Name: Przygotowanie pierwotnych hodowli komórek krwiotwórczych z mysiego szpiku kostnego do elektroporacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-06T23:59:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Naucz się izolacji pierwotnych komórek krwiotwórczych z mysiego szpiku kostnego i ich transfekcji metodą elektroporacji. Protokół umożliwia różnicowanie w komórki tuczne i bazofile z wydajnością około 30%.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pozyskiwanie szpiku kostnego z kości udowych i piszczelowych
<ol>
<li>Pierwszym krokiem procedury jest pobranie szpiku kostnego z kości udowych i piszczelowych myszy w wieku od 6 do 12 tygodni (używamy myszy BALB/c, ale procedurę tę można przeprowadzić na dowolnym szczepie myszy). Na początek należy poddać mysz eutanazji poprzez inhalację CO2 (nie będzie to pokazane). Następnie należy pobrać kości udowe i piszczelowe z tylnych kończyn każdego zwierzęcia. Potem, za pomocą żyletki, należy odciąć oba końce kości udowych, aby usunąć stawy biodrowe i kolanowe oraz odsłonić szpik.</li>
<li>W podobny sposób należy odciąć oba końce kości piszczelowych, aby usunąć obszary sąsiadujące z kolanem i kostką oraz odsłonić szpik.</li>
<li>Należy wziąć strzykawkę 3 mL z igłą o rozmiarze 26G i napełnić ją medium RPMI uzupełnionym o 10% FBS, penicylinę, streptomycynę i beta-merkaptoetanol (BME = 100 uM). Trzymając kość pęsetą nad szalką Petriego zawierającą medium RPMI, należy wprowadzić igłę strzykawki do jednego z końców kości i nacisnąć tłok, aby wypłukać szpik kostny. Igłę strzykawki można przesuwać w górę i w dół wewnątrz kości, aby wypłukać pozostałości szpiku.</li>
<li>Należy powtórzyć tę procedurę dla wszystkich kości, a następnie przystąpić do zakładania kultur.</li>
</ol>
Zakładanie kultur
<ol>
<li>Aby przygotować hodowle szpiku kostnego, kilkakrotnie pipetuj wypłukany szpik góra-dół, aby rozbić tkankę do postaci zawiesiny komórkowej.</li>
<li>Umieść filtr 70 µm na górze probówki stożkowej o pojemności 50 mL, a następnie przenieś zawiesinę komórkową na filtr.</li>
<li>Wypłucz szalkę Petriego raz medium RPMI, a następnie dodaj płuczkę do filtra 70 µm.</li>
<li>Używając gumowej końcówki tłoka strzykawki 1 mL, rozetrzyj fragmenty szpiku kostnego pozostałe na filtrze 70 µm.</li>
<li>Przemyj filtr raz medium RPMI.</li>
<li>Po przemyciu filtra odwiruj zawiesinę komórkową przy 1200 rpm przez 5 minut.</li>
<li>Przemyj osad komórkowy, resuspendując go w PBS.</li>
<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru. Zazwyczaj otrzymujemy ~90 milionów komórek z kości jednej myszy (dwie kości udowe oraz dwie piszczelowe). Po policzeniu komórek odwiruj je ponownie przy 1200 rpm przez 5 minut.</li>
<li>Resuspenduj komórki w niewielkiej ilości RPMI i rozdziel je do kolb hodowlanych zawierających odpowiednią ilość RPMI, tak aby końcowe stężenie wynosiło 1 milion komórek per mL.</li>
<li>Dodaj cytokiny, aby promować rozwój interesującego Cię typu komórek. W tym przypadku dodaje się cytokinę interleukinę-3 (IL-3 = 10 ng/mL) w celu promowania rozwoju bazofili i mastocytów. Aby uzyskać bazofile, inkubuj przez 10 dni. W przypadku mastocytów inkubuj przez 5 tygodni. Podczas generowania mastocytów pożywkę oraz IL-3 należy wymieniać raz w tygodniu.</li>
<li>Oto obraz przedstawiający wygląd mastocytów tuż po wysianiu. Zdjęcie to demonstruje różnicowanie komórek szpiku w bazofile i mastocyty 10 dni po dodaniu interleukiny-3.</li>
<li>Po uzyskaniu pożądanego typu komórek przejdź do etapu elektroporacji.</li>
</ol>
&nbsp;
Elektroporacja komórek
<ol>
<li>Aby rozpocząć etap elektroporacji, należy określić liczbę komórek w kolbie hodowlanej.</li>
<li>Komórki są zazwyczaj elektroporowane przy gęstości 10 milionów na mL, dlatego należy przenieść wymaganą liczbę komórek do probówek stożkowych i wirować je przy 1200 rpm przez 5 minut.</li>
<li>Po wirowaniu należy odpisać podłoże, przemyć komórki 1X PBS, a następnie ponownie wirować przy 1200 rpm przez 5 minut.</li>
<li>Należy odpisać PBS i dodać bufor do elektroporacji Bio-Rad Gene Pulser, aby przygotować zawiesinę komórkową o stężeniu 10 milionów komórek na mL.</li>
<li>Po resuspensji komórek należy dodać wybrany plazmidowy DNA do końcowego stężenia od 10 do 20 mikrogramów na mL.</li>
<li>Należy nalać alikwoty po 150 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do wybranych studzienek na 96-dołkowej płytce do elektroporacji.</li>
<li>Płytkę do elektroporacji należy umieścić w komorze płyty MXcell i zamknąć pokrywę.</li>
<li>Przed transfekcją komórek tuczawnych należy zaprogramować protokół elektroporacji w urządzeniu MXcell, chyba że stosowany jest protokół presetowany lub zapisany. W ramach eksperymentów optymalizacyjnych odkryliśmy, że najwyższa wydajność transfekcji komórek tuczawnych jest osiągana przy zastosowaniu protokołów impulsów prostokątnych. Zmienimy warunki elektroporacji na płytce, aby dostarczyć impulsy prostokątne o parametrach 300V/20ms, 350/15ms, 350V/20ms oraz 350V/10ms przy 2000uF i 1000 omów. Po ustawieniu i wgraniu protokołu do urządzenia należy nacisnąć „Pulse”, aby przeprowadzić elektroporację komórek.</li>
<li>Po zakończeniu elektroporacji należy przenieść komórki na płytkę do hodowli tkankowych. Zazwyczaj każdą próbkę do elektroporacji o objętości 150 mikrolitrów przenosimy do studzienki w 48-dołkowej płytce do hodowli tkankowych zawierającej 300 mikrolitrów RPMI (uzupełnionego o 10% FCS, penicylinę, streptomycynę i beta-merkaptoetanol) z dodatkiem 10 nanogramów na mL interleukiny-3. Komórki inkubuje się przez noc w temperaturze 37°C, a następnie 24 godziny później wykonuje się analizę ekspresji i supresji.</li>
</ol>
Wyniki transfekcji
W filmie przedstawiono obraz z mikroskopii fluorescencyjnej komórek po udanej elektroporacji z wykorzystaniem 20 µg/mL plazmidu GFP. Przy użyciu systemu do elektroporacji MXcell można uzyskać wydajność transfekcji na poziomie około 30%. System ten pozwala na modyfikację parametrów w celu maksymalizacji wydajności transfekcji przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek.

Wraz z pojawianiem się coraz większej ilości informacji genomicznych i rozwojem nowych narzędzi, takich jak siRNA, wykorzystanie komórek istotnych fizjologicznie stało się coraz ważniejsze dla pogłębienia naszej wiedzy na temat szlaków chorobowych, oddziaływań białko-białko oraz transdukcji sygnału. Komórki pierwotne pozyskuje się bezpośrednio z tkanek lub płynów ustrojowych i hoduje in vitro. Komórki te można modyfikować na wiele sposobów, w tym poprzez wprowadzenie egzogennego materiału genetycznego. Coraz bardziej oczywiste staje się, że najskuteczniejszą metodą wprowadzania plazmidowego DNA lub siRNA do komórek pierwotnych jest elektroporacja.
Elektroporacja polega na poddawaniu komórek impulsom elektrycznym w celu przejściowego zwiększenia przepuszczalności błony komórkowej, co umożliwia wprowadzenie egzogennych kwasów nukleinowych do wnętrza komórki. Ta metoda transfekcji może być optymalizowana w zależności od różnic między poszczególnymi typami lub liniami komórkowymi, dzięki czemu może być stosowana do transfekcji komórek tuczawnych, jak i każdej innej komórki pochodzącej z szpiku kostnego. Ponadto, w przeciwieństwie do transfekcji za pośrednictwem wirusów, elektroporacja nie nakłada ograniczeń na wielkość transfekowanego DNA ani nie wymaga rozbudowanych przygotowań. W porównaniu z transfekcją za pomocą lipidów, elektroporacja może być mniej toksyczna i nie prowadzi do uwięzienia transfekowanego kwasu nukleinowego w endosomach.
Firma Bio-Rad opracowała system elektroporacji MXcell specjalnie dla tych komórek. System MXcell pozwala na zmianę warunków w celu maksymalizacji wydajności transfekcji oraz przeżywalności komórek. Aby zoptymalizować wydajność transfekcji i zminimalizować śmierć komórek, można regulować i oceniać szereg parametrów elektroporacji, w tym napięcie, pojemność, oporność oraz długość impulsu.

<table><tbody><tr><td>System do elektroporacji Gene Pulser MXcell</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2670</td><td></td></tr><tr><td>Bufor do elektroporacji Gene Pulser</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2677</td><td></td></tr></tbody></table>

przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Coraz bardziej oczywiste staje się, że elektroporacja jest najskuteczniejszą metodą wprowadzania plazmidowego DNA lub siRNA do komórek pierwotnych. System elektroporacji Gene Pulser MXcell oraz bufor do elektroporacji Gene Pulser zostały opracowane specjalnie w celu transfekcji kwasów nukleinowych do komórek ssaków oraz komórek trudnych do transfekcji, takich jak komórki pierwotne i macierzyste. Niniejszy materiał wideo demonstruje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, a następnie ich przygotowanie do elektroporacji w systemie MXcell. Proces rozpoczynamy od izolacji kości udowej i piszczelowej. Następnie pobierany jest szpik kostny z obu tych kości i tworzone są kultury. Wyhodowane komórki szpiku kostnego są następnie poddawane transfekcji i analizie.

Niniejsza procedura opisuje sposób tworzenia pierwotnych kultur komórek krwiotwórczych z szpiku kostnego myszy, po których następuje transfekcja przy użyciu systemu elektroporacji Gene Pulser MXCell.

Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

Coraz jaśniej staje się widoczne, że elektroporacja jest najskuteczniejszą metodą wprowadzania plazmidowego DNA lub siRNA do komórek pierwotnych. Gene Pulser ...

Procedura ta rozpoczyna się od pobrania kości udowych i piszczelowych myszy. Po usunięciu stawów biodrowych, kolanowych i skokowych, szpik jest izolowany poprzez wstrzyknięcie medium RPMI do otwartego końca kości. Po uzyskaniu zawiesiny pojedynczych komórek, komórki szpiku kostnego są różnicowane w mastocyty, przenoszone na 96-dołkowe płytki do elektroporacji, a następnie transfekowane.Z zastosowaniem systemu elektroporacji Gene Pulse lub MX Cell, przy użyciu protokołów impulsów prostokątnych, można uzyskać wydajność transfekcji na poziomie około 30%. Pierwszym krokiem procedury jest pobranie szpiku kostnego z kości udowej i piszczelowej myszy w wieku od 6 do 12 tygodni.Aby rozpocząć, należy przeprowadzić eutanazję myszy poprzez inhalację CO2, a następnie pobrać kości udowe i piszczelowe z tylnych kończyn każdej myszy. Następnie za pomocą żyletki odciąć oba końce kości udowej, aby usunąć stawy biodrowe i kolanowe oraz odsłonić szpik w podobny sposób. Odciąć oba końce kości piszczelowej, aby usunąć obszary przylegające do kolana i kostki oraz odsłonić szpik.Następnie należy pobrać do strzykawki z igłą o rozmiarze 26,5 G pożywkę RPMI uzupełnioną o 10% FBS, penicylinę, streptomycynę, beamer, capita ethanol oraz L-glutaminę. Przytrzymując kość pęsetą nad szalką Petriego zawierającą pożywkę RPMI, należy wprowadzić igłę strzykawki do jednego z końców kości i nacisnąć tłok, aby wypłukać szpik kostny.Igłę strzykawki można przesuwać w górę i w dół wewnątrz kości, aby wypłukać pozostałości szpiku. Powtórz tę procedurę dla wszystkich kości, a następnie przystąp do tworzenia kultur. Aby utworzyć kultury szpiku kostnego, pipetuj wypłukany szpik kilkakrotnie w górę i w dół, aby rozbić tkankę do postaci zawiesiny komórkowej.Następnie na 50 mililitrową probówkę stożkową nałożyć filtr o rozmiarze oczek 70 µm i przenieść do niego zawiesinę komórkową. Kolejno przepłukać raz szalkę Petriego za pomocą medium RPMI. Następnie dodać płuczynkę do filtra 70 µm i za pomocą gumowej końcówki tłoka strzykawki 1 ml rozetrzeć pozostałe na filtrze fragmenty szpiku kostnego.Przemyj filtr raz medium RPMI po przeprowadzeniu poprzedniego płukania. Odwiruj zawiesinę komórkową przy 1200 RPM przez pięć minut. Przemyj osad komórkowy, resuspensując go w PBS.Policz komórki, używając komoryahemocytometru. Zazwyczaj otrzymujemy około 90 milionów komórek z kości jednej myszy, dwóch kości udowych oraz dwóch kości piszczelowych. Po policzeniu komórek ponownie je odwirowuj przy 1200 RPM przez pięć minut.Resuspenduj komórki w niewielkiej ilości pożywki RPMI i rozdziel je do kolb do hodowli tkankowej zawierających odpowiednią ilość RPMI, tak aby stężenie końcowe wynosiło 1 milion komórek na mililitr. Następnie dodaj cytokiny, aby promować rozwój interesującego Cię typu komórek. W tym przypadku dodaje się cytokinę interleukinę 3 w celu stymulacji rozwoju bazofilów i komórek tucznych; aby uzyskać bazofile, inkubuj przez 10 dni, a w przypadku generowania komórek tucznych inkubuj przez pięć tygodni.Pożywkę oraz IL three należy wymieniać raz w tygodniu. Oto obraz przedstawiający wygląd komórek szpiku kostnego bezpośrednio po wysianiu. Ten obraz demonstruje różnicowanie komórek szpiku kostnego w bazofile i komórki tuczne 10 dni po dodaniu interleukiny three.Po uzyskaniu pożądanego typu komórek należy przystąpić do etapu elektroporacji. Aby rozpocząć elektroporację, należy określić liczbę komórek w hodowli. Komórki z kolby są zazwyczaj elektroporowane przy gęstości 10 milionów na mililitr.Przenieś wymaganą liczbę komórek do probówek stożkowych i wiruj je z prędkością 1200 RPM przez pięć minut. Po wirowaniu odessij pożywkę, przemyj komórki raz za pomocą XPBS i ponownie wiruj przy 1200 RPM przez pięć minut. Następnie odessij PBS i dodaj bufor do elektroporacji BioRad gene pulsar, aby przygotować zawiesinę komórkową o stężeniu 10 milionów komórek na mililitr.Po ponownym zawieszeniu komórek należy dodać pożądane plazmidowe DNA w końcowym stężeniu od 10 do 20 µg/mL. Delikatnie wymieszać roztwór komórkowy i nanieść 150 µL zawiesiny komórkowej do wybranych studzienek na 96-dołkowej płytce do elektroporacji. Następnie umieścić płytkę do elektroporacji w komorze płytowej MXL i zamknąć pokrywę przed przeprowadzeniem transfekcji komórek szpiku kostnego i elektroporacji.Protokół musi zostać zaprogramowany w urządzeniu MXL, chyba że stosuje się protokół predefiniowany lub zapisany. W ramach eksperymentów optymalizacyjnych odkryliśmy, że najwyższa wydajność transfekcji komórek szpiku kostnego jest osiągana przy zastosowaniu protokołów impulsów prostokątnych. Zmienimy warunki elektroporacji na płytce, aby dostarczyć impulsy prostokątne o wartości 2000 µF przy 1000 Ω. Po ustawieniu i załadowaniu protokołu do urządzenia, naciśnij przycisk pulse, aby poddać komórki działaniu impulsów; po zakończeniu elektroporacji przenieś komórki na płytkę do hodowli tkankowej.Zazwyczaj przenosimy każdą próbkę 150 µL po elektroporacji do dołka płytki tkankowej z 48 dołkami, zawierającego 300 µL RPMI z 10 ng/mL interleukiny 3. Komórki inkubuje się przez noc w temperaturze 37 °C, a następnie po 24 godzinach analizuje się ekspresję i supresję. Jest to obraz komórek wykonany za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.Po przeprowadzeniu udanej elektroporacji z wykorzystaniem 20 µg/mL plazmidu GFP za pomocą systemu elektroporacji komórek MX, można uzyskać wydajność transfekcji na poziomie około 30%. System ten pozwala na modyfikację warunków w celu maksymalizacji wydajności transfekcji przy jednoczesnym zachowaniu żywotności komórek. System MX jest szczególnie użyteczny w przypadku pierwotnych komórek ssaków, takich jak te komórki krwiotwórcze myszy.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób izolacji komórek szpiku kostnego myszy oraz transfekcji zróżnicowanych komórek tucznych z wykorzystaniem systemu elektroporacji komórek MX. To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

the-preparation-primary-hematopoietic-cell-cultures-from-murine-bone

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Przygotowanie pierwotnych hodowli komórek krwiotwórczych z mysiego szpiku kostnego do elektroporacji

Niniejsza procedura przedstawia sposób wykorzystania systemu do elektroporacji Gene Pulser MXcell w celu szybkiego i łatwego zidentyfikowania optymalnych warunków elektroporacji dla embrionalnych fibroblastów mysich (MEFs) lub innych komórek pierwotnych. W towarzyszącym filmie omówiono również kwestie związane z rozwiązywaniem problemów.

Wykorzystanie systemu elektroporacji Gene Pulser MXcell do wysokowydajnej transfekcji komórek pierwotnych

Niniejsza procedura opisuje metodę izolacji i hodowli mysiego narządu Cortiego z lub bez listka spiralnego i neuronów zwoju spiralnego. Prezentujemy również metodę ekspresji egzogennego genu reporterowego w eksplantacie narządu Cortiego za pomocą elektroporacji.

Kultura pierwotna i elektroporacja plazmidowa mysiego narządu Cortiego.

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Protokół szybkiego rozerwania genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w pierwotnych komórkach krwiotwórczych myszy i człowieka jest opisany w tym artykule. Rybonukleoproteiny Cas9-sgRNA są wprowadzane przez elektroporację z sgRNA generowanymi przez transkrypcję in vitro i komercyjny Cas9. Wysoka wydajność edycji jest osiągana przy ograniczonych kosztach czasowych i finansowych.

Wysoce skuteczne rozrywanie genów mysich i ludzkich hematopoetycznych komórek progenitorowych za pomocą CRISPR/Cas9

Ten protokół ilustruje bezpieczną i skuteczną procedurę modyfikacji krwiotwórczych komórek macierzystych CD133+. Zaprezentowane niewirusowe, oparte na polipleksie magnetycznym podejście może stanowić podstawę do optymalizacji efektów terapeutycznych komórek macierzystych, a także do monitorowania podawanego produktu komórkowego za pomocą rezonansu magnetycznego.

Protokół transferu mikroRNA do dorosłych hematopoetycznych komórek macierzystych pochodzących ze szpiku kostnego w celu umożliwienia inżynierii komórkowej w połączeniu z celowaniem magnetycznym

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Ta metoda opisuje oczyszczanie za pomocą cytometrii przepływowej MEP i MKp z kości udowych, piszczelowych i miednicy myszy.

Izolacja progenitorów megakariocytów myszy

Tutaj prezentujemy ekonomiczną i efektywną metodę izolowania i generowania komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego o wysokiej czystości od myszy po 7 dniach hodowli z 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Ekonomiczny i wydajny protokół izolacji i hodowli komórek dendrytycznych pochodzących ze szpiku kostnego od myszy

Przedstawiono tutaj protokół do inicjowania, utrzymywania i analizowania hodowli mysich hematopoetycznych komórek macierzystych za pomocą ekspansji ex vivo na bazie alkoholu poliwinylowego, a także metody genetycznej manipulacji nimi za pomocą transdukcji lentiwirusowej i elektroporacji.

Ex vivo Ekspansja i manipulacja genetyczna krwionośnych komórek macierzystych myszy w kulturach na bazie alkoholu poliwinylowego

Tutaj prezentujemy protokoły, które umożliwiają izolację komórek zrębu z mysich kości, szpiku kostnego, grasicy i ludzkiej tkanki grasicy, kompatybilne z monokomórkową multiomiką.

Izolacja komórek zrębu z narządów krwiotwórczych

Naucz się izolacji pierwotnych komórek krwiotwórczych z mysiego szpiku kostnego i ich transfekcji metodą elektroporacji. Protokół umożliwia różnicowanie w komórki tuczne i bazofile z wydajnością około 30%.

Przygotowanie pierwotnych kultur komórek hematopoetycznych z szpiku kostnego myszy do elektroporacji

Przeglądaj więcej filmów