Standardy wewnętrzne

1. Prawidłowe obchodzenie się z próbką: tworzenie roztworu

1. Weź czystą zlewkę i zmasuj w niej odpowiednią ilość próbki. Zapisz rzeczywistą użytą masę. W tym przykładzie roztwór adeniny sporządza się w kolbie miarowej w celu wykorzystania jako wzorzec wewnętrzny do następnej analizy. Masa adeniny wynosi 100 mg. Nie masować bezpośrednio w kolbie miarowej, ponieważ ma ona długą szyjkę i adeniny nie można łatwo dodać ani usunąć.
2. Dodać około 25 ml rozpuszczalnika (w tym przypadku dimetylosulfotlenku (DMSO)) do zlewki i pozostawić do rozpuszczenia. W tym przykładzie końcowy roztwór sporządza się w kolbie miarowej o pojemności 50 ml, więc dodaj tylko około 25 ml, aby zlewkę można było przepłukać, a roztwór uzupełnić do końcowej objętości.
3. Po rozpuszczeniu ciała stałego wlać roztwór do kolby miarowej.
4. Przepłukać zlewkę i mieszadło niewielką ilością rozpuszczalnika, około 10 ml, i wlać płukanie do kolby miarowej. Powtórz jeszcze dwa razy. Pomaga to zapewnić prawidłowy transfer rozwiązania.

2. Przygotowanie krzywej wzorca wewnętrznego wzorca wzorcowego

1. Przygotować żądane próbki wzorcowe do analizy metodą chromatografii gazowej. W tym przykładzie kofeina jest ekstrahowana z kawy za pomocą acetonitrylu, a następnie adenina jest używana jako wewnętrzny wzorzec do pomiaru.
2. W przypadku próbek kofeiny należy odważyć ilość próbki potrzebną do sporządzenia próbki o objętości 1 mg/ml. W przypadku użycia kolby miarowej o pojemności 10 ml jest to 10 mg.
3. Zważyć analit do zlewki, dodać kilka ml rozpuszczalnika (w tym przypadku metanolu) do rozpuszczenia, a następnie przenieść ilościowo do kolby miarowej za pomocą 3 płukań.
4. Zrób 3 kolejne wzorce w podobny sposób z 0,2, 0,5 i 2 mg/ml kofeiny.
5. Umieścić 1 ml każdego wzorca kofeiny w fiolce z próbką.
6. Dodać 0,2 ml wewnętrznego wzorca adeniny 2 mg/ml do każdej fiolki z próbką.
7. Przeprowadź eksperyment chromatografii gazowej z każdym wzorcem kofeiny. Dla każdego chromatogramu należy obliczyć stosunek powierzchni pików dla kofeiny w stosunku do wzorca.
8. Zrób wykres stosunku powierzchni do stosunku stężenia. Nachylenie tej działki jest czynnikiem odpowiedzi.

3. Przygotowanie rzeczywistej próbki z wewnętrznym wzorcem do chromatografii gazowej

1. Przygotować żądaną próbkę do analizy metodą chromatografii gazowej. W tym przykładzie kofeina jest ekstrahowana z kawy przy użyciu acetrontrylu.
2. W przypadku próbki kawy rozmasuj 2 g kawy w zlewce o pojemności 100 ml. Zapisz dokładną wagę kawy.
3. Dodaj 20 ml acetonitrylu do zlewki.
4. Pozostaw na 20 minut, często mieszając.
5. Odfiltruj fusy z kawy za pomocą bibuły filtracyjnej w lejku.
6. Wypłucz bibułę filtracyjną 3x niewielką ilością acetonitrylu (5 ml).
7. Zmierzyć końcową objętość filtratu. Powinno to być około 35 ml.

4. Uruchom próbkę i oblicz stężenie

1. Pobrać 1 ml próbki ekstraktu kawy i dodać 0,2 ml wzorca wewnętrznego do fiolki. Umieścić fiolkę w stojaku na próbnik automatyczny.
2. Uruchom analizę GC próbki. Upewnij się, że warunki GC są takie, że kofeina i adenina oddzielają się. W tym przykładzie separacje izotermiczne są przeprowadzane w temperaturze 200 °C.
3. Po zakończeniu analizy należy obliczyć powierzchnię piku zarówno dla piku wzorca wewnętrznego, jak i piku analitu. Korzystając z ich proporcji, oblicz ilość kofeiny w próbce.

5. Wyniki: Analiza GC kofeiny z wewnętrznym wzorcem

1. Analiza GC kofeiny jest pokazana na Rysunek 1. Adenina jest stosowana jako wzorzec wewnętrzny. Stosunek powierzchni pików można zmierzyć i wykreślić w stosunku do stosunku stężeń. Nachylenie działki jest współczynnikiem odpowiedzi (w tym przypadku 1,8).
2. Rysunek 2 przedstawia chromatogram próbki kawy z wewnętrznym wzorcem adeniny. Stosunek powierzchni piku wynosi 1,78. Na podstawie współczynnika odpowiedzi i znanego stężenia adeniny (0,33 mg/ml) oblicza się stężenie kofeiny w nieznanej próbce na 0,33 mg/ml.

Rysunek 1. Wykres kalibracyjny przy użyciu wzorca wewnętrznego. Wykres stosunków powierzchni w funkcji stężeń dla 3 standardowych próbek kofeiny (1, 0,5 i 0,2 mg/ml) z dodatkiem 0,33 mg/ml wewnętrznego wzorca adeniny do każdej. Nachylenie linii wynosi 1,8, co jest współczynnikiem odpowiedzi.

Rysunek 2. Chromatogram kawy z wewnętrznym wzorcem adeniny. Wykres odpowiedzi detektora FID na próbki. Trzy główne szczyty to adenina (IS), kofeina i kwas palmitynowy.