3.4: Krzywe kalibracyjne

1. Tworzenie standardów: seryjne rozcieńczenia

1. Przygotuj skoncentrowany roztwór podstawowy wzorca. Zazwyczaj związek jest dokładnie ważony, a następnie ilościowo przenoszony do kolby miarowej. Dodaj trochę rozpuszczalnika, wymieszaj, aby próbka się rozpuściła, a następnie napełnij do linii odpowiednim rozpuszczalnikiem.
2. Wykonaj seryjne rozcieńczenia. Wziąć inną kolbę miarową i odpipetować ilość wzorca potrzebną do rozcieńczenia, a następnie napełnić do linii rozpuszczalnikiem i wymieszać. Zazwyczaj wykonuje się dziesięciokrotne rozcieńczenie, więc w przypadku kolby miarowej o pojemności 10 ml należy dodać 1 ml poprzedniego rozcieńczenia.
3. Kontynuuj w razie potrzeby, aby uzyskać więcej rozcieńczeń, pipetując z poprzedniego roztworu, aby rozcieńczyć go w celu uzyskania następnej próbki. Aby uzyskać dobrą krzywą kalibracyjną, potrzeba co najmniej 5 stężeń.

2. Uruchom próbki dla krzywej kalibracyjnej i nieznane

1. Zbadaj próbki za pomocą spektrofotometru UV-Vis w celu określenia odpowiedzi instrumentalnej potrzebnej do wyznaczenia krzywej kalibracyjnej.
2. Wykonaj odczyt z pierwszą próbką. Dobrym pomysłem jest uruchamianie próbek w kolejności losowej (, tj. nie od najwyższej do najniższej lub od najniższej do najwyższej) na wypadek wystąpienia błędów systematycznych. Aby uzyskać szacunkowy poziom hałasu, powtórz odczyt dla dowolnej próbki 3–5 razy.
3. Uruchom dodatkowe próbki wzorcowe, powtarzając pomiary dla każdej próbki, aby uzyskać oszacowanie hałasu. Zapisz dane, aby później utworzyć wykres.
4. Uruchom nieznane próbki. Używaj jak najbardziej podobnych warunków do uruchamiania standardów. W związku z tym matryca próbki lub bufor powinien być taki sam, pH powinno być takie samo, a stężenie powinno mieścić się w zakresie przebiegu wzorców.

3. Wykonanie krzywej kalibracyjnej

1. Zapisz dane w arkuszu kalkulacyjnym i użyj programu komputerowego do wykreślenia danych w funkcji stężenia. Jeżeli dla każdego punktu wykonano co najmniej trzy pomiary, można wykreślić słupki błędu odchylenia standardowego tych pomiarów w celu oszacowania błędu każdego punktu. W przypadku niektórych krzywych może być konieczne wykreślenie danych z osią jako logarytmem w celu uzyskania linii. Równanie, które rządzi krzywą kalibracyjną, jest ogólnie znane z wyprzedzeniem, więc wykres logarytmiczny jest używany, gdy w równaniu znajduje się logarytm.
2. Zbadaj krzywą kalibracyjną. Czy wygląda liniowo? Czy ma fragment, który wygląda na nieliniowy (i. osiągnął granicę odpowiedzi instrumentalnej)? Aby to sprawdzić, dopasuj wszystkie dane do regresji liniowej za pomocą oprogramowania. Jeśli współczynnik determinacji (R²) nie jest wysoki, usuń niektóre punkty na początku lub na końcu krzywej, które wydają się nie pasować do linii, i ponownie wykonaj regresję liniową. Niedopuszczalne jest usuwanie punktów w środku tylko dlatego, że mają duży pasek błędów. Na podstawie tej analizy zdecyduj, która część krzywej jest liniowa.
3. Wynikiem liniowej powinno być równanie w formacie y=mx+b, gdzie m jest nachyleniem, a b jest punktem przecięcia z osią y. Jednostkami nachylenia są jednostka/stężenie osi y, w tym przykładzie (Rysunek 1) absorbancja/μM. Jednostkami punktu przecięcia z osią y są jednostki osi y. Uzyskuje się współczynnik determinacji (R²). Im wyższe R², tym lepsze dopasowanie; idealne dopasowanie daje R² równe 1. Program może być również w stanie oszacować błąd na zboczu i punkcie przecięcia.

4. Wyniki: Krzywa kalibracyjna absorbancji niebieskiego barwnika #1

1. Krzywa kalibracyjna absorbancji niebieskiego barwnika #1 (przy 631 nm) pokazano poniżej (Rysunek 1). Odpowiedź jest liniowa od 0 do 10 μM. Powyżej tego stężenia sygnał zaczyna się wyrównywać, ponieważ odpowiedź znajduje się poza zakresem liniowym spektrofotometru UV-Vis.
2. Oblicz poziom szczegółu. Od nachylenia krzywej kalibracyjnej LOD wynosi 3*SD (szum)/m. Dla tej krzywej kalibracyjnej szum został uzyskany poprzez wykonanie odchylenia standardowego powtarzanych pomiarów i wynosił 0,021. LOD wynosiłoby 3*0,021/.109=0,58 μM.
3. Oblicz LOQ. LOQ wynosi 10 * SD (hałas) / m. Dla tej krzywej kalibracyjnej LOQ wynosi 10*0,021/0,109 = 1,93 μM.
4. Oblicz stężenie nieznanego. Użyj równania liniowego, aby obliczyć stężenie nieznanej próbki. Krzywa kalibracyjna jest ważna tylko wtedy, gdy niewiadoma mieści się w zakresie liniowym próbek wzorcowych. Jeśli odczyty są zbyt wysokie, może być konieczne rozcieńczenie. W tym przykładzie nieznany napój sportowy został rozcieńczony w stosunku 1:1. Absorbancja wynosiła 0,243, co odpowiadało stężeniu 2,02 μM. Zatem końcowe stężenie niebieskiego barwnika #1 w napoju sportowym wynosiło 4,04 μM.

Rysunek 1. Krzywe kalibracyjne absorbancji UV-VIS niebieskiego barwnika. Po lewej: Absorbancja została zmierzona dla różnych stężeń niebieskiego barwnika #1. Odpowiedzi wyrównują się po 10 μM, gdy absorbancja przekracza 1. Słupki błędu pochodzą z powtarzających się pomiarów tej samej próbki i są odchyleniami standardowymi. Po prawej: Liniowa część krzywej kalibracyjnej jest dopasowana do linii, y=0,109*x + 0,0286. Nieznane dane są wyświetlane w kolorze czarnym. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Krzywe kalibracyjne służą do zrozumienia instrumentalnej odpowiedzi na analit oraz do przewidywania stężenia analitu w próbce.

Krzywą kalibracyjną tworzy się poprzez przygotowanie najpierw zestawu roztworów wzorcowych o znanych stężeniach analitu. Odpowiedź instrumentu jest mierzona dla każdego z nich i wykreślana w zależności od stężenia roztworu wzorcowego. Liniową część tego wykresu można następnie wykorzystać do przewidywania stężenia próbki analitu poprzez skorelowanie jej reakcji na stężenie.

W tym filmie przedstawimy krzywe kalibracyjne i ich zastosowanie, demonstrując przygotowanie zestawu wzorców, a następnie analizę próbki o nieznanym stężeniu.

Do przygotowania krzywej kalibracyjnej stosuje się zestaw roztworów wzorcowych. Roztwory te składają się z zakresu stężeń, które obejmują przybliżone stężenie analitu.

Roztwory wzorcowe są często przygotowywane z seryjnym rozcieńczeniem. Rozcieńczanie szeregowe przeprowadza się, przygotowując najpierw roztwór podstawowy analitu. Roztwór podstawowy jest następnie rozcieńczany o znaną ilość, często o jeden rząd wielkości. Nowy roztwór jest następnie rozcieńczany w ten sam sposób i tak dalej. W ten sposób powstaje zestaw roztworów o stężeniach przekraczających kilka rzędów wielkości.

Krzywa kalibracyjna jest wykresem sygnału instrumentalnego w funkcji stężenia. Wykres norm powinien być liniowy i może być dopasowany do równania y=mx+b. Nieliniowe części powierzchni należy odrzucić, ponieważ te zakresy stężeń wykraczają poza granicę liniowości.

Równanie najlepiej dopasowanej linii można następnie wykorzystać do określenia stężenia próbki, wykorzystując sygnał instrumentu do skorelowania ze stężeniem. Próbki, których wymiary mieszczą się poza zakresem liniowym wykresu, muszą zostać rozcieńczone, aby znalazły się w zakresie liniowym.

Granicę wykrywalności przyrządu lub najniższy pomiar, który można statystycznie określić na podstawie hałasu, można również obliczyć na podstawie krzywej kalibracyjnej. Ślepa próbka jest mierzona wielokrotnie. Granica wykrywalności jest ogólnie definiowana jako średni sygnał ślepej próby plus 3-krotność jego odchylenia standardowego.

Na koniec można również obliczyć granicę kwantyfikacji. Granica oznaczalności to najmniejsza ilość analitu, którą można dokładnie określić ilościowo. Oblicza się to jako 10 odchyleń standardowych powyżej pustego sygnału.

Teraz, gdy znasz już podstawy krzywej kalibracyjnej, zobaczmy, jak ją przygotować i używać w laboratorium.

Najpierw przygotuj stężony roztwór podstawowy wzorca. Dokładnie zważyć wzorzec i przenieść go do kolby miarowej. Dodać niewielką ilość rozpuszczalnika i wymieszać, aby próbka się rozpuściła. Następnie napełnij do linii rozpuszczalnikiem. Ważne jest, aby użyć tego samego rozpuszczalnika co próbka.

Aby przygotować wzorce, należy odpipetować wymaganą ilość w kolbie miarowej. Następnie napełnij kolbę do linii rozpuszczalnikiem i wymieszaj.

Kontynuuj wyznaczanie wzorców, pipetując z roztworu podstawowego i rozcieńczając. Aby uzyskać dobrą krzywą kalibracyjną, potrzeba co najmniej 5 stężeń.

Teraz należy zbadać próbki za pomocą przyrządu analitycznego, w tym przypadku spektrofotometru UV-Vis, w celu określenia odpowiedzi instrumentalnej potrzebnej do wyznaczenia krzywej kalibracyjnej.

Wykonaj pomiar pierwszego wzorca. Uruchamiaj standardy w kolejności losowej, na wypadek gdyby wystąpiły błędy systematyczne. Zmierz każdy standard 3×5x, aby uzyskać szacunkowy poziom hałasu.

Zmierz pozostałe wzorce, powtarzając pomiary dla każdej z nich. Zapisz wszystkie dane.

Na koniec uruchom przykład. Należy użyć tej samej matrycy próbki i warunków pomiaru, które zostały użyte w przypadku norm. Upewnij się, że próbka mieści się w zakresie norm i limicie przyrządu.

Aby skonstruować krzywą kalibracyjną, użyj programu komputerowego, aby wykreślić dane jako sygnał w funkcji stężenia. Użyj odchylenia standardowego powtórzonych pomiarów dla każdego punktu danych, aby utworzyć słupki błędów.

Usuń części krzywej, które są nieliniowe, a następnie wykonaj regresję liniową i określ linię o najlepszym dopasowaniu. Wynikiem powinno być równanie w postaci y = m x + b. Wartość R2 bliska 1 oznacza dobre dopasowanie.

Jest to krzywa kalibracyjna dla niebieskiego barwnika #1, mierzona przy 631 nm. Odpowiedź jest liniowa w zakresie od 0 do 15 mM.

Obliczyć stężenie próbki, korzystając z równania linii o najlepszym dopasowaniu. Absorbancja próbki wynosiła 0,141 i odpowiadała stężeniu 6,02 mM.

Teraz, gdy już wiesz, jak można wykorzystać krzywą kalibracyjną ze spektrofotometrem UV-Vis, przyjrzyjmy się innym przydatnym zastosowaniom.

Krzywe kalibracyjne są często używane w zastosowaniach elektrochemicznych, ponieważ sygnał elektrody musi być skalibrowany do stężenia jonów w roztworze. W tym przykładzie zebrano dane dla elektrody jonoselektywnej dla fluoru.

Dane dotyczące stężenia muszą być naniesione na skalę logarytmiczną w celu uzyskania linii. Ta krzywa kalibracyjna może być używana do pomiaru stężenia fluoru w roztworze, takim jak pasta do zębów lub woda pitna.

Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) to technika rozdzielania i analizy, która jest szeroko stosowana w chemii analitycznej. HPLC oddziela składniki mieszaniny w oparciu o czas potrzebny cząsteczkom do pokonania długości kolumny chromatograficznej. Czas ten różni się w zależności od szeregu właściwości chemicznych cząsteczek.

Elucja cząsteczek jest mierzona za pomocą detektora, w wyniku czego powstaje chromatogram. Obszar piku można skorelować ze stężeniem za pomocą prostej krzywej kalibracyjnej szeregu roztworów wzorcowych, jak w tym przykładzie popularnych składników napojów gazowanych.

W niektórych przypadkach, gdy matryca roztworu zakłóca pomiar substancji rozpuszczonej, klasyczna krzywa kalibracyjna może być niedokładna. W takich przypadkach przygotowuje się zmodyfikowaną krzywą kalibracyjną. W tym celu do próbki dodaje się szereg objętości roztworu wzorcowego. Tworzony jest wykres sygnału do stężenia, gdzie punkt przecięcia x jest równy pierwotnemu stężeniu roztworu próbki. Aby uzyskać więcej informacji na temat tej techniki, obejrzyj film edukacyjny JoVE "Metoda dodawania standardów".

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do krzywej kalibracyjnej. Powinieneś teraz zrozumieć, gdzie używana jest krzywa kalibracyjna, jak ją utworzyć i jak jej używać do obliczania stężeń próbek.

Jak zawsze, dziękujemy za oglądanie!