2.13: Hodowla i liczenie bakterii z próbek gleby

1. Przygotowanie rozcieńczeń glebowych

1. Aby rozpocząć procedurę, odważ 10 g próbki gleby i dodaj do 95 ml wody dejonizowanej. Dobrze wstrząsnąć zawiesiną i oznaczyć jako "A".
2. Zanim gleba opadnie, usuń 1 ml zawiesiny sterylną pipetą i przenieś ją do 9 ml ślepej próbki wody dejonizowanej. Dokładnie odwiruj i oznacz jako "B".
3. Powtórzyć ten etap rozcieńczania trzy razy, za każdym razem z 1 ml poprzedniej zawiesiny i 9 ml ślepej próby wody dejonizowanej. Oznacz je kolejno jako probówki C, D i E. Powoduje to seryjne rozcieńczenia od 10^-1 do 10^-5 gramów gleby na ml

2. Wykonywanie płytek do hodowli bakterii

1. Aby wyhodować kolonie bakterii, weź trzy wstępnie przygotowane płytki agarowe z peptonem i drożdżami i oznacz je jako C, D i E. Próbki wirów C, D i E i odpipetuj 0,1 ml na każdą płytkę. Zwiększa to wartość rozcieńczenia jeszcze bardziej dziesięciokrotnie (C = 10^-3, D = 10^-4, E = 10^-5).
2. Następnie zanurz szklany rozsiewacz w etanolu. Umieść rozsiewacz w płomieniu na kilka sekund, aby zapalił się i spalił etanol. Spowoduje to wysterylizowanie rozsiewacza.
3. Trzymaj rozsiewacz nad pierwszą płytą, aż płomień zgaśnie. Szybko otwórz talerz, trzymając pokrywkę blisko siebie. Przyłóż rozsiewacz do agaru z dala od inokulum (Inoculum = komórki użyte do rozpoczęcia hodowli) do ostygnięcia, a następnie rozprowadź kroplę inokulum po powierzchni agaru, aż znikną ślady wolnego płynu. Załóż pokrywę płyty.
4. Ponownie podpal rozsiewacz i powtórz proces z następną płytką, pracując szybko, aby nie zanieczyścić agaru organizmami unoszącymi się w powietrzu
5. Inkubuj płytki bakteryjne w temperaturze pokojowej przez 1 tydzień. Upewnij się, że płytki są odwrócone podczas inkubacji, aby krople wilgoci z kondensatu nie spadały na powierzchnię agaru.

3. Wykonywanie płytek do smarowania promieniowców

1. Aby wyhodować promieniowce, weź trzy wstępnie przygotowane płytki glicerolu-kazeiny i oznacz je jako B, C i D. Korzystając z technik pokazanych wcześniej, rozprowadź płytkę 0,1 ml z zawiesin B, C i D. Niższe rozcieńczenia są stosowane, ponieważ promieniowce są zwykle obecne jako 1/10^th populacji bakterii (B = 10^-2, C = 10^-3, D = 10^-4).
2. Inkubować płytki promieniowców (odwrócone) w temperaturze pokojowej przez 2 tygodnie.

4. Liczba bakterii i promieniowców

1. Po inkubacji dokładnie zbadaj wszystkie płytki bakterii i zwróć uwagę na różnice w wielkości i kształcie kolonii. Uprawiane na agarze bakterie wytwarzają śluzowate kolonie od bezbarwnych do jasnopomarańczowych, żółtych lub różowych. Natomiast kolonie promieniowców są kredowe, jędrne, skórzaste i pękają pod naciskiem, podczas gdy inne kolonie bakteryjne będą się rozmazywać. Pozwala to na odróżnienie kolonii przez dotyk za pomocą sterylnej pętli.
2. Policzyć i zapisać liczbę kolonii bakteryjnych, w tym promieniowców. Licz tylko płytki z 30-200 koloniami na płytkę.

5. Izolacja czystych kultur

1. Wybierz poszczególne kolonie bakteryjne z dowolnej płytki. Można wybrać więcej kolonii, jeśli istnieje szczególne zainteresowanie glebą. Użyj płytki o wysokim rozcieńczeniu, ponieważ ma ona tendencję do posiadania czystych kolonii, które są dobrze oddzielone. Wybieraj tylko kolonie, które są dobrze oddzielone od sąsiednich kolonii i wyglądają morfologicznie różnie od siebie.
2. Wysterylizuj pętlę, zanurzając ją w alkoholu i paląc. Szybko otwórz interesującą Cię szalkę Petriego i dotknij pętli w pustym miejscu w agarze aby ją schłodzić. Następnie usuń niewielką ilość interesującej nas kolonii na pętlę.
3. Biorąc świeży talerz peptonowo-drożdżowy, zrób smugę o długości kilku centymetrów z jednej strony. Ponownie wysterylizuj i ostudzić, a następnie utwórz smugę, która przecina początkową smugę tylko przy pierwszym przejściu. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy w ten sam sposób. To smugowe "rozcieńczenie" powoduje, że komórki na pętli są oddzielane od siebie. Umieść płytkę w ciemnym miejscu, aby inkubować w temperaturze pokojowej przez dwa tygodnie.

Określenie dokładnej liczby bakterii środowiskowych ma kluczowe znaczenie dla oceny stanu ekosystemu glebowego. Można to osiągnąć poprzez hodowlę kolonii bakteryjnych z odpowiednimi rozcieńczeniami.

Bakterie glebowe są ważną częścią zdrowego ekosystemu glebowego, odgrywając rolę w rozkładzie, wiązaniu azotu i obiegu składników odżywczych. Gleby powierzchniowe są substratem cząstek organicznych i nieorganicznych tworzących złożoną matrycę otaczającą pory, które wypełniają się powietrzem lub wodą. Warunki te tworzą idealny ekosystem dla bakterii, a gleby powierzchniowe zazwyczaj zawierają ponad milion bakterii na gram.

Ze względu na tak wysokie stężenie bakterii, przed posiewem na pożywce wzrostowej konieczne jest rozcieńczenie. Seryjne rozcieńczenia mogą zmniejszyć stężenie pierwotnej próbki gleby do poziomów wystarczająco niskich, aby pojedyncze kolonie mogły być hodowane na płytkach pożywki, co pozwala na obliczenie początkowej liczby bakterii w próbce gleby.

Ten film pokaże, jak przygotować seryjne rozcieńczenia próbek gleby, jak płytkować te próbki bakteryjne i jak obliczyć liczbę bakterii w glebie na płytkach rozcieńczających.

Bakterie to proste organizmy prokariotyczne, ale bardzo zróżnicowane pod względem gatunkowym i ekosystemowym. Actinomycetes to podzbiór bakterii, które są często uważane za wyjątkową grupę ze względu na ich nitkowatą strukturę, w której rosną nawleczone razem, tworząc strzępki.

Zazwyczaj promieniowce stanowią 10% całkowitej populacji bakterii w glebie. Bakterie i promieniowce występują obficie w prawie każdym środowisku na Ziemi, ale w glebie występują w niezrównanej różnorodności i obfitości.

Bakterie glebowe są liczone, a następnie potencjalnie hodowane i identyfikowane przez rozcieńczanie. Tutaj próbka gleby jest seryjnie rozcieńczana w wodzie, a następnie rozpraszana na płytkach do wzrostu agaru. Powstałe kolonie są następnie liczone. Wartość ta, wraz ze współczynnikiem rozcieńczenia, służy do wyjaśnienia początkowego stężenia bakterii w glebie.

Posiewanie rozcieńczające jest powszechną, niedrogą i prostą metodą oznaczania liczby bakterii, ale ma kilka wad. Nie należy dopuścić do osiadania gleby podczas rozcieńczeń, co może prowadzić do stronniczego wzrostu. Niektóre bakterie glebowe nie rozmnażają się na płytkach lub rosną zbyt wolno, aby można je było zaobserwować. Dodatkowo metoda ta zakłada, że kolonie powstają z jednej bakterii, ale mogą powstawać z kępek wielu komórek.

Niektóre gatunki bakterii rosną lepiej na różnych podłożach wzrostowych. Powszechnym substratem do hodowli szerokiej gamy bakterii jest płytka drożdżowa agarowo-peptonowa. Promieniowce preferencyjnie rosną na płytkach na bazie glicerolu i kazeiny, które lepiej pasują do wzrostu tych bakterii nitkowatych.

Teraz, gdy rozumiesz koncepcję oznaczającą liczenie bakterii, zobaczmy, jak ten proces przebiega w laboratorium.

Aby rozpocząć procedurę, odważ 10 g próbki gleby i dodaj do 95 ml wody dejonizowanej. Dobrze wstrząsnąć zawiesiną i oznaczyć jako "A". Zanim gleba opadnie, należy usunąć 1 ml zawiesiny sterylną pipetą i przenieść ją do 9 ml wody dejonizowanej. Dokładnie odwiruj i oznacz jako "B".

Powtórzyć ten etap rozcieńczania 3 razy, za każdym razem z 1 ml poprzedniej zawiesiny i 9 ml wody dejonizowanej. Oznacz je kolejno jako probówki C, D i E. Powoduje to seryjne rozcieńczenia od 10-1 do 10-5 gramów gleby na ml.

Aby wyhodować kolonie bakterii, weź 3 wstępnie przygotowane płytki agarowe z peptonem i drożdżami i oznacz je jako C, D i E. Zmieszaj odpowiednie próbki i odpipetuj 0,1 ml na każdą płytkę. Ponieważ CFU są podawane na ml, użycie 0,1 ml dodatkowo zwiększa rozcieńczenie dziesięciokrotnie.

Następnie zanurz szklany rozsiewacz w etanolu. Umieść rozsiewacz w płomieniu na kilka sekund, aby zapalił się i spalił etanol. Spowoduje to wysterylizowanie rozsiewacza.

Trzymaj rozsiewacz nad pierwszą płytą, aż płomień zgaśnie. Szybko otwórz talerz, trzymając pokrywkę blisko siebie. Przyłóż rozsiewacz do agaru z dala od inokulum, aby ostygł, a następnie rozprowadź kroplę inokulum po powierzchni, aż znikną ślady wolnego płynu. Załóż pokrywę płyty.

Ponownie zapal rozsiewacz i powtórz proces z następną płytą, pracując szybko, aby nie zanieczyścić płytki organizmami unoszącymi się w powietrzu. Odwróć płytki, aby krople wilgoci nie spadały na agar i inkubuj płytki w temperaturze pokojowej przez tydzień.

Aby wyhodować promieniowce, weź trzy wstępnie przygotowane płytki glicerolu-kazeiny i oznacz je jako B, C i D. Korzystając z technik pokazanych wcześniej, rozprowadź płytkę 0,1 ml z zawiesin B, C i D. Stosuje się niższe rozcieńczenia, ponieważ promieniowce są zwykle obecne jako 1/10 populacji bakterii.

Na koniec odwróć te płytki i przechowuj w temperaturze pokojowej przez dwa tygodnie.

Po inkubacji dokładnie zbadaj wszystkie płytki bakterii i zwróć uwagę na różnice w wielkości i kształcie kolonii. Uprawiane na agarze bakterie wytwarzają śluzowate kolonie od bezbarwnych do jasnopomarańczowych, żółtych lub różowych. Natomiast kolonie promieniowców są kredowe, jędrne, skórzaste i pękają pod naciskiem, podczas gdy inne kolonie bakteryjne będą się rozmazywać. Pozwala to na odróżnienie kolonii przez dotyk za pomocą sterylnej pętli.

Policzyć i zapisać liczbę kolonii bakteryjnych, w tym promieniowców. Licz tylko płytki z 30-200 koloniami na płytkę.

Aby wyhodować kultury określonych pojedynczych bakterii, wybierz dyskretne kolonie z dowolnej płytki, wybierając kolonie, które są dobrze oddzielone od sąsiednich kolonii. Wysterylizuj pętlę do rozprowadzania, a następnie otwórz płytkę i dotknij pętli w pustym miejscu, aby ostygła. Następnie wybierz niewielką ilość interesującej Cię kolonii do pętli.

Biorąc świeży talerz peptonowo-drożdżowy, zrób smugę o długości kilku centymetrów z jednej strony. Ponownie wysterylizuj i ostudzić, a następnie utwórz smugę, która przecina początkową smugę tylko przy pierwszym przejściu. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy w ten sam sposób. To smugowe "rozcieńczenie" powoduje, że komórki na pętli są oddzielane od siebie. Umieść płytkę w ciemnym miejscu, aby inkubować w temperaturze pokojowej przez dwa tygodnie.

Na podstawie liczby kolonii bakterii i promieniowców można określić jednostki tworzące kolonie na gram gleby. Liczba kolonii na gram gleby jest równa liczbie kolonii zliczonych na płytce, pomnożonej przez odwrotność rozcieńczenia na płytce. Na przykład, jeśli 46 kolonii zostanie policzonych na płytce rozcieńczającej 10-5 z inokulantem o pojemności 0,1 ml, to CFU na gram gleby jest równe 10-6 na 46, czyli 46 milionów CFU na gram gleby.

Przeprowadzanie zliczania i hodowli bakterii jest kluczowym pierwszym krokiem w wielu badaniach naukowych lub protokołach.

Zdrowa gleba zawiera od 106 do 108 bakterii na gram. Liczenie bakterii w glebie może być wykorzystane do określenia stanu gleby będącej przedmiotem zainteresowania, a liczba bakterii poniżej 106 i 108 bakterii na gram wskazuje na niezdrową lub ubogą glebę. Może to być spowodowane brakiem składników odżywczych lub materii organicznej, stresem abiotycznym spowodowanym ekstremalnym pH gleby lub zanieczyszczeniem gleby.

Wiele rodzajów antybiotyków stosowanych obecnie w medycynie zostało po raz pierwszy zidentyfikowanych na podstawie bakterii lub grzybów żyjących w glebie. Wyizolowanie czystych szczepów z kultur glebowych może potencjalnie pomóc naukowcom w identyfikacji nowych związków antybiotykowych. W tym przypadku badane bakterie lub wyizolowane związki będące przedmiotem zainteresowania można dodać do talerzy uprawianych na trawnikach bakteryjnych, a ich wpływ na wzrost trawnika zarejestrować. Wyraźne plamy na trawnikach bakteryjnych, na których wzrost został zahamowany przez badane bakterie lub związek, mogą wskazywać na aktywność antybiotykową.

Rośliny strączkowe, w tym groch i fasola, opierają się na symbiotycznych związkach z bakteriami wiążącymi azot. Bakterie te żyją swobodnie w glebie lub w guzkach systemu korzeniowego i wytwarzają związki azotu, które są wykorzystywane przez roślinę. Na ubogich glebach uzupełnienie roślin strączkowych hodowanymi bakteriami wiążącymi azot z gleby może poprawić wzrost i zdrowie roślin. Może to skutkować większymi, bardziej odpornymi roślinami, co z kolei daje większe plony.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do liczenia bakterii. Powinieneś teraz zrozumieć, jak przeprowadzać rozcieńczania próbek gleby, jak platerować do liczenia kolonii i izolacji kolonii oraz jak obliczać liczbę bakterii w próbkach gleby. Dzięki za oglądanie!