Wykrywanie mikroorganizmów środowiskowych za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy i elektroforezy żelowej

Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest podstawową techniką biologiczną, która jest szeroko stosowana do wykrywania i identyfikacji mikroorganizmów obecnych w glebie, wodzie i innych próbkach środowiskowych.

Klasycznie mikroorganizmy są hodowane w laboratoriach przy użyciu specjalistycznych pożywek wzrostowych. Jednak wiele drobnoustrojów w środowisku naturalnym jest "niehodowlanych" - albo dlatego, że mają bardzo niską aktywność metaboliczną lub tempo wzrostu, albo dlatego, że mają bardzo rygorystyczne wymagania dotyczące wzrostu, które mogą nie być możliwe do odtworzenia w naczyniu hodowlanym. Różnice w zdolności do hodowli między drobnoustrojami oznaczają również, że gdy mikroorganizmy z próbki środowiskowej są hodowane, ich względna liczebność w kulturze może nie odzwierciedlać ich rzeczywistych poziomów w środowisku.

Pojawienie się PCR, który może specyficznie amplifikować nawet niewielkie ilości DNA obecne w mieszanej próbce, umożliwia szybkie wykrycie i zidentyfikowanie określonych drobnoustrojów będących przedmiotem zainteresowania, nawet tych, które nie nadają się do hodowli, w złożonym asortymencie organizmów obecnych w próbce środowiskowej.

W tym filmie przedstawimy zasady PCR. Następnie omówiony zostanie ogólny protokół przeprowadzania PCR na DNA wyizolowanym z próbki środowiskowej w celu wykrycia obecności organizmu będącego przedmiotem zainteresowania. Na koniec zbadanych zostanie kilka zastosowań identyfikacji drobnoustrojów na podstawie PCR.

Podstawowym założeniem PCR jest wykorzystanie powtarzających się cykli sekwencyjnych zmian temperatury w celu osiągnięcia wykładniczej amplifikacji DNA, zwykle za pomocą maszyny znanej jako termocykler, aby automatycznie przełączać się między różnymi temperaturami. Synteza DNA odbywa się za pomocą enzymów polimerazy DNA, które są pozyskiwane z bakterii żyjących w gorących źródłach, takich jak Thermus aquaticus lub "Taq". Polimerazy te są stabilne termicznie, dzięki czemu wytrzymują wysokie temperatury stosowane podczas PCR.

Sekwencja docelowa, znana jako amplikon, jest amplifikowana z matrycy DNA za pomocą dwóch krótkich odcinków nukleotydów znanych jako "startery". Ze względu na wysoką specyficzność wiązania komplementarnych kwasów nukleinowych, startery pozwalają na ukierunkowaną amplifikację bardzo specyficznych sekwencji będących przedmiotem zainteresowania. Projektując startery, które będą amplifikować tylko unikalną sekwencję lub unikalną kombinację sekwencji z organizmu będącego przedmiotem zainteresowania, PCR może być używany do różnicowego wykrywania obecności DNA tego organizmu wśród wszystkich materiałów genetycznych obecnych w złożonej próbce środowiskowej.

Każdy cykl PCR podzielony jest na trzy fazy. Pierwsza, znana jako "denaturacja", jest zwykle ustawiana powyżej 92 ? C i trwa około 30 s. Denaturacja służy do rozbijania cząsteczek DNA na pojedyncze nici, aby umożliwić postęp reakcji amplifikacji.

Druga faza, "wyżarzanie", jest ustawiona od 2 do 3 ? C poniżej dolnej z dwóch temperatur topnienia dwóch starterów, zwykle między 50 a 65 ? C, a także trwa około 30 s. Temperatura topnienia to temperatura, w której 50% dwuniciowych cząsteczek DNA rozdzieliło się na pojedyncze nici, a więc etap wyżarzania pozwala starterom związać się z ich docelowymi miejscami w matrycy DNA.

Trzecią fazą cyklu PCR jest "wydłużenie" lub "wydłużenie", kiedy polimeraza DNA wiąże się z dupleksem starter-matryca i katalizuje syntezę nowych nici. Ustawiony na 72 ? C dla najczęściej stosowanej polimerazy PCR, Taq, czas trwania tej fazy zależy od długości amplikonu, zwykle 30 s na 500 par zasad. Po każdym cyklu amplifikowane DNA jest ponownie denaturowane i służy jako nowa matryca, co prowadzi do wykładniczego wzrostu ilości produktów PCR.

Po zakończeniu reakcji produkty PCR można rozpuścić według wielkości na "żelu" zwykle wykonanym z agarozy polimerowej, w procesie znanym jako elektroforeza. Pole elektryczne jest przykładane do żelu, a ładunki ujemne w szkielecie cząsteczek DNA powodują ich migrację w kierunku dodatniego końca pola. Ogólnie rzecz biorąc, liniowe cząsteczki DNA, które są większe, będą potrzebowały więcej czasu, aby przejść przez matrycę żelową.

Teraz, gdy już wiesz, jak działa PCR, przyjrzyjmy się, w jaki sposób można wykorzystać tę reakcję do identyfikacji mikroorganizmów w próbce środowiskowej.

Na początek należy obliczyć objętość każdego potrzebnego odczynnika na podstawie liczby próbek do przetworzenia oraz dodatkowe 10% w celu uwzględnienia błędów pipetowania. Należy dołączyć szablon kontroli dodatniej, który zawiera region docelowy, aby zapewnić przebieg reakcji; a także kontrolę ujemną, w której nie zawiera się matrycy DNA, w celu wykluczenia zanieczyszczenia któregokolwiek ze składników reakcji. Enzym polimerazę Taq należy przechowywać na lodzie, a resztę odczynników i próbki DNA rozmrozić w temperaturze pokojowej w wyznaczonym okapie z przepływem laminarnym, aby zapobiec zanieczyszczeniu.

Gdy wszystkie odczynniki zostaną rozmrożone, należy utworzyć "mieszankę główną" odczynnika, dodając obliczoną objętość każdego odczynnika do probówki z mikrodymem o niskiej wiązalności, co minimalizuje rozbieżności w ilościach odczynników spowodowane adsorpcją cząsteczek na powierzchni probówki. Delikatnie zwirować i odwirować każdy odczynnik przed dododięciem. Po przygotowaniu mieszanki wzorcowej należy zmieszać i zebrać przez odwirowanie.

Oznaczyć 8-probówkowy pasek do PCR, aby oznaczyć jedną probówkę dla każdej próbki, łącznie z kontrolami. Dozować odpowiednią ilość mieszanki wzorcowej PCR do każdej probówki paska. Następnie dodaj każdą próbkę DNA do odpowiedniej probówki.

Umieść nasadkę paska bezpiecznie na probówce paskowej i krótko odwiruj w mini-wirówce z adapterem paskowym. Następnie należy umieścić probówkę w termocyklerze i przeprowadzić reakcję zgodnie z odpowiednim programem PCR.

Podczas przeprowadzania PCR przygotuj żel agarozowy do elektroforezy produktów PCR. Odważyć odpowiednią ilość proszku agarozy dla żelu o stężeniu, które może rozpuścić produkty PCR w oparciu o ich oczekiwane rozmiary. Dodać agarozę do kolby o pojemności 125 ml, a następnie dodać odpowiednią objętość buforu żelowego do kolby, w zależności od objętości odlewu żelu, i zamieszać do wymieszania. Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej roztwór agarozy o dużej mocy przez 1 minutę. Po zakończeniu sprawdź, czy agaroza całkowicie się rozpuściła, obracając kolbą i w razie potrzeby powtórz podgrzewanie w kuchence mikrofalowej w odstępach co 30 sekund.

Mocno przymocować nakrętkę do kolby i schłodzić roztwór agarozy do 50 ° C przez obracanie kolby pod bieżącą zimną wodą. Po ostygnięciu dodaj 1 ? L bromku etydyny do agarozy. Ponieważ bromek etydyny jest potencjalnie rakotwórczy, należy nosić środki ochrony osobistej, takie jak okulary, fartuch laboratoryjny i rękawice odporne na bromek etydyny.

Wlej roztwór agarozy do tacki do odlewania żelu do elektroforezy, upewniając się, że w agarozie nie są uwięzione pęcherzyki powietrza. Umieść grzebień z wymaganą liczbą studzienek w roztworze. Pozostaw żel w temperaturze pokojowej na 20 do 30 minut do stężenia. Po związaniu żelu ostrożnie wyjmij grzebień, uważając, aby nie rozerwać żelu w tym procesie.

Umieść zestalony żel w komorze do elektroforezy. Dodaj bufor LB do komory, aż żel zostanie zanurzony. Na kawałek Parafilmu odpipetować "plamkę" drabinki DNA o odpowiednim zakresie dla oczekiwanej wielkości produktów PCR. Pobrać probówki PCR z zakończonymi reakcjami z termocyklera. Zebrać kondensaty w probówkach do PCR przez krótkie odwirowanie i dodać 8 ? L każdej próbki na parafilm. Dodaj 2 ? L 10x ładowanie barwnika do każdego miejsca produktu PCR, tak aby końcowe stężenie barwnika wynosiło 2x.

Załaduj próbki i drabinę do wyznaczonych dołków w żelu agarozowym, uważając, aby nie przebić żelu. Po zakończeniu ładowania załóż pokrywę do komory elektroforezy i podłącz elektrody do zasilania. Ponieważ DNA jest naładowane ujemnie i migruje w kierunku elektrody dodatniej, upewnij się, że studzienki znajdują się po stronie bliższej elektrodzie ujemnej. Włącz zasilanie i ustaw je na napięcie odpowiednie do wielkości komory elektroforetycznej i używanego układu buforowego. Ustaw elektroforezę na "bieg". Małe pęcherzyki poruszające się po bokach komory będą obserwowane, jeśli elektroforeza przebiega prawidłowo.

Gdy front barwnika przesunie się wystarczająco daleko w dół żelu, wyłącz zasilanie. Ostrożnie przetransportuj żel do aparatu do obrazowania żelu, aby uwidocznić produkty poddane elektroforezie. Za pomocą tarczy ochronnej włącz światło UV i uwidocznij prążki DNA na żelu. Przeanalizuj położenie pasm, aby sprawdzić, czy pasuje do oczekiwanego wzorca, który wskazuje na obecność gatunków będących przedmiotem zainteresowania w próbce środowiskowej.

Teraz, gdy już wiesz, jak przeprowadza się PCR, przyjrzyjmy się różnym sposobom jego zastosowania do wykrywania interesujących mikroorganizmów w środowisku.

Jednym z zastosowań wykrywania mikroorganizmów środowiskowych opartych na PCR jest identyfikacja organizmów chorobotwórczych, takich jak "ameba zjadająca mózg" Naegleria fowleri, jednokomórkowy organizm występujący w zbiornikach słodkowodnych i niechlorowanych basenach, który może atakować ludzki układ nerwowy, często śmiertelnie. Obecność tego śmiertelnego drobnoustroju w próbkach wody lub płynie mózgowo-rdzeniowym podejrzanych pacjentów można zbadać, wykonując PCR przy użyciu starterów, które celują w unikalne sekwencje DNA w genomie ameby.

Innym zastosowaniem identyfikacji mikrobiologicznej opartej na PCR jest badanie na obecność bakterii chorobotwórczych u much złapanych w pobliżu zakładów spożywczych, w ramach monitorowania zdrowia publicznego i dochodzeń w sprawie wybuchu choroby.

W tym przypadku badacze szukali obecności bakterii chorobotwórczych, takich jak Salmonella i Listeria, najpierw izolując bakterie zarówno z powierzchni ciała, jak i przewodu pokarmowego much, a następnie wykorzystując specyficzne dla gatunku warunki hodowli w celu wzbogacenia tych interesujących gatunków. Po wyekstrahowaniu DNA z wszelkich bakterii, które zostały wyhodowane, użyto dostępnych na rynku zestawów do wykrywania PCR specyficznych dla gatunku w celu zbadania ich tożsamości.

Wreszcie, za pomocą PCR można zidentyfikować i zróżnicować różne szczepy bakterii chorobotwórczych opornych na antybiotyki, takich jak Staphylococcus aureus, które stanowią poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego.

W tym przykładzie naukowcy wyizolowali i wyhodowali S. aureus z próbek klinicznych, a następnie wyekstrahowali DNA z kolonii bakteryjnych i przeprowadzili PCR. Reakcje amplifikacji zostały tutaj "zmultipleksowane", co oznacza, że wiele zestawów starterów ukierunkowanych na różne unikalne regiony genomu bakteryjnego zostało połączonych w tę samą reakcję. Poszczególne zestawy starterów zaprojektowano w taki sposób, aby produkty PCR wynikały z DNA tylko niektórych szczepów, ale nie innych, tak aby w połączeniu zaobserwowano unikalne wzory prążków produktu dla każdego szczepu.

Właśnie obejrzałeś film JoVE na temat wykrywania mikroorganizmów na podstawie PCR. Przyjrzeliśmy się zasadom rządzącej reakcją łańcuchową polimerazy; protokół przeprowadzania PCR na DNA wyekstrahowanym z mikroorganizmów środowiskowych; i wreszcie, kilka konkretnych zastosowań tej techniki do testowania organizmów będących przedmiotem zainteresowania w różnych typach próbek środowiskowych lub klinicznych. Dzięki za oglądanie!