What is an internal standard and why is it used in analytical chemistry?

An internal standard is a substance added in a known amount to standards, samples, and blanks during analysis. It compensates for both systematic and random errors that occur during sample handling and measurement. By calculating the ratio of signals between the internal standard and analyte, called the response factor, accurate concentration calculations are possible even when sample loss occurs.

How does an internal standard help account for sample loss?

Any sample losses occurring after the internal standard is added should be similar for both the internal standard and the analyte. Since both substances experience proportional losses, their signal ratio remains constant. This allows the response factor to accurately reflect concentration ratios, making it possible to calculate analyte concentration despite sample loss during preparation and transfer steps.

What are the key requirements for choosing a suitable internal standard?

An internal standard must have a signal similar but not identical to the analyte, allowing the measurement method to distinguish between them. It cannot affect the analyte measurement and must not be natively present in the sample. The concentration must be well known, ensuring the only source in solution is the known amount deliberately added during analysis.

What is a response factor and how is it calculated?

The response factor is the ratio of analytical signals for the internal standard and analyte, which is proportional to their concentration ratio. It is calculated by plotting the ratios of peak areas versus concentration ratios from known standards. The slope of the resulting calibration curve equals the response factor, which can then be used to determine unknown analyte concentrations.

How do internal standards correct for systematic errors like matrix effects?

Matrix effects interfere with analyte measurement by affecting the signal in solution. When an internal standard experiences the same matrix effect as the analyte, the ratio of their signals remains unaffected. Performing calibrations in the same matrix as the sample ensures both substances are equally influenced, allowing the response factor ratio to accurately reflect true concentration differences.

What analytical techniques commonly use internal standards?

Internal standards are widely used in chromatography, spectroscopy, and electrochemistry. In gas chromatography, the ratio of peak areas for the internal standard and analyte is calculated. In spectroscopy, internal standards correct for random errors from variable light source intensity. These techniques rely on internal standards to minimize errors and ensure accurate quantitative analysis across diverse scientific disciplines.

How is sample preparation optimized to minimize sample loss before using an internal standard?

Sample loss is minimized by reducing the number of handling and transfer steps. Massing solids directly into the final flask eliminates unnecessary transfers. When transfers are necessary, triple rinsing glassware ensures complete sample transfer. For samples that adsorb to glass, using polypropylene tubes prevents losses. These preparation strategies work alongside internal standards to ensure accurate concentration determination.

Standardy wewnętrzne

0 views09:18 min

1. Prawidłowe obchodzenie się z próbką: tworzenie roztworu

Weź czystą zlewkę i zmasuj w niej odpowiednią ilość próbki. Zapisz rzeczywistą użytą masę. W tym przykładzie roztwór adeniny sporządza się w kolbie miarowej w celu wykorzystania jako wzorzec wewnętrzny do następnej analizy. Masa adeniny wynosi 100 mg. Nie masować bezpośrednio w kolbie miarowej, ponieważ ma ona długą szyjkę i adeniny nie można łatwo dodać ani usunąć.
Dodać około 25 ml rozpuszczalnika (w tym przypadku dimetylosulfotlenku (DMSO)) do zlewki i pozostawić do rozpuszczenia. W tym przykładzie końcowy roztwór sporządza się w kolbie miarowej o pojemności 50 ml, więc dodaj tylko około 25 ml, aby zlewkę można było przepłukać, a roztwór uzupełnić do końcowej objętości.
Po rozpuszczeniu ciała stałego wlać roztwór do kolby miarowej.
Przepłukać zlewkę i mieszadło niewielką ilością rozpuszczalnika, około 10 ml, i wlać płukanie do kolby miarowej. Powtórz jeszcze dwa razy. Pomaga to zapewnić prawidłowy transfer rozwiązania.

2. Przygotowanie krzywej wzorca wewnętrznego wzorca wzorcowego

Przygotować żądane próbki wzorcowe do analizy metodą chromatografii gazowej. W tym przykładzie kofeina jest ekstrahowana z kawy za pomocą acetonitrylu, a następnie adenina jest używana jako wewnętrzny wzorzec do pomiaru.
W przypadku próbek kofeiny należy odważyć ilość próbki potrzebną do sporządzenia próbki o objętości 1 mg/ml. W przypadku użycia kolby miarowej o pojemności 10 ml jest to 10 mg.
Zważyć analit do zlewki, dodać kilka ml rozpuszczalnika (w tym przypadku metanolu) do rozpuszczenia, a następnie przenieść ilościowo do kolby miarowej za pomocą 3 płukań.
Zrób 3 kolejne wzorce w podobny sposób z 0,2, 0,5 i 2 mg/ml kofeiny.
Umieścić 1 ml każdego wzorca kofeiny w fiolce z próbką.
Dodać 0,2 ml wewnętrznego wzorca adeniny 2 mg/ml do każdej fiolki z próbką.
Przeprowadź eksperyment chromatografii gazowej z każdym wzorcem kofeiny. Dla każdego chromatogramu należy obliczyć stosunek powierzchni pików dla kofeiny w stosunku do wzorca.
Zrób wykres stosunku powierzchni do stosunku stężenia. Nachylenie tej działki jest czynnikiem odpowiedzi.

3. Przygotowanie rzeczywistej próbki z wewnętrznym wzorcem do chromatografii gazowej

Przygotować żądaną próbkę do analizy metodą chromatografii gazowej. W tym przykładzie kofeina jest ekstrahowana z kawy przy użyciu acetrontrylu.
W przypadku próbki kawy rozmasuj 2 g kawy w zlewce o pojemności 100 ml. Zapisz dokładną wagę kawy.
Dodaj 20 ml acetonitrylu do zlewki.
Pozostaw na 20 minut, często mieszając.
Odfiltruj fusy z kawy za pomocą bibuły filtracyjnej w lejku.
Wypłucz bibułę filtracyjną 3x niewielką ilością acetonitrylu (5 ml).
Zmierzyć końcową objętość filtratu. Powinno to być około 35 ml.

4. Uruchom próbkę i oblicz stężenie

Pobrać 1 ml próbki ekstraktu kawy i dodać 0,2 ml wzorca wewnętrznego do fiolki. Umieścić fiolkę w stojaku na próbnik automatyczny.
Uruchom analizę GC próbki. Upewnij się, że warunki GC są takie, że kofeina i adenina oddzielają się. W tym przykładzie separacje izotermiczne są przeprowadzane w temperaturze 200 °C.
Po zakończeniu analizy należy obliczyć powierzchnię piku zarówno dla piku wzorca wewnętrznego, jak i piku analitu. Korzystając z ich proporcji, oblicz ilość kofeiny w próbce.

5. Wyniki: Analiza GC kofeiny z wewnętrznym wzorcem

Analiza GC kofeiny jest pokazana na Rysunek 1. Adenina jest stosowana jako wzorzec wewnętrzny. Stosunek powierzchni pików można zmierzyć i wykreślić w stosunku do stosunku stężeń. Nachylenie działki jest współczynnikiem odpowiedzi (w tym przypadku 1,8).
Rysunek 2 przedstawia chromatogram próbki kawy z wewnętrznym wzorcem adeniny. Stosunek powierzchni piku wynosi 1,78. Na podstawie współczynnika odpowiedzi i znanego stężenia adeniny (0,33 mg/ml) oblicza się stężenie kofeiny w nieznanej próbce na 0,33 mg/ml.

Rysunek 1. Wykres kalibracyjny przy użyciu wzorca wewnętrznego. Wykres stosunków powierzchni w funkcji stężeń dla 3 standardowych próbek kofeiny (1, 0,5 i 0,2 mg/ml) z dodatkiem 0,33 mg/ml wewnętrznego wzorca adeniny do każdej. Nachylenie linii wynosi 1,8, co jest współczynnikiem odpowiedzi.

Rysunek 2. Chromatogram kawy z wewnętrznym wzorcem adeniny. Wykres odpowiedzi detektora FID na próbki. Trzy główne szczyty to adenina (IS), kofeina i kwas palmitynowy.