml próbki wody do butelki Colilert.
2. Otwórz rurkę poduszkową zawierającą substrat odżywczy i wlej zawartość do próbki wody znajdującej się w butelce Colilert.
3. Zakręć i zamknij butelkę Colilert. Energicznie wstrząsnąć butelką, kilkakrotnie odwracając butelkę, aż podłoże całkowicie się rozpuści.
4. Ostrożnie otwórz podajnik Quanti-tray 2000, ściskając krawędzie w górnej części tacy i odciągając zakładkę papieru. Ściskaj dalej, aby taca była otwarta.
5. Wlej mieszaninę odczynnika i próbki wody do tacki, a następnie inkubuj próbkę wewnątrz tacki w temperaturze 35 ± 0,5 °C przez 24 godziny.
6. Obserwuj zmianę koloru żółtego w mieszaninie odczynnik/woda próbki. Policz liczbę dużych i małych studzienek, które sygnalizują pozytywną obecność bakterii z grupy coli. Żółty kolor oznacza, że występuje bakteria z grupy coli. Czysta woda lub brak zmiany koloru wskazują, że bakterie z grupy coli są nieobecne.
7. Wystaw próbkę odczynnika/wody na działanie światła ultrafioletowego i obserwuj niebieską fluorescencję. Policz liczbę dużych i małych studzienek, które sygnalizują dodatnią obecność E. coli. Niebieska fluorescencja wskazuje, że E. coli jest obecny. Brak fluorescencji wskazuje, że E. coli jest nieobecny.
8. Użyj arkusza Quanti-tray 2000 MPN (Rysunek 4), aby określić ilościowo stężenie każdego organizmu wskaźnikowego obecnego w 100 ml wody. Użyj arkusza kalkulacyjnego, aby porównać stosunek dużych i małych studni dodatnich, aby wyliczyć obecność obu organizmów wskaźnikowych.

Rysunek 4. Ujemny wynik na tacce ilościowej (po lewej), dodatni na liście bakterii z grupy coli (w środku) i dodatni na obecność E. coli (po prawej).

Analiza jakości wody ma zasadnicze znaczenie dla ochrony integralności zasobów wodnych. Obecność mikroorganizmów wskaźnikowych jest skorelowana z obecnością kału, który może zawierać patogeny chorobotwórcze. Organizmy wskaźnikowe mogą być zatem wykorzystywane do oceny bezpieczeństwa dostaw wody.

Zanieczyszczenie kałem w wodzie stanowi poważne zagrożenie dla zdrowia roślin, zwierząt i ludzi, ponieważ patogeny przewodu pokarmowego są wydalane w kale w bardzo dużych ilościach. Jednak monitorowanie próbek wody pod kątem każdego rodzaju unikalnego patogenu związanego z zanieczyszczeniem kałem nie jest możliwe. Pomiary w poszukiwaniu organizmów wskaźnikowych zapewniają prosty, szybki i opłacalny sposób wykrywania zanieczyszczenia kałem w zasobach wodnych.

Ten film zilustruje zasady stosowania organizmów wskaźnikowych do oceny jakości wody, sposób testowania pobranych próbek wody oraz interpretację i kwantyfikację uzyskanych danych.

Aby organizmy mogły być stosowane jako wskaźnik jakości wody, muszą spełniać pięć określonych kryteriów. Po pierwsze, powinien być wykrywalny w wodzie, w której obecny jest patogen, i nieobecny, gdy patogen jest nieobecny. Po drugie, liczba organizmów wskaźnikowych musi odpowiadać poziomom patogenów. Powinien być również twardszy i dłużej utrzymywać się w środowisku niż patogen. Wreszcie, wykrywanie powinno być łatwe, bezpieczne, niedrogie i skuteczne we wszystkich rodzajach wody.

Dwie z najczęstszych grup wskaźników bakteryjnych to bakterie z grupy coli ogółem i bakterie z grupy coli w kale, zwykle E. coli. Bakterie z grupy coli można znaleźć w jelitach ssaków, ale mogą również występować naturalnie w glebie i wodach powierzchniowych. Bakterie z grupy coli w kale są podgrupą, która znajduje się całkowicie w przewodzie pokarmowym ssaków i ptaków i jest stale wydalana z kałem. Bakterie z grupy coli są podatne na te same stresy, co wiele powszechnych patogenów jelitowych, takich jak uzdatnianie wody lub niski poziom składników odżywczych, ich obecność w próbce wody jest użytecznym wskaźnikiem potencjalnej obecności patogenów. Zarówno bakterie z grupy coli, jak i E. coli są łatwo wykrywalne w warunkach laboratoryjnych.

W celu wykrycia do próbki dodaje się substraty chemiczne, które metabolizują bakterie z grupy coli, powodując zmianę koloru. W przypadku bakterii z grupy coli ogółem dodany ONPG jest przekształcany w nitrofenol, zmieniając kolor wody na żółty. W przypadku bakterii z grupy coli E. coli przekształca MUG w produkt metylowo-baldaszkowaty, który fluoryzuje na niebiesko-zielono w świetle ultrafioletowym. W najprostszym zastosowaniu test podłoża może potwierdzić obecność lub brak bakterii z grupy coli obecnych w wodzie w momencie pobierania próbek.

W przeciwieństwie do tej metody jakościowej, całkowitą liczbę bakterii z grupy coli w próbce można oszacować za pomocą specjalistycznej tacki z podziałem. Po rozpuszczeniu substratu reaktywnego próbkę wody dodaje się do tacy zawierającej duże i małe studzienki, a następnie inkubuje. Studzienki wykazujące zmianę koloru są zliczane, a stosunek małych do dużych dołków wykazujących dodatnie sygnały kolorymetryczne jest wyrównywany do wykresu wskazującego ilość. Woda pitna w USA nie może zawierać żadnych bakterii z grupy coli na 100 ml.

Teraz, gdy znamy już zasady wykorzystania organizmów wskaźnikowych do identyfikacji i ilościowego określania zanieczyszczenia wody, przyjrzyjmy się, jak odbywa się to w laboratorium.

Po pobraniu próbek należy je przynieść do laboratorium w celu przeprowadzenia testów. Aby rozpocząć, otwórz plastikową butelkę o pojemności 100 ml. Butelki mogą zawierać niewielką ilość sproszkowanego odczynnika tiosiarczanu sodu, który służy do zapewnienia neutralizacji chloru, który może być obecny. Dodaj 100 ml próbki wody do butelki. Otwórz rurkę poduszkową zawierającą substrat odżywczy i wlej zawartość do próbki wody wewnątrz butelki. Zakręć i zamknij butelkę, a następnie energicznie potrząśnij, kilkakrotnie odwracając butelkę, aż podłoże całkowicie się rozpuści. Następnie inkubować butelkę z odczynnikiem do próbki w temperaturze 35 ? C przez 24 godziny.

Obserwuj zmianę koloru żółtego w mieszaninie próbka-odczynnik. Żółty kolor oznacza, że bakterie z grupy coli są obecne. Brak zmiany koloru wskazuje, że bakterie z grupy coli są nieobecne. Na koniec wystawić mieszaninę próbki i odczynnika na działanie światła ultrafioletowego i obserwować. Niebieska fluorescencja w połączeniu ze zmianą koloru żółtego wskazuje, że E. coli jest obecna. Brak fluorescencji wskazuje na brak.

Najbardziej prawdopodobną liczbę (MPN) można również określić dla próbek. Otwórz butelkę i dodaj 100 ml próbki wody. Otwórz rurkę poduszkową z podłożem odżywczym i wlej zawartość do próbki wody w butelce. Zakręć i zamknij butelkę. Wstrząsnąć energicznie, kilkakrotnie odwracając, aż podłoże całkowicie się rozpuści. Ostrożnie otwórz tacę, ściskając krawędzie u góry, a następnie odciągnij papierową zakładkę. Wywieraj stały nacisk, aby taca była otwarta. Wlej mieszaninę próbki i odczynnika do tacki i zamknij. Inkubować tacę w temperaturze 35 ? C przez 24 godziny.

Obserwuj zmianę koloru na tacce do mieszania próbki i odczynnika. Policz liczbę dużych i małych studzienek, które zmieniły kolor na żółty, aby wskazać obecność bakterii z grupy coli. Następnie wystaw tackę na próbkę z odczynnikiem na działanie światła ultrafioletowego i obserwuj niebieską fluorescencję. Policz liczbę dużych i małych studzienek, które sygnalizują pozytywną obecność E. coli.

Korzystając z dostarczonego arkusza MPN, określ ilościowo stężenie każdego organizmu wskaźnikowego obecnego w 100 ml wody. Znajdź liczbę małych dołków dodatnich w górnej części tabeli oraz liczbę dużych studni dodatnich na osi po lewej stronie. Przecięcie tych dwóch elementów da liczbę reprezentującą najbardziej prawdopodobną liczbę, która jest szacowaną liczbą organizmów na 100 ml.

Testy całkowitego wykrywania bakterii z grupy coli i E. coli są stosowane do sprawdzania zanieczyszczenia różnych próbek wody.

Woda przeznaczona do spożycia przez ludzi lub pitna jest rutynowo badana pod kątem zanieczyszczeń. Aby woda została uznana za bezpieczną, powinna zawierać mniej niż 1 bakterię z grupy coli na 100 ml. Tutaj pobrano wodę z kranu i przebadano ją pod kątem całkowitego zanieczyszczenia bakteriami z grupy coli lub E. coli, jak wykazano wcześniej. Wyniki określały, czy źródło wody jest bezpieczne do spożycia.

Inną często badaną próbką są ścieki oczyszczone. Woda musi zostać przetestowana, aby upewnić się, że jest bezpieczna do uwolnienia do środowiska lub ponownego wykorzystania przez ludzi. Ponieważ przed oczyszczaniem spodziewano się wysokiego poziomu zanieczyszczenia, surową próbkę ścieków rozcieńczono w stosunku 1:100 000. Próbki te zostały następnie poddane testom całkowitego wykrywania bakterii z grupy coli i E. coli, a następnie obliczono wartości MPN. Bezpieczna wartość po przetworzeniu powinna wynosić zero wykrywalnych bakterii wskaźnikowych.

Właśnie obejrzeliście wprowadzenie JoVE do badania jakości wody za pomocą organizmów wskaźnikowych. Powinieneś teraz zrozumieć, jak badać próbki wody na obecność E. coli i innych bakterii z grupy coli oraz jak określić ilościowo stopień obecnego zanieczyszczenia. Dzięki za oglądanie!