Komórki śródbłonka pochodzące z embrionalnych komórek macierzystych w leczeniu niedokrwienia kończyny dolnej

Obwodowa choroba tętnic. PAD wynika z zwężenia tętnic obwodowych doprowadzających krew i tlen do nóg i stóp, co prowadzi do dysfunkcji naczyniowych. Aby ustalić, czy komórki macierzyste mogą być wykorzystane w leczeniu PAD, wstrzykujemy pochodne komórek śródbłonka z embrionalnych komórek macierzystych do kończyny tylnej po indukcji niedokrwienia.

Ponieważ komórki te zostały zmodyfikowane w celu ekspresji lucyferazy świetlika, można je śledzić za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego, aby ustalić, czy migrują one do miejsca urazu i wywierają efekt terapeutyczny. Cześć, jestem John Cook. Jestem profesorem medycyny w dziale medycyny sercowo-naczyniowej na Uniwersytecie Stanforda.

Nasze laboratorium zajmuje się angiogenezą i regeneracją naczyniową. W tym filmie dwójka moich stażystów podoktorskich, dr Nan Wong i Hir Niyama, przedstawi procedury terapetycznego przeszczepiania komórek w niedokrwieniu kończyny dolnej oraz nieinwazyjne obrazowanie przeżywalności komórek. Procedury te obejmują następujące etapy: podanie embrionalnych komórek macierzystych bezpośrednio i stereotaktycznie w celu leczenia jednostronnego niedokrwienia kończyny dolnej oraz nieinwazyjne śledzenie migracji i przeżywalności komórek za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego.

Zacznijmy zatem. Procedurę należy rozpocząć od przygotowania ośmiomiesięcznej myszy szczepu SV 1 29 z wywołanym niedokrwieniem kończyny tylnej do transplantacji komórek. W tym celu umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia zawierającej od 1 do 3% izofluranu w 100% tlenu przy przepływie 1 L/min.

Pozostaw mysz w komorze indukcyjnej do momentu, aż przestanie reagować na bodźce zewnętrzne. Następnie wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej. Umieść zwierzę na stole operacyjnym w pozycji grzbietnej i podłącz je do ciągłego przepływu 1-3% ISO w 100% tlenu przy szybkości przepływu 1 litr na minutę.

Przetrzyj skórę kończyny tylnej, stosując naprzemiennie trzy razy Betadynę i alkohol. Po oczyszczeniu skóry przygotuj 1 milion komórek śródbłonka pochodzących z mysich embrionalnych komórek macierzystych w 30 µL fosforanu buforowanego solą (PBS). Załaduj te komórki do igły o rozmiarze 28G.

Gdy komórki będą gotowe, delikatnie unieś i wyprostuj tylną kończynę, aby lepiej zwizualizować położenie mięśnia brzuchatego łydki. Przy wyprostowanej nodze wprowadź igłę przez skórę do leżącego pod nią mięśnia. Uważaj, aby nie dotknąć kości i powoli oraz delikatnie wstrzyknij 30 µL mieszaniny komórkowej do mięśnia brzuchatego łydki.

W przypadku wstrzykiwań domięśniowych objętość 30 µL jest bliska granicy objętości, którą można wprowadzić. Dlatego preferowane są strzykawki insulinowe o rozmiarze 28G, ponieważ w naszym doświadczeniu eliminują one utratę objętości w igłach strzykawki. Po zakończeniu wstrzykiwania należy przenieść mysz do klatki rekonwalescencyjnej.

Pozostaw zwierzę do rekonwalescencji przez kilka godzin, a następnie przeprowadź obrazowanie bioluminescencyjne in vivo przeszczepionych komórek. Przeszczepione komórki śródbłonkowe pochodzące z ESC zostały zmodyfikowane tak, aby wykazywały ekspresję zarówno genu lucyferazy świetlika, jak i genów fuzyjnych wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego pod kontrolą wewnętrznego promotora ubikwityny. Dzięki temu bioluminescencja może być wykorzystana do śledzenia komórek w niedokrwionej kończynie tylnej.

Aby rozpocząć ten krok, włącz system obrazowania bioluminescencyjnego oraz oprogramowanie do akwizycji obrazów żywych organizmów. Następnie zainicjuj system akwizycji. Następnie określ wymiary pola widzenia.

Następnie umieść czarny matowy papier na skrzynce obrazującej, aby pochłonąć emisję tła. Po przygotowaniu skrzynki obrazującej umieść mysz w komorze indukcyjnej do znieczulenia zawierającej od 1 do 3% isofluoranu w tlenie przy przepływie jednego litra na minutę. Pozostaw mysz w komorze indukcyjnej do momentu, aż przestanie reagować na bodźce zewnętrzne.

Następnie wyjmij zwierzę z komory indukcyjnej. Wstrzyknij do otrzewnej 10 µL lucyferazy na gram masy ciała. Lucyferaza jest przygotowana wcześniej w formie filtrowanych roztworów treściwych o stężeniu 15 mg/mL w PBS.

Po wstrzyknięciu lucyferazy umieść zwierzę w pozycji grzbietowej w boksie obrazującym na czarnym papierze, podłączając je do ciągłego przepływu izofluranu. Rozpocznij akwizycję obrazów przez 10 do 60 sekund, aby wyznaczyć optymalny czas ekspozycji, przy którym obraz nie będzie nasycony. Jeśli obraz ulegnie nasyceniu, skróć czas ekspozycji.

Jeśli sygnał bioluminescencji jest bardzo słaby, należy zwiększyć czas ekspozycji. Przy zastosowaniu optymalnego czasu ekspozycji należy kontynuować wykonywanie zdjęć co jedną do trzech minut, aż sygnał osiągnie maksimum, a następnie zacznie słabnąć. Po zakończeniu każdej akwizycji należy zapisać plik w celu analizy danych, wybierając obszary zainteresowania (ROI), które obejmują miejsce wstrzyknięcia jako kontrolę negatywną.

Podobny obszar zainteresowania (ROI) można wybrać dla nogi nieoperowanej. Za pomocą oprogramowania zmierz całkowitą radiancję dla tych samych obszarów ROI dla każdego pliku.

W końcowych danych należy wykorzystać wartość maksymalną. Dane można również wyeksportować do arkusza programu Excel do późniejszego wykorzystania. Po zebraniu wszystkich danych należy przenieść zwierzę do klatki rekonwalescencyjnej i monitorować je do momentu przebudzenia; powtórz tę procedurę, aby śledzić komórki.

W odpowiednim punkcie czasowym zwierzę można poddać eutanazji w celu oceny funkcji tkankowej. Przedstawiono tutaj reprezentatywny przebieg czasowy obrazowania bioluminescencyjnego przeszczepionych komórek w lewej niedokrwionej kończynie tylnej w pierwszej dobie po wstrzyknięciu komórek; obszarem zaznaczonym czerwonym okręgiem jest obszar zainteresowania ROI, do którego dostarczono komórki. Kolor koreluje z liczbą przeszczepionych komórek, gdzie kolor czerwony i żółty wskazują silniejszą intensywność bioluminescencji w porównaniu do koloru niebieskiego i zielonego.

Jak widać, kończyna kontrolna nie wykazuje bioluminescencji, podczas gdy kończyna z wstrzykniętymi komórkami wykazuje silną bioluminescencję podczas rejestracji sygnału. Sygnał bioluminescencji w ROI będzie rósł w czasie aż do osiągnięcia wartości maksymalnej, a następnie zmaleje na tym wykresie. Maksymalna wartość bioluminescencji, mierzona jako maksymalna radiancja, zostaje osiągnięta w 27 minucie od rozpoczęcia rejestracji.

W analizie danych należy podać tę wartość maksymalną. Przedstawiliśmy właśnie sposób podawania i śledzenia pochodnych z ESC w seryjnych komórkach w celu leczenia niedokrwienia kończyn dolnych. Procedurze tej może poprzedzać indukowanie niedokrwienia kończyn dolnych, co zostało zademonstrowane w innym filmie JoVE przez ER et al.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ograniczeniu objętości wstrzykiwanych komórek w PBS do maksymalnie 30 µL, aby zapobiec wyciekowi komórek do tkanki podskórnej. Ponadto podczas pozyskiwania obrazów bioluminescencyjnych należy unikać nasycania intensywności obrazu poprzez zbyt długie czasy ekspozycji. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.