3.2: Standardy wewnętrzne

1. Prawidłowe obchodzenie się z próbką: tworzenie roztworu

1. Weź czystą zlewkę i zmasuj w niej odpowiednią ilość próbki. Zapisz rzeczywistą użytą masę. W tym przykładzie roztwór adeniny sporządza się w kolbie miarowej w celu wykorzystania jako wzorzec wewnętrzny do następnej analizy. Masa adeniny wynosi 100 mg. Nie masować bezpośrednio w kolbie miarowej, ponieważ ma ona długą szyjkę i adeniny nie można łatwo dodać ani usunąć.
2. Dodać około 25 ml rozpuszczalnika (w tym przypadku dimetylosulfotlenku (DMSO)) do zlewki i pozostawić do rozpuszczenia. W tym przykładzie końcowy roztwór sporządza się w kolbie miarowej o pojemności 50 ml, więc dodaj tylko około 25 ml, aby zlewkę można było przepłukać, a roztwór uzupełnić do końcowej objętości.
3. Po rozpuszczeniu ciała stałego wlać roztwór do kolby miarowej.
4. Przepłukać zlewkę i mieszadło niewielką ilością rozpuszczalnika, około 10 ml, i wlać płukanie do kolby miarowej. Powtórz jeszcze dwa razy. Pomaga to zapewnić prawidłowy transfer rozwiązania.

2. Przygotowanie krzywej wzorca wewnętrznego wzorca wzorcowego

1. Przygotować żądane próbki wzorcowe do analizy metodą chromatografii gazowej. W tym przykładzie kofeina jest ekstrahowana z kawy za pomocą acetonitrylu, a następnie adenina jest używana jako wewnętrzny wzorzec do pomiaru.
2. W przypadku próbek kofeiny należy odważyć ilość próbki potrzebną do sporządzenia próbki o objętości 1 mg/ml. W przypadku użycia kolby miarowej o pojemności 10 ml jest to 10 mg.
3. Zważyć analit do zlewki, dodać kilka ml rozpuszczalnika (w tym przypadku metanolu) do rozpuszczenia, a następnie przenieść ilościowo do kolby miarowej za pomocą 3 płukań.
4. Zrób 3 kolejne wzorce w podobny sposób z 0,2, 0,5 i 2 mg/ml kofeiny.
5. Umieścić 1 ml każdego wzorca kofeiny w fiolce z próbką.
6. Dodać 0,2 ml wewnętrznego wzorca adeniny 2 mg/ml do każdej fiolki z próbką.
7. Przeprowadź eksperyment chromatografii gazowej z każdym wzorcem kofeiny. Dla każdego chromatogramu należy obliczyć stosunek powierzchni pików dla kofeiny w stosunku do wzorca.
8. Zrób wykres stosunku powierzchni do stosunku stężenia. Nachylenie tej działki jest czynnikiem odpowiedzi.

3. Przygotowanie rzeczywistej próbki z wewnętrznym wzorcem do chromatografii gazowej

1. Przygotować żądaną próbkę do analizy metodą chromatografii gazowej. W tym przykładzie kofeina jest ekstrahowana z kawy przy użyciu acetrontrylu.
2. W przypadku próbki kawy rozmasuj 2 g kawy w zlewce o pojemności 100 ml. Zapisz dokładną wagę kawy.
3. Dodaj 20 ml acetonitrylu do zlewki.
4. Pozostaw na 20 minut, często mieszając.
5. Odfiltruj fusy z kawy za pomocą bibuły filtracyjnej w lejku.
6. Wypłucz bibułę filtracyjną 3x niewielką ilością acetonitrylu (5 ml).
7. Zmierzyć końcową objętość filtratu. Powinno to być około 35 ml.

4. Uruchom próbkę i oblicz stężenie

1. Pobrać 1 ml próbki ekstraktu kawy i dodać 0,2 ml wzorca wewnętrznego do fiolki. Umieścić fiolkę w stojaku na próbnik automatyczny.
2. Uruchom analizę GC próbki. Upewnij się, że warunki GC są takie, że kofeina i adenina oddzielają się. W tym przykładzie separacje izotermiczne są przeprowadzane w temperaturze 200 °C.
3. Po zakończeniu analizy należy obliczyć powierzchnię piku zarówno dla piku wzorca wewnętrznego, jak i piku analitu. Korzystając z ich proporcji, oblicz ilość kofeiny w próbce.

5. Wyniki: Analiza GC kofeiny z wewnętrznym wzorcem

1. Analiza GC kofeiny jest pokazana na Rysunek 1. Adenina jest stosowana jako wzorzec wewnętrzny. Stosunek powierzchni pików można zmierzyć i wykreślić w stosunku do stosunku stężeń. Nachylenie działki jest współczynnikiem odpowiedzi (w tym przypadku 1,8).
2. Rysunek 2 przedstawia chromatogram próbki kawy z wewnętrznym wzorcem adeniny. Stosunek powierzchni piku wynosi 1,78. Na podstawie współczynnika odpowiedzi i znanego stężenia adeniny (0,33 mg/ml) oblicza się stężenie kofeiny w nieznanej próbce na 0,33 mg/ml.

Rysunek 1. Wykres kalibracyjny przy użyciu wzorca wewnętrznego. Wykres stosunków powierzchni w funkcji stężeń dla 3 standardowych próbek kofeiny (1, 0,5 i 0,2 mg/ml) z dodatkiem 0,33 mg/ml wewnętrznego wzorca adeniny do każdej. Nachylenie linii wynosi 1,8, co jest współczynnikiem odpowiedzi.

Rysunek 2. Chromatogram kawy z wewnętrznym wzorcem adeniny. Wykres odpowiedzi detektora FID na próbki. Trzy główne szczyty to adenina (IS), kofeina i kwas palmitynowy.

Utrata próbki może wystąpić za każdym razem, gdy próbka jest przenoszona lub przenoszona, co utrudnia dokładne obliczenia stężenia.

Aby zapewnić dokładność, skutki utraty próbki muszą być zminimalizowane poprzez staranne przygotowanie próbki oraz ograniczenie liczby etapów obsługi i przenoszenia próbki. Jednak utrata próbki może również wystąpić z powodu błędów systematycznych, takich jak niekompletna manipulacja próbką, efekty macierzy i różnice w procedurze analitycznej.

Te źródła strat można wyjaśnić, dodając znane stężenie gatunku podobnego, ale nie identycznego, do związku będącego przedmiotem zainteresowania. Nazywa się to standardem wewnętrznym. Wszelkie ubytki próbki, które występują w wzorcu wewnętrznym, powinny być podobne dla analitu, co pozwoli na dokładne obliczenie stężenia.

Ten film zilustruje zastosowanie wewnętrznego wzorca i właściwej techniki laboratoryjnej w celu uwzględnienia utraty próbki podczas określania stężenia nieznanego składnika.

Wzorzec wewnętrzny to substancja dodawana w znanej ilości do wzorców, próbek i ślepych prób podczas analizy.

W chromatografii i spektroskopii oblicza się stosunek sygnału dla wzorca wewnętrznego i analitu. Stosunek ten, zwany współczynnikiem odpowiedzi, jest proporcjonalny do stosunku stężeń analitu i wzorca.

Współczynnik odpowiedzi, R, można wyrazić za pomocą następującego równania, gdzie A oznacza sygnały analityczne próbki i wzorca wewnętrznego, a C oznacza stężenia próbki i wzorca wewnętrznego.

Wzorzec wewnętrzny może kompensować zarówno błędy systematyczne, jak i losowe. Na przykład błędy losowe – takie jak niespójności podczas pomiaru próbki – będą takie same zarówno dla wzorca wewnętrznego, jak i analitu. Dlatego stosunek ich sygnałów nie ulegnie zmianie.

W przypadku błędów systematycznych, takich jak efekty matrycy w roztworze, stosunek pozostanie niezmieniony, o ile efekt matrycy jest równy zarówno dla wzorca, jak i analitu.

Chociaż normy wewnętrzne zapewniają ogromne korzyści, wybór takiego, który jest odpowiedni, może być trudny. Wzorzec wewnętrzny musi mieć sygnał, który jest podobny, ale nie identyczny z analitem. Nie może również w żaden sposób wpływać na pomiar analitu.

Wreszcie, stężenie musi być dobrze znane. Osiąga się to poprzez zapewnienie, że wzorzec wewnętrzny nie jest natywnie obecny w próbce; Tak więc jedynym jego źródłem w roztworze jest znane stężenie dodane.

W poniższym eksperymencie stężenie kofeiny w nieznanej próbce zostanie określone za pomocą chromatografii gazowej.

Osiąga się to poprzez stworzenie krzywej kalibracyjnej przy użyciu znanych roztworów kofeiny, z adeniną jako wzorcem wewnętrznym. Nachylenie krzywej kalibracyjnej jest równe współczynnikowi odpowiedzi.

Gdy znany jest współczynnik odpowiedzi, stężenie niewiadomej można obliczyć na podstawie zmierzonego stosunku powierzchni chromatogramu.

Teraz, gdy rozumiesz już podstawy standardów wewnętrznych, przyjrzyjmy się procedurze.

Aby rozpocząć procedurę, dokładnie odważ 100 mg wzorca wewnętrznego, adeniny, do czystej zlewki.

Następnie rozpuść go w około 20 ml dimetylosulfotlenku i wymieszaj roztwór.

Po rozpuszczeniu adeniny wlać roztwór do kolby miarowej o pojemności 50 ml.

Przepłukać zlewkę i mieszadło 10 ml DMSO i wlać płukankę do kolby. Powtórz to płukanie dwukrotnie, aby zapewnić prawidłowe przenoszenie roztworu. Napełnić do znaku kalibracji, otrzymując wzorzec wewnętrzny o stężeniu 2 mg/ml.

Następnie odważyć 100 mg kofeiny w zlewce, aby przygotować roztwór podstawowy. Rozpuść kofeinę w niewielkiej ilości metanolu. Następnie należy użyć 3 płukań, aby przenieść ten roztwór do świeżej kolby miarowej o pojemności 25 ml. Jest to roztwór podstawowy o stężeniu 4 mg/ml. Użyj go, aby stworzyć 3 standardy kofeiny.

Następnie dodać 0,2 ml wzorca wewnętrznego, adeniny, do każdej kolby. Napełnij każdy do ostatniej objętości metanolem. Przenieść każdy roztwór do fiolki z próbką.

Przepuść każdy wzorzec kofeiny przez chromatograf gazowy. Oblicz stosunek powierzchni pików dla kofeiny do wzorca adeniny.

Najpierw zważ 2 g kawy do zlewki o pojemności 100 ml i zapisz wagę.

Następnie dodaj 20 ml metanolu, aby wyekstrahować kofeinę z kawy. Pozostaw roztwór do mieszania przez 20 minut.

Za pomocą lejka B?chnera odfiltruj fusy z kawy. Opłucz zlewkę niewielką ilością metanolu i wlej ten płyn do lejka. Powtórz płukanie dwukrotnie.

Zmierzyć końcową objętość filtratu; powinno wynosić około 35 ml.

Aby przygotować próbkę do analizy, dodaj 1 ml ekstraktu kawy do fiolki z próbką. Następnie dodaj 0,2 ml wewnętrznego wzorca adeniny i umieść fiolkę w stojaku na automatyczny próbnik urządzenia.

Przeprowadzić analizę próbki metodą chromatografii gazowej, upewniając się, że warunki są takie, że kofeina i adenina są oddzielone.

Po zakończeniu analizy należy obliczyć powierzchnię piku zarówno dla wzorca wewnętrznego, jak i analitu.

Po przeanalizowaniu wszystkich próbek można wyznaczyć wzorcową krzywą kalibracyjną dla roztworów kofeiny/adeniny, wykreślając stosunki powierzchni pików w stosunku do stosunków stężeń. Nachylenie tej linii, która reprezentuje współczynnik odpowiedzi, wynosiło 1,8.

Następnie analizowane są dane GC z wyekstrahowanej próbki kawy. Obliczono, że stosunek powierzchni pików wynosi 1,78. Korzystając ze współczynnika odpowiedzi i znanego stężenia wzorca wewnętrznego, adeniny, obliczono, że stężenie kofeiny w nieznanej próbce wynosi 0,33 mg/ml.

Wiele różnych typów reakcji, u różnych badaczy naukowych, wykorzystuje wewnętrzne standardy, aby zminimalizować skutki błędów i utraty próbki.

Skutki ubytku próbki występujące podczas przygotowywania próbki można zminimalizować za pomocą wzorców wewnętrznych, utrzymując ich stosunek stężeń prawie stały.

W tym przykładzie bioaktywne lipidy wyekstrahowano z komórek poddanych lizie w procesie ekstrakcji ciecz-ciecz. Na początku ekstrakcji dodano wewnętrzne wzorce stabilnych izotopów, aby uwzględnić błędy podczas przygotowywania próbki.

Wewnętrzne wzorce miały kluczowe znaczenie nie tylko dla przygotowania bioaktywnych lipidów, ale także dla analizy. Lipidy oddzielono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej i przeanalizowano za pomocą spektrometrii mas.

W spektroskopii wzorce wewnętrzne mogą pomóc w korekcji błędów losowych spowodowanych zmianami intensywności źródła światła. Jeśli lampa lub inne źródło światła ma zmienną moc, wpłynie to na absorpcję, a co za tym idzie, emisję próbki. Jednak stosunek wzorca wewnętrznego do analitu pozostanie stały, nawet jeśli źródło światła nie jest stałe.

W chromatografii jednym z największych źródeł błędu jest iniekcja. Automatyczne próbniki pomagają to zminimalizować, ale błąd może nadal wynosić 1?2% względnego odchylenia standardowego.

W tym przykładzie wzorce par zawierające wzorzec wewnętrzny zostały przeanalizowane za pomocą chromatografii gazowej w celu wyznaczenia krzywej kalibracyjnej. Po zakończeniu tego procesu można było zmierzyć nieznaną próbkę i uwzględnić straty spowodowane zmiennością próbki.

Właśnie obejrzeliście wprowadzenie JoVE do wewnętrznych standardów. Należy teraz zapoznać się z najlepszymi praktykami dotyczącymi minimalizowania strat próbek, standardów wewnętrznych i czynników odpowiedzi.

Dzięki za oglądanie!