Hodowla i liczenie bakterii z próbek gleby

1. Przygotowanie rozcieńczeń glebowych

1. Aby rozpocząć procedurę, odważ 10 g próbki gleby i dodaj do 95 ml wody dejonizowanej. Dobrze wstrząsnąć zawiesiną i oznaczyć jako "A".
2. Zanim gleba opadnie, usuń 1 ml zawiesiny sterylną pipetą i przenieś ją do 9 ml ślepej próbki wody dejonizowanej. Dokładnie odwiruj i oznacz jako "B".
3. Powtórzyć ten etap rozcieńczania trzy razy, za każdym razem z 1 ml poprzedniej zawiesiny i 9 ml ślepej próby wody dejonizowanej. Oznacz je kolejno jako probówki C, D i E. Powoduje to seryjne rozcieńczenia od 10^-1 do 10^-5 gramów gleby na ml

2. Wykonywanie płytek do hodowli bakterii

1. Aby wyhodować kolonie bakterii, weź trzy wstępnie przygotowane płytki agarowe z peptonem i drożdżami i oznacz je jako C, D i E. Próbki wirów C, D i E i odpipetuj 0,1 ml na każdą płytkę. Zwiększa to wartość rozcieńczenia jeszcze bardziej dziesięciokrotnie (C = 10^-3, D = 10^-4, E = 10^-5).
2. Następnie zanurz szklany rozsiewacz w etanolu. Umieść rozsiewacz w płomieniu na kilka sekund, aby zapalił się i spalił etanol. Spowoduje to wysterylizowanie rozsiewacza.
3. Trzymaj rozsiewacz nad pierwszą płytą, aż płomień zgaśnie. Szybko otwórz talerz, trzymając pokrywkę blisko siebie. Przyłóż rozsiewacz do agaru z dala od inokulum (Inoculum = komórki użyte do rozpoczęcia hodowli) do ostygnięcia, a następnie rozprowadź kroplę inokulum po powierzchni agaru, aż znikną ślady wolnego płynu. Załóż pokrywę płyty.
4. Ponownie podpal rozsiewacz i powtórz proces z następną płytką, pracując szybko, aby nie zanieczyścić agaru organizmami unoszącymi się w powietrzu
5. Inkubuj płytki bakteryjne w temperaturze pokojowej przez 1 tydzień. Upewnij się, że płytki są odwrócone podczas inkubacji, aby krople wilgoci z kondensatu nie spadały na powierzchnię agaru.

3. Wykonywanie płytek do smarowania promieniowców

1. Aby wyhodować promieniowce, weź trzy wstępnie przygotowane płytki glicerolu-kazeiny i oznacz je jako B, C i D. Korzystając z technik pokazanych wcześniej, rozprowadź płytkę 0,1 ml z zawiesin B, C i D. Niższe rozcieńczenia są stosowane, ponieważ promieniowce są zwykle obecne jako 1/10^th populacji bakterii (B = 10^-2, C = 10^-3, D = 10^-4).
2. Inkubować płytki promieniowców (odwrócone) w temperaturze pokojowej przez 2 tygodnie.

4. Liczba bakterii i promieniowców

1. Po inkubacji dokładnie zbadaj wszystkie płytki bakterii i zwróć uwagę na różnice w wielkości i kształcie kolonii. Uprawiane na agarze bakterie wytwarzają śluzowate kolonie od bezbarwnych do jasnopomarańczowych, żółtych lub różowych. Natomiast kolonie promieniowców są kredowe, jędrne, skórzaste i pękają pod naciskiem, podczas gdy inne kolonie bakteryjne będą się rozmazywać. Pozwala to na odróżnienie kolonii przez dotyk za pomocą sterylnej pętli.
2. Policzyć i zapisać liczbę kolonii bakteryjnych, w tym promieniowców. Licz tylko płytki z 30-200 koloniami na płytkę.

5. Izolacja czystych kultur

1. Wybierz poszczególne kolonie bakteryjne z dowolnej płytki. Można wybrać więcej kolonii, jeśli istnieje szczególne zainteresowanie glebą. Użyj płytki o wysokim rozcieńczeniu, ponieważ ma ona tendencję do posiadania czystych kolonii, które są dobrze oddzielone. Wybieraj tylko kolonie, które są dobrze oddzielone od sąsiednich kolonii i wyglądają morfologicznie różnie od siebie.
2. Wysterylizuj pętlę, zanurzając ją w alkoholu i paląc. Szybko otwórz interesującą Cię szalkę Petriego i dotknij pętli w pustym miejscu w agarze aby ją schłodzić. Następnie usuń niewielką ilość interesującej nas kolonii na pętlę.
3. Biorąc świeży talerz peptonowo-drożdżowy, zrób smugę o długości kilku centymetrów z jednej strony. Ponownie wysterylizuj i ostudzić, a następnie utwórz smugę, która przecina początkową smugę tylko przy pierwszym przejściu. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy w ten sam sposób. To smugowe "rozcieńczenie" powoduje, że komórki na pętli są oddzielane od siebie. Umieść płytkę w ciemnym miejscu, aby inkubować w temperaturze pokojowej przez dwa tygodnie.