Name: Embrionalne komórki śródbłonka pochodzące z komórek macierzystych w leczeniu niedokrwienia kończyn tylnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Poznaj metodę wstrzyknięcia embrionalnych komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych do niedokrwiennej kończyny tylnej myszy oraz technikę śledzenia komórek za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Andrei Axtell, dr. med. Satoshi Itoh, dr. med. Jeffowi Velottcie, Grantowi Hoytowi, dr. med. Robertowi C. Robbinsowi, dr. med. Jin Yu, dr. Timowi Doyle'owi oraz Stanford Small Animal Imaging Core za pomoc techniczną. Autorzy dziękują również firmie A.M. Bickford, Inc. za udostępnienie sprzętu weterynaryjnego. Niniejsze badania były finansowane z grantów badawczych National Institutes of Health (R01 HL-75774, R01 CA098303, R21 HL085743, 1K12 HL087746), California Tobacco Related Disease Research Program Uniwersytetu Kalifornijskiego (15IT-0257 i 1514RT-0169) oraz California Institute for Regenerative Medicine (RS1-00183).
N.H. jest wspierany stypendium z American Heart Association. can Heart Association.

1. Różnicowanie mysich ESC w komórki śródbłonka
<ol>
<li>Protokół różnicowania ESC w komórki śródbłonka został opisany w innej publikacji i nie stanowi głównego celu niniejszego protokołu2,3. W skrócie, komórkom pozwala się na różnicowanie, a następnie komórki wykazujące pozytywny wynik dla markerów śródbłonka, takich jak CD31 lub naczyniowa kadheryna śródbłonka (VE-cadherin), są oczyszczane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS).</li>
</ol>
2. Konstrukcja podwójnego genu reporterowego fuzyjnego oraz transdukcja lentiwirusowa
<ol>
<li>Bioluminescencję można wykorzystać do śledzenia komórek zmodyfikowanych w celu ekspresji genów reporterowych, takich jak lucyferaza świetlika (fluc). W tej aplikacji nasze komórki zawierają zarówno fluc, jak i gen fuzyjny wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP) pod kontrolą wewnętrznego promotora ubikwityny. W celu modyfikacji komórek, do stabilnej transdukcji komórek po różnicowaniu można użyć lentiwirusowego wektora transgenicznego pFU-FG opracowanego w naszym laboratorium, który niesie gen reporterowy fuzji fluc-eGFP i zawiera kluczowe zoptymalizowane elementy genetyczne, aby spełnić kryteria bezpieczeństwa biologicznego oraz zwiększyć wydajność transdukcji. Konstrukt fuzyjny ten umożliwia śledzenie przeszczepionych komórek zarówno za pomocą bioluminescencji, jak i fluorescencji. Procedura generowania cząsteczek wirusa, transdukcji i produkcji znakowanych komórek wykazujących ekspresję genów reporterowych została opisana w innym opracowaniu4.</li>
</ol>
3. Transplantacja komórek śródbłonka pochodzących z ESC do niedokrwionej kończyny tylnej
<ol>
<li>Procedurę rozpoczyna się od przygotowania myszy z indukowanym niedokrwieniem kończyny tylnej do transplantacji komórek. W tym celu należy umieścić mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia zawierającej 1–3% izofluranu w 100% tlenie przy przepływie 1L/min.</li>
<li>Pozostawić mysz w komorze indukcyjnej do momentu utraty reakcji na bodźce zewnętrzne, a następnie wyjąć zwierzę z komory.</li>
<li>Następnie zwierzę należy ułożyć na stole operacyjnym w pozycji grzbietnej i podłączyć do ciągłego przepływu 1–3% izofluranu w 100% tlenie przy przepływie 1L/min.</li>
<li>Skórę kończyny tylnej przemyć trzykrotnie, naprzemiennie używając betadyny i alkoholu.</li>
<li>Po oczyszczeniu skóry przygotować milion komórek śródbłonka pochodzących z ESC w 30 μL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS). Komórki te należy nabrać do igły o rozmiarze 28 G.</li>
<li>Po przygotowaniu komórek należy delikatnie unieść i wyprostować kończynę tylną, aby lepiej uwidocznić położenie mięśnia brzuchatego łydki. Przy wyprostowanej nodze wprowadzić igłę przez skórę do leżącego poniżej mięśnia, uważając, aby nie dotrzeć do kości. Powoli i ostrożnie wstrzyknąć 30 μL zawiesiny komórek do mięśnia brzuchatego łydki. W przypadku iniekcji domięśniowej 30 μL jest objętością bliską granicy możliwości wstrzyknięcia. Dlatego zaleca się stosowanie strzykawek insulinowych o rozmiarze 28 G, ponieważ w naszym doświadczeniu eliminują one utratę objętości w igłach strzykawki.</li>
<li>Po zakończeniu iniekcji przenieść mysz do klatki regeneracyjnej i monitorować ją w sposób ciągły do momentu wybudzenia. Pozostawić zwierzę do regeneracji na kilka godzin, a następnie przystąpić do obrazowania bioluminescencyjnego in vivo przeszczepionych komórek.</li>
</ol>
4. Obrazowanie bioluminescencyjne komórek śródbłonka pochodzących z ESC in vivo
<ol>
<li>Przeszczepione komórki śródbłonka pochodzące z ESC zostały zmodyfikowane tak, aby wykaziwały ekspresję zarówno genu fluc, jak i genu fuzyjnego eGFP pod kontrolą wewnętrznego promotora ubikwityny. Dzięki temu bioluminescencję można wykorzystać do śledzenia komórek w niedokrwionej kończynie tylnej.</li>
<li>Aby rozpocząć ten etap, należy włączyć system obrazowania bioluminescencyjnego oraz oprogramowanie do akwizycji obrazu Living Image. Następnie należy zainicjować system akwizycji i określić wymiary pola widzenia.</li>
<li>Następnie na skrzynce obrazującej należy umieścić czarny matowy papier w celu pochłaniania emisji tła.</li>
<li>Po przygotowaniu skrzynki obrazującej należy umieścić mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia zawierającej 1–3% izofluranu w tlenie przy przepływie 1 L/min. Myszy należy pozostawić w komorze indukcyjnej do momentu, aż przestanie ona reagować na bodźce zewnętrzne. Następnie należy wyjąć zwierzę z komory indukcyjnej.</li>
<li>W razie potrzeby należy usunąć owłosienie z obu kończyn tylnych za pomocą strzygarki elektrycznej.</li>
<li>Do otrzewnej należy wstrzyknąć 10 μL D-lucyferyny na gram masy ciała. D-lucyferynę przygotowuje się wcześniej w postaci przefiltrowanych roztworów zapasowych o stężeniu 15 mg/mL w PBS.</li>
<li>Po wstrzyknięciu lucyferyny zwierzę należy umieścić w pozycji grzbietowej w skrzynce obrazującej na czarnym papierze, podłączając je do ciągłego przepływu izofluranu.</li>
<li>Umieszczanie zwierzęcia w skrzynce obrazującej i podłączanie do izofluranu.</li>
<li>Należy rozpocząć akwizycję obrazów przez 10–60 sekund, aby określić optymalny czas ekspozycji, przy którym obraz nie będzie przesycony. Jeśli obraz stanie się przesycony, należy skrócić czas ekspozycji. Jeśli sygnał bioluminescencyjny jest bardzo słaby, należy wydłużyć czas ekspozycji.</li>
<li>Stosując optymalny czas ekspozycji, należy kontynuować akwizycję zdjęć co 1–3 minuty, aż sygnał osiągnie maksimum, a następnie zacznie słabnąć. Po zakończeniu akwizycji należy zapisać plik.</li>
<li>Aby przeanalizować dane, należy zaznaczyć obszary zainteresowania (ROI), które obejmują miejsce wstrzyknięcia. Jako kontrolę negatywną można zaznaczyć podobny ROI dla nogi nieoperowanej. Za pomocą oprogramowania należy zmierzyć całkowitą radiancję dla ROI w każdym punkcie czasowym, wyrażoną w jednostkach fotonów/sekunda/cm2/steradian (p/s/cm2/sr). W końcowych danych należy wykorzystać wartość maksymalną. Dane można również wyeksportować do arkusza Excel w celu późniejszego wykorzystania.</li>
<li>Po zgromadzeniu wszystkich danych zwierzę należy przenieść do klatki rekonwalescencyjnej i stale monitorować do momentu przebudzenia.</li>
<li>Należy powtórzyć tę procedurę, aby śledzić komórki w czasie.</li>
<li>W wybranym punkcie czasowym zwierzę można poddać eutanazji w celu oceny funkcji tkanek.</li>
</ol>
5. Reprezentatywne wyniki
<img src="/files/ftp_upload/old/1034_2009_1_22_4/figure%201.png" alt="Obrazowanie bioluminescencyjne progresji nowotworu u myszy; analiza time-lapse i wykresu intensywności." width="600" height="600" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 1">
Reprezentatywny obraz bioluminescencji przeszczepionych komórek w lewym niedokrwionym kończynie tylnej przedstawiono na rysunku 1. Podczas akwizycji bioluminescencji intensywność będzie wzrastać w czasie, a maksymalną wartość uzyskaną w trakcie tego procesu należy podać jako wartość końcową.

<ol><li>Niiyama, H., Huang, N. F., Rollins, M., Cooke, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+hindlimb+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Murine model of hindlimb ischemia.</a> JoVE. , (2008).</li>
<li>Levenberg, S., Golub, J. S., Amit, M., Itsakovitz-Eldor, J., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+derived+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells derived from human embryonic stem cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 4391-4396 (2002).</li>
<li>Yamashita, J., Itoh, H., Hirashima, M., Ogawa, M., Nishikawa, S., Yurugi, T., Naito, M., Nakao, K., Nishikawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flk1-positive+cells+derived+from+embryonic+stem+cells+serve+as+vascular+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Flk1-positive cells derived from embryonic stem cells serve as vascular progenitors.</a> Nature. 408, 926-926 (2000).</li>
<li>De, A., Yaghoubi, S. S., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+lentiviral+vectors+in+noninvasive+molecular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Applications of lentiviral vectors in noninvasive molecular imaging.</a> Methods Mol Biol. 433, 177-202 (2008).</li>
<li>Niiyama, H., Kai, H., Yamamoto, T., Shimada, T., Sasaki, K., Murohara, T., Egashira, K., Imaizumi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+endogenous+monocyte+chemoattractant+protein-1+in+ischemia-induced+neovascularization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Coll.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Roles of endogenous monocyte chemoattractant protein-1 in ischemia-induced neovascularization.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 44, 661-666 (2004).</li>
<li>Cook, M. J. The anatomy of the laboratory mouse. , Academic Press. New York. (1976).</li>
<li>Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+indicators+in+living+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent indicators in living mammals.</a> Nature Med. 4, 245-247 (1998).</li>
<li>Ray, P., De, A., Min, J. J., Tsien, R. Y., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tri-fusion+multimodality+reporter+gene+expression+in+living+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging tri-fusion multimodality reporter gene expression in living subjects.</a> Cancer Res. 64, 1323-1330 (2004).</li>
<li>Huang, N. F., Lee, R. J., Li, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+physical+regulation+of+stem+cells+and+progenitor+cells%3A+potential+for+cardiovascular+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Chemical and physical regulation of stem cells and progenitor cells: potential for cardiovascular tissue engineering.</a> Tissue Eng. 13, 1809-1823 (2007).</li>
<li>Cao, F., Lin, S., Xie, X., Ray, P., Patel, M., Zhang, X., Drukker, M., Dylla, S. J., Connolly, A. J., Chen, X., Weissman, I. L., Gambhir, S. S., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+visualization+of+embryonic+stem+cell+survival%2C+proliferation%2C+and+migration+after+cardiac+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">In vivo visualization of embryonic stem cell survival, proliferation, and migration after cardiac delivery.</a> Circulation. 113, 1005-1114 (2006).</li>
<li>Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+bioluminescence+reporter+gene+imaging+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo bioluminescence reporter gene imaging of human embryonic stem cells.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
</ol>

ESC są obiecującym źródłem komórek do leczenia niedokrwienia tkanek ze względu na ich plastyczność różnicowania oraz zdolność do tworzenia linii komórkowych obejmujących wszystkie trzy listki zarodkowe, w tym komórki śródbłonka. Aby uniknąć kwestii etycznych związanych z ESC, alternatywnym źródłem pluripotencjalnych komórek macierzystych mogą być indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC). Poza ESC można wykorzystać komórki macierzyste dorosłych, takie jak komórki progenitorowe śródbłonka (EPC) i hematopoetyc...

<table><tbody><tr><td>Narzędzia chirurgiczne</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Igła strzykawki</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Preferowana jest strzykawka insulinowa 28G</td></tr><tr><td>Fosforanowy bufor solny (PBS)</td><td>Odczynnik</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-lucyferyna</td><td>Odczynnik</td><td>Biosynth International, Inc</td><td></td><td>Należy wcześniej przygotować D-lucyferynę w postaci filtrowanych roztworów zapasowych o stężeniu 15 mg/mL w PBS</td></tr><tr><td>System obrazowania bioluminescencyjnego IVIS 200 oraz oprogramowanie do akwizycji danych</td><td>Sprzęt</td><td><a href="http://www.perkinelmer.com/Catalog/Category/ID/IVIS%20Series" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Xenogen Corporation</a></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

komórki śródbłonka pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych w leczeniu niedokrwienia kończyny dolnej

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheralna choroba tętnic (PAD) wynika z zwężenia tętnic obwodowych doprowadzających utlenowaną krew i składniki odżywcze do nóg i stóp. Patologia ta powoduje takie objawy, jak przerywająca utykanie (ból podczas chodzenia), bolesne owrzodzenia niedokrwienne, a nawet zagrażającą kończynie gangrenę. Przyjmuje się powszechnie, że śródbłonek naczyniowy, czyli jednowarstwowa warstwa komórek endotelialnych wyścielająca powierzchnię światła wszystkich naczyń krwionośnych i limfatycznych, odgrywa dominującą rolę w homeostazie i regeneracji naczyniowej. W związku z tym regeneracja śródbłonka oparta na komórkach macierzystych może stanowić obiecujące podejście w leczeniu PAD.W tym filmie demonstrujemy transplantację komórek śródbłonka pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych (ESC) w celu leczenia jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej jako modelu PAD, a następnie nieinwazyjne śledzenie homingu i przeżywalności komórek za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego. Opisane zostaną konkretne materiały i procedury dotyczące dostarczania komórek oraz obrazowania. Niniejszy protokół opiera się na innej publikacji autorstwa Niiyama i wsp. w zakresie indukcji niedokrwienia kończyny tylnej.1

Przedstawiono procedurę chirurgicznego wprowadzenia komórek śródbłonka pochodnych z embrionalnych komórek macierzystych do niedokrwionej kończyny dolnej, z zastosowaniem nieinwazyjnego śledzenia za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Komórki śródbłonka pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych w leczeniu niedokrwienia kończyny dolnej

Choroba tętnic obwodowych (PAD) wynika z zwężenia tętnic obwodowych, które dostarczają natlenowaną krew i składniki odżywcze do kończyn dolnych i stóp. To...

Obwodowa choroba tętnic. PAD wynika z zwężenia tętnic obwodowych doprowadzających krew i tlen do nóg i stóp, co prowadzi do dysfunkcji naczyniowych. Aby ustalić, czy komórki macierzyste mogą być wykorzystane w leczeniu PAD, wstrzykujemy pochodne komórek śródbłonka z embrionalnych komórek macierzystych do kończyny tylnej po indukcji niedokrwienia.Ponieważ komórki te zostały zmodyfikowane w celu ekspresji lucyferazy świetlika, można je śledzić za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, aby ustalić, czy migrują one do miejsca urazu i wywierają efekt terapeutyczny. Cześć, jestem John Cook. Jestem profesorem medycyny w dziale medycyny sercowo-naczyniowej na Uniwersytecie Stanforda.Nasze laboratorium zajmuje się angiogenezą i regeneracją naczyniową. W tym filmie dwójka moich stażystów podoktorskich, dr Nan Wong i Hir Niyama, przedstawi procedury terapetycznego przeszczepiania komórek w niedokrwieniu kończyny dolnej oraz nieinwazyjne obrazowanie przeżywalności komórek. Procedury te obejmują następujące etapy: podanie embrionalnych komórek macierzystych bezpośrednio i stereotaktycznie w celu leczenia jednostronnego niedokrwienia kończyny dolnej oraz nieinwazyjne śledzenie migracji i przeżywalności komórek za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.Zacznijmy zatem. Procedurę należy rozpocząć od przygotowania ośmiomiesięcznej myszy szczepu SV 1 29 z wywołanym niedokrwieniem kończyny tylnej do transplantacji komórek. W tym celu umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia zawierającej od 1 do 3% izofluranu w 100% tlenu przy przepływie 1 L/min.Pozostaw mysz w komorze indukcyjnej do momentu, aż przestanie reagować na bodźce zewnętrzne. Następnie wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej. Umieść zwierzę na stole operacyjnym w pozycji grzbietnej i podłącz je do ciągłego przepływu 1-3% ISO w 100% tlenu przy szybkości przepływu 1 litr na minutę.Przetrzyj skórę kończyny tylnej, stosując naprzemiennie trzy razy Betadynę i alkohol. Po oczyszczeniu skóry przygotuj 1 milion komórek śródbłonka pochodzących z mysich embrionalnych komórek macierzystych w 30 µL fosforanu buforowanego solą (PBS). Załaduj te komórki do igły o rozmiarze 28G.Gdy komórki będą gotowe, delikatnie unieś i wyprostuj tylną kończynę, aby lepiej zwizualizować położenie mięśnia brzuchatego łydki. Przy wyprostowanej nodze wprowadź igłę przez skórę do leżącego pod nią mięśnia. Uważaj, aby nie dotknąć kości i powoli oraz delikatnie wstrzyknij 30 µL mieszaniny komórkowej do mięśnia brzuchatego łydki.W przypadku wstrzykiwań domięśniowych objętość 30 µL jest bliska granicy objętości, którą można wprowadzić. Dlatego preferowane są strzykawki insulinowe o rozmiarze 28G, ponieważ w naszym doświadczeniu eliminują one utratę objętości w igłach strzykawki. Po zakończeniu wstrzykiwania należy przenieść mysz do klatki rekonwalescencyjnej.Pozostaw zwierzę do rekonwalescencji przez kilka godzin, a następnie przeprowadź obrazowanie bioluminescencyjne in vivo przeszczepionych komórek. Przeszczepione komórki śródbłonkowe pochodzące z ESC zostały zmodyfikowane tak, aby wykazywały ekspresję zarówno genu lucyferazy świetlika, jak i genów fuzyjnych wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego pod kontrolą wewnętrznego promotora ubikwityny. Dzięki temu bioluminescencja może być wykorzystana do śledzenia komórek w niedokrwionej kończynie tylnej.Aby rozpocząć ten krok, włącz system obrazowania bioluminescencyjnego oraz oprogramowanie do akwizycji obrazów żywych organizmów. Następnie zainicjuj system akwizycji. Następnie określ wymiary pola widzenia.Następnie umieść czarny matowy papier na skrzynce obrazującej, aby pochłonąć emisję tła. Po przygotowaniu skrzynki obrazującej umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia zawierającej od 1 do 3% isofluoranu w tlenie przy przepływie jednego litra na minutę. Pozostaw mysz w komorze indukcyjnej do momentu, aż przestanie reagować na bodźce zewnętrzne.Następnie wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej. Wstrzyknij do otrzewnej 10 µL lucyferazy na gram masy ciała. Lucyferaza jest przygotowana wcześniej w formie filtrowanych roztworów treściwych o stężeniu 15 mg/mL w PBS.Po wstrzyknięciu lucyferazy umieść zwierzę w pozycji grzbietowej w boksie obrazującym na czarnym papierze, podłączając je do ciągłego przepływu izofluranu. Rozpocznij akwizycję obrazów przez 10 do 60 sekund, aby wyznaczyć optymalny czas ekspozycji, przy którym obraz nie będzie nasycony. Jeśli obraz ulegnie nasyceniu, skróć czas ekspozycji.Jeśli sygnał bioluminescencji jest bardzo słaby, należy zwiększyć czas ekspozycji. Przy zastosowaniu optymalnego czasu ekspozycji należy kontynuować wykonywanie zdjęć co jedną do trzech minut, aż sygnał osiągnie maksimum, a następnie zacznie słabnąć. Po zakończeniu każdej akwizycji należy zapisać plik w celu analizy danych, wybierając obszary zainteresowania (ROI), które obejmują miejsce wstrzyknięcia jako kontrolę negatywną.Podobny obszar zainteresowania (ROI) można wybrać dla nogi nieoperowanej. Za pomocą oprogramowania zmierz całkowitą radiancję dla tych samych obszarów ROI dla każdego pliku.W końcowych danych należy wykorzystać wartość maksymalną. Dane można również wyeksportować do arkusza programu Excel do późniejszego wykorzystania. Po zebraniu wszystkich danych należy przenieść zwierzę do klatki rekonwalescencyjnej i monitorować je do momentu przebudzenia; powtórz tę procedurę, aby śledzić komórki.W odpowiednim punkcie czasowym zwierzę można poddać eutanazji w celu oceny funkcji tkankowej. Przedstawiono tutaj reprezentatywny przebieg czasowy obrazowania bioluminescencyjnego przeszczepionych komórek w lewej niedokrwionej kończynie tylnej w pierwszej dobie po wstrzyknięciu komórek; obszarem zaznaczonym czerwonym okręgiem jest obszar zainteresowania ROI, do którego dostarczono komórki. Kolor koreluje z liczbą przeszczepionych komórek, gdzie kolor czerwony i żółty wskazują silniejszą intensywność bioluminescencji w porównaniu do koloru niebieskiego i zielonego.Jak widać, kończyna kontrolna nie wykazuje bioluminescencji, podczas gdy kończyna z wstrzykniętymi komórkami wykazuje silną bioluminescencję podczas rejestracji sygnału. Sygnał bioluminescencji w ROI będzie rósł w czasie aż do osiągnięcia wartości maksymalnej, a następnie zmaleje na tym wykresie. Maksymalna wartość bioluminescencji, mierzona jako maksymalna radiancja, zostaje osiągnięta w 27 minucie od rozpoczęcia rejestracji.W analizie danych należy podać tę wartość maksymalną. Przedstawiliśmy właśnie sposób podawania i śledzenia pochodnych z ESC w seryjnych komórkach w celu leczenia niedokrwienia kończyn dolnych. Procedurze tej może poprzedzać indukowanie niedokrwienia kończyn dolnych, co zostało zademonstrowane w innym filmie JoVE przez ER et al.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ograniczeniu objętości wstrzykiwanych komórek w PBS do maksymalnie 30 µL, aby zapobiec wyciekowi komórek do tkanki podskórnej. Ponadto podczas pozyskiwania obrazów bioluminescencyjnych należy unikać nasycania intensywności obrazu poprzez zbyt długie czasy ekspozycji. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

embryonic-stem-cell-derived-endothelial-cells-for-treatment-hindlimb

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Komórki Endotelialne Pochodne Komórek Macierzystych Zarodkowych w Leczeniu Niedokrwienia Kończyn Dolnych

Przedstawiono procedurę chirurgiczną indukcji jednostronnego niedokrwienia kończyny tylnej, z potwierdzeniem niedokrwienia za pomocą obrazowania perfuzji metodą laserowego Dopplera.

Mysi model niedokrwienia kończyny dolnej

Opisano metodę zasiewania autologicznymi komórkami biomateriałów tytanowych mających kontakt z krwią oraz testowania ich biokompatybilności. Metoda ta wykorzystuje komórki progenitorowe śródbłonka oraz rurki tytanowe, zasiewane na kilka minut przed chirurgiczną implantacją do żył głównych świni. Technika ta może zostać dostosowana do wielu innych implantowalnych urządzeń biomedycznych.

Technologia zasiewiania autologicznych komórek progenitorowych śródbłonka oraz badanie biokompatybilności urządzeń sercowo-naczyniowych w modelu dużych zwierząt

Komórki endotelialne tworzące kolonie (ECFCs) to krążące komórki endotelialne o silnym potencjale proliferacyjnym klonalnym, które wykazują wrodzone in vivo zdolność do tworzenia naczyń. Fenotypowa i funkcjonalna charakterystyka komórek śródbłonka wyhodowanych z krwi pępowinowej jest istotna dla ich identyfikacji i izolacji bona fide ECFCy do potencjalnych zastosowań klinicznych w naprawie uszkodzonych tkanek.

Charakterystyka fenotypowa i funkcjonalna komórek endotelialnych tworzących kolonie pochodzących z krwi pępowinowej człowieka

Opisujemy metodę programowania komórek macierzystych do nadekspresji czynników terapeutycznych dla angiogenezy za pomocą biodegradowalnych nanocząsteczek polimerowych. Opisane procesy obejmują syntezę polimerów, transfekcję komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej in vitro oraz walidację skuteczności zaprogramowanych komórek macierzystych w promowaniu angiogenezy w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych.

Programowanie komórek macierzystych do angiogenezy terapeutycznej z wykorzystaniem biodegradowalnych nanocząstek polimerowych

Tutaj prezentujemy protokół do generowania przeszczepów naczyń krwionośnych z inżynierii tkankowej, które są funkcjonalne do szczepienia myszom poprzez podwójne wysiewanie częściowo indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (PiPSC) - pochodzących komórek mięśni gładkich i PiPSC - pochodzących komórek śródbłonka na bezkomórkowym bioreaktorze rusztowania naczyń krwionośnych.

Wytwarzanie i przeszczepianie naczyń krwionośnych metodą inżynierii tkankowej w modelu mysim

Prezentujemy trzy nowatorskie i bardziej efektywne protokoły różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych na kardiomiocyty, komórki śródbłonka i komórki mięśni gładkich oraz metodę dostarczania, która poprawia wszczepianie przeszczepionych komórek poprzez połączenie iniekcji komórek z dostarczaniem cytokin za pośrednictwem łatki.

Pluripotencjalne komórki serca pochodzące z komórek macierzystych do naprawy mięśnia sercowego

Celem tego protokołu jest odizolowanie komórek progenitorowych śródbłonka od krwi pępowinowej. Niektóre z zastosowań obejmują wykorzystanie tych komórek jako biomarkera do identyfikacji pacjentów z ryzykiem sercowo-naczyniowym, leczenia chorób niedokrwiennych oraz tworzenia konstruktów naczyń krwionośnych i zastawek serca za pomocą inżynierii tkankowej.

Izolacja śródbłonkowych komórek progenitorowych z ludzkiej krwi pępowinowej

Opisujemy zabieg chirurgiczny stosowany do wywołania niedokrwienia obwodowego u królików z hiperlipidemią i cukrzycą. Operacja ta działa jako model przedkliniczny dla stanów doświadczanych w chorobie tętnic obwodowych u pacjentów. Angiografia jest również opisywana jako sposób pomiaru stopnia wprowadzonego niedokrwienia i odzyskania perfuzji.

Przedkliniczny model niedokrwienia kończyn tylnych u królików z cukrzycą

Tutaj prezentowany jest krytyczny eksperymentalny model niedokrwienia kończyn tylnych, a następnie przeprowadzany jest zestaw testów funkcjonalnych, histologicznych i molekularnych w celu oceny skuteczności terapii angiogennych.

Ocena angiogenezy terapeutycznej w mysim modelu niedokrwienia kończyn tylnych

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Obecny protokół opisuje prospektywne, randomizowane, kontrolowane badanie kliniczne, które ocenia wstrzyknięcie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych do pępowiny w leczeniu przewlekłych owrzodzeń stopy cukrzycowej.

Prospektywne, randomizowane i kontrolowane badanie wstrzyknięcia ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych pępowiny w leczeniu owrzodzeń stopy cukrzycowej

Poznaj metodę wstrzyknięcia embrionalnych komórek śródbłonka pochodzących z komórek macierzystych do niedokrwiennej kończyny tylnej myszy oraz technikę śledzenia komórek za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego in vivo.

Komórki śródbłonka pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych w leczeniu niedokrwienia kończyny dolnej

Przeglądaj więcej filmów