Synteza w fazie stałej

0 views09:42 min

1. Ładowanie żywicy

Do 100 ml naczynia do syntezy peptydów dodaj żywicę chlorku 2-chlorotrytylu (CTC) (1,1 mmol/g, 0,360 g, 0,400 mmol). Dodaj 20 ml DMF i pozwól im pęcznieć przez 30 minut pod N_2.
Odcedź kulki w próżni i dodaj 10 ml DMF.
Dodaj 500 mg Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) i 2,5 ml i-Pr₂EtN i mieszaj pod N₂ przez 15 minut.
Odcedź rozpuszczalnik w próżni i powtórz ładowanie Fmoc-Ala-OH przez 15 minut.
Odcedź rozpuszczalnik w próżni i umyj kulki 10 ml DMFunder N₂ i odcedź pod próżnią 3x.

2. Deprotekcja grupy Fmoc

Dodaj 10 ml 20% 4-metylopipryrydyny do DMF i mieszaj kulki pod N₂ przez 15 minut.
Odcedź rozpuszczalnik w próżni i powtórz deochronę.
Umyj kulki 10 ml DMF pod N₂ i odcedź pod próżnią 3x.

3. Wykonywanie testu Kaisera

Wykonaj test Kaisera, dodając 1-2 krople roztworu A (0,5 ml 0,01 M KCN, 24,5 ml pirydyny), roztworu B (1 g ninhydryny, 20 ml n-butanolu) i roztworu C (20 g fenolu, 10 ml n-butanol) do dwóch probówek. Jedna probówka będzie kontrolna, podczas gdy druga będzie monitorować reakcję.
Dodaj kilka kulek żywicy z naczynia reakcyjnego do probówki reakcyjnej i podgrzej dwie probówki do 110 °C.
Jeśli deprotekcja zostanie zakończona, zawartość probówki zmieni kolor na ciemnoniebieski/fioletowy. Jeśli deochrona jest niekompletna lub nie powiodła się, roztwór pozostanie żółty. Porównaj probówkę reakcyjną z probówką kontrolną.

4. Łączenie kolejnych elementów składowych

Odcedzić rozpuszczalnik w próżni.
Umyj kulki 10 ml N-metylo-2-pirolidon pod N₂ i spuść rozpuszczalnik w próżni.
Aby rozpocząć następne sprzężenie, dodaj 10 ml NMP, 620 mg Fmoc-Phe-OH (1,6 mmol), 610 mg HBTU (1,6 mmol) i 2,5 mli-Pr₂EtN i pozwól żywicy bąbelkować pod N₂ przez 30 minut.
Odcedzić rozpuszczalnik w próżni.
Umyj kulki 10 ml DMF pod N₂ i odcedź pod próżnią 3x.
Wykonaj test Kaisera (patrz kroki 3.1-3.3), aby sprawdzić, czy sprzężenie zostało zakończone. Koraliki i roztwór w probówce powinny być żółte.

5. Odcięcie peptydu od żywicy

Rozszczep pozostałą grupę Fmoc wykonując kroki 2.1-2.3.
Po odsączeniu rozpuszczalnika w próżni dodać 40 ml roztworu do rozszczepienia (95% TFA, 2,5% H₂O, 2,5% KOŃCÓWKI) do żywicy i pęcherzykować pod N₂ przez 3 godziny.
Umieścić nową kolbę odbiorczą na syntezatorze peptydów i spuścić roztwór TFA zawierający pożądany peptyd w próżni do nowej kolby.

6. Wytrącanie i I izolacja peptydu

Rozdzielić roztwór TFA na 4 stożkowe fiolki i dodać 25 ml zimnego eteru (−20 °C) do każdej fiolki w celu wytrącenia peptydu.
Odwirować fiolki (3 000 obr./min, 0-4 °C) przez 20 min. Zdekantować pozostały roztwór TFA i eteru ze stożkowych fiolek i zagęścić osad peptydowy, aby uzyskać pożądany dipeptyd w postaci białego ciała stałego.

Overview

Procedure

Loading...

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ładowanie żywicy

Do 100 ml naczynia do syntezy peptydów dodaj żywicę chlorku 2-chlorotrytylu (CTC) (1,1 mmol/g, 0,360 g, 0,400 mmol). Dodaj 20 ml DMF i pozwól im pęcznieć przez 30 minut pod N_2.
Odcedź kulki w próżni i dodaj 10 ml DMF.
Dodaj 500 mg Fmoc-Ala-OH (1,60 mmol) i 2,5 ml i-Pr₂EtN i mieszaj pod N₂ przez 15 minut.
Odcedź rozpuszczalnik w próżni i powtórz ładowanie Fmoc-Ala-OH przez 15 minut.
Odcedź rozpuszczalnik w próżni i umyj kulki 10 ml DMFunder N₂ i odcedź pod próżnią 3x.

2. Deprotekcja grupy Fmoc

Dodaj 10 ml 20% 4-metylopipryrydyny do DMF i mieszaj kulki pod N₂ przez 15 minut.
Odcedź rozpuszczalnik w próżni i powtórz deochronę.
Umyj kulki 10 ml DMF pod N₂ i odcedź pod próżnią 3x.

3. Wykonywanie testu Kaisera

Wykonaj test Kaisera, dodając 1-2 krople roztworu A (0,5 ml 0,01 M KCN, 24,5 ml pirydyny), roztworu B (1 g ninhydryny, 20 ml n-butanolu) i roztworu C (20 g fenolu, 10 ml n-butanol) do dwóch probówek. Jedna probówka będzie kontrolna, podczas gdy druga będzie monitorować reakcję.
Dodaj kilka kulek żywicy z naczynia reakcyjnego do probówki reakcyjnej i podgrzej dwie probówki do 110 °C.
Jeśli deprotekcja zostanie zakończona, zawartość probówki zmieni kolor na ciemnoniebieski/fioletowy. Jeśli deochrona jest niekompletna lub nie powiodła się, roztwór pozostanie żółty. Porównaj probówkę reakcyjną z probówką kontrolną.

4. Łączenie kolejnych elementów składowych

Odcedzić rozpuszczalnik w próżni.
Umyj kulki 10 ml N-metylo-2-pirolidon pod N₂ i spuść rozpuszczalnik w próżni.
Aby rozpocząć następne sprzężenie, dodaj 10 ml NMP, 620 mg Fmoc-Phe-OH (1,6 mmol), 610 mg HBTU (1,6 mmol) i 2,5 mli-Pr₂EtN i pozwól żywicy bąbelkować pod N₂ przez 30 minut.
Odcedzić rozpuszczalnik w próżni.
Umyj kulki 10 ml DMF pod N₂ i odcedź pod próżnią 3x.
Wykonaj test Kaisera (patrz kroki 3.1-3.3), aby sprawdzić, czy sprzężenie zostało zakończone. Koraliki i roztwór w probówce powinny być żółte.

5. Odcięcie peptydu od żywicy

Rozszczep pozostałą grupę Fmoc wykonując kroki 2.1-2.3.
Po odsączeniu rozpuszczalnika w próżni dodać 40 ml roztworu do rozszczepienia (95% TFA, 2,5% H₂O, 2,5% KOŃCÓWKI) do żywicy i pęcherzykować pod N₂ przez 3 godziny.
Umieścić nową kolbę odbiorczą na syntezatorze peptydów i spuścić roztwór TFA zawierający pożądany peptyd w próżni do nowej kolby.

6. Wytrącanie i I izolacja peptydu

Rozdzielić roztwór TFA na 4 stożkowe fiolki i dodać 25 ml zimnego eteru (−20 °C) do każdej fiolki w celu wytrącenia peptydu.
Odwirować fiolki (3 000 obr./min, 0-4 °C) przez 20 min. Zdekantować pozostały roztwór TFA i eteru ze stożkowych fiolek i zagęścić osad peptydowy, aby uzyskać pożądany dipeptyd w postaci białego ciała stałego.

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Transcript

Loading...

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Synteza w fazie stałej to metoda, w której produkt jest syntetyzowany w czasie wiązania z materiałem nierozpuszczalnym.

Synteza w fazie stałej jest często wykorzystywana do produkcji biologicznych oligomerów i polimerów, takich jak peptydy, kwasy nukleinowe i oligosacharydy. Cząsteczki te składają się z łańcuchów mniejszych podjednostek molekularnych, zwanych monomerami. Synteza oligomeru lub polimeru składa się z wielu etapów, ponieważ monomery muszą być dodawane we właściwej kolejności.

Problem z syntezami wieloetapowymi polega na tym, że oczyszczanie i izolowanie stabilnych produktów każdego etapu, zwanych produktami pośrednimi, zmniejsza ogólną wydajność. W syntezie w fazie stałej produkt pośredni pozostaje związany ze stałym nośnikiem przez cały czas syntezy. Pozwala to na wypłukanie odczynników w fazie roztworu, rozpuszczalników i produktów ubocznych, eliminując potrzebę oczyszczania i izolowania każdego produktu pośredniego między etapami.

Ten film zilustruje procedurę syntezy peptydów w fazie stałej i przedstawi kilka zastosowań syntezy w fazie stałej w chemii.

W syntezie w fazie stałej cząsteczka jest syntetyzowana na stałym nośniku w sekwencji reakcji. Na przykład oligomer lub polimer będzie syntetyzowany po jednym monomerze na raz, aby utworzyć produkt końcowy. Rosnący oligomer lub polimer pozostaje silnie związany ze stałym podłożem, dopóki nie zostanie oddzielony lub odcięty od podłoża za pomocą odczynników.

Każdy monomer musi mieć co najmniej dwa miejsca wiązania, aby być częścią łańcucha polimerowego, ale tylko jedno miejsce wiązania może być dostępne na raz, aby zapewnić, że monomer wiąże się z właściwym atomem. Osiąga się to za pomocą grup ochronnych, które są grupami funkcyjnymi, które nie są reaktywne podczas jednego lub więcej etapów syntezy. Miejsce wiązania jest przywracane lub odbezpieczane przez traktowanie cząsteczki specyficznymi odczynnikami w celu przekształcenia grupy ochronnej w reaktywną grupę funkcyjną.

Aby rozpocząć syntezę w fazie stałej, materiał wyjściowy jest wiązany ze specjalnie zaprojektowaną żywicą lub nierozpuszczalnym polimerem w jedynym dostępnym miejscu wiązania. Następnie związany materiał wyjściowy jest odzabezpieczany, aby umożliwić wiązanie drugiego monomeru w łańcuchu. Następnie dodaje się roztwór drugiego monomeru w łańcuchu wraz ze środkiem sprzęgającym, aby ułatwić wiązanie między monomerami.

Gdy drugi monomer zwiąże się z materiałem wyjściowym, otrzymany dimeryczny produkt pośredni jest odbezpieczany. Proces ten powtarza się do momentu uformowania się docelowego oligomeru lub polimeru. Produkt jest odcinany od stałego podłoża do roztworu, z którego można go oczyścić, wyizolować i przeanalizować.

Synteza fazy stałej jest często wykorzystywana do syntezy peptydów, które są łańcuchami aminokwasów. Aminokwasy mają grupę aminową, grupę karboksylową i podstawnik lub "łańcuch boczny". Amina jest początkowo chroniona. Po odbezpieczeniu amina tworzy wiązanie peptydowe z grupą karboksylową następnego aminokwasu.

Teraz, gdy rozumiesz zasady syntezy w fazie stałej, przejdźmy przez procedurę syntezy peptydów w fazie stałej, w której zademonstrujemy dodanie pierwszych dwóch aminokwasów.

Aby rozpocząć procedurę, należy podłączyć kolbę odbiorczą odpadów do ręcznego naczynia do syntezy peptydów o pojemności 100 ml. Następnie umieść 0,360 g żywicy chlorku 2-chlorotrytylu w naczyniu. Podłącz przewód azotu gazowego do bocznego ramienia naczynia, a przewód podciśnieniowy do ząbkowanego adaptera węża.

Dodać 20 ml dimetyloformamidu do żywicy i pozostawić kulki żywicy pęczniejące przez 30 minut pod wpływem gazowego azotu. Następnie zastosuj próżnię, aby spuścić rozpuszczalnik.

Dodać do naczynia 10 ml DMF, 1,6 mmol aminokwasu chronionego przez Fmoc i 2,5 ml N,N-diizopropyloetyloaminy. Bąbelkować pod gazowym azotem, który miesza roztwór, przez 15 minut, aby załadować chroniony aminokwas na żywicę.

Usuń rozpuszczalnik w próżni i wykonaj drugie ładowanie. Po usunięciu rozpuszczalnika należy trzykrotnie wymieszać załadowane kulki żywicy w porcjach DMF o pojemności 10 ml, odsączając każde płukanie do kolby odbiorczej.

Następnie dodaj do załadowanych kulek 10 ml 20% roztworu 4-metylopipryrydyny w DMF. Bulgotaj mieszaninę przez 15 minut, aby usunąć grupę Fmoc.

Odcedź rozpuszczalnik i powtórz procedurę deprotekcji. Umyj i osusz załadowaną żywicę trzy razy, tak jak poprzednio. Przechowuj kulki pod rozpuszczalnikiem, aż będą gotowe do następnego kroku.

Aby sprawdzić, czy załadowany związek został całkowicie pozbawiony ochrony, najpierw umieść 1 do 2 kropli każdego roztworu testowego Kaisera w dwóch probówkach.

Umieść kilka załadowanych koralików w probówce i podgrzej obie probówki do 110 stopni w kąpieli olejowej. Deprotekcja jest zakończona, jeśli mieszanina żywicy zmieni kolor na ciemnoniebieski do fioletowego, co wskazuje na obecność grup aminowych w mieszaninie.

Aby rozpocząć etap sprzęgania, najpierw umyj kulki 10 ml NMP pod strumieniem gazu N2.

Następnie dodaj 10 ml NMP, 1,6 mmol następnego aminokwasu chronionego przez Fmoc, 1,6 mmol środka sprzęgającego HBTU i 2,5 ml DIPEA do załadowanej żywicy.

Pęcherzyk gazu N2 przez mieszaninę żywicy przez 30 minut, a następnie spuścić rozpuszczalnik. Umyj i osusz koraliki trzema porcjami DMF po 10 ml, tak jak poprzednio.

Powtórz test Kaisera. Sprzężenie nastąpiło pomyślnie, jeśli kulki i roztwór zmienią kolor na żółty, co oznacza, że nie ma grup aminowych.

Następnie rozdrobnij nową grupę Fmoc z 20% 4-metylopipryrydyną w DMF i umyj kulki 10-mililitrowymi porcjami DMF. Powtórz sprzęganie i deprotekcję dla każdego pozostałego aminokwasu w peptydzie docelowym.

Po odzabezpieczeniu ostatniego aminokwasu i umyciu kulek żywicy, dodaj 40 ml roztworu rozszczepiającego peptydy, aby oddzielić produkt peptydowy od żywicy.

Pęcherzyk azotu gazowego przez mieszaninę żywicy przez 3 godziny, a następnie wymienić kolbę odbiorczą. Przenieść roztwór z mieszaniny żywicy do nowej kolby odbiorczej w próżni.

Aby wytworzyć produkt końcowy, należy usunąć rozpuszczalnik za pomocą wyparki obrotowej.

Synteza fazy stałej jest szeroko stosowana w biologii i chemii. Spójrzmy na kilka przykładów.

Synteza w fazie stałej otworzyła wiele nowych szlaków syntezy oligosacharydów, które są krótkimi łańcuchami monomerów cukrów prostych pełniących ważne role biologiczne, takie jak magazynowanie energii. W przeciwieństwie do wiązań peptydowych, każde wiązanie między cukrami zawiera stereocentrum. Aby zsyntetyzować oligosacharyd, nie tylko monomery muszą być we właściwej kolejności, ale wiązania muszą również mieć prawidłową stereochemię. Opracowano techniki syntezy w fazie stałej, aby sprzęgnąć każdy monomer w wysoce stereoselektywnym procesie, który obecnie jest wystarczająco wyrafinowany, aby można go było zautomatyzować.

Synteza w fazie stałej jest powszechnym podejściem do chemii kombinatorycznej, która jest praktyką syntezy wielu wariantów związku w jednym procesie syntezy. Załadowaną żywicę można łatwo podzielić na porcje, aby reagować z różnymi monomerami lub cząsteczkami. Po każdej reakcji porcje są myte i ponownie łączone. Czynność ta jest powtarzana do momentu wygenerowania żądanej liczby produktów. Technika ta jest szczególnie przydatna w badaniach farmaceutycznych, ponieważ może być wykorzystywana do generowania nowych związków lub do oceny reaktywności związku o szerokiej gamie cząsteczek.

Właśnie obejrzałeś wprowadzenie JoVE do syntezy w fazie stałej. Powinieneś teraz zrozumieć podstawowe zasady syntezy w fazie stałej, procedurę syntezy peptydów w fazie stałej oraz kilka przykładów zastosowania syntezy w fazie stałej w chemii organicznej. Dzięki za oglądanie!

Learning Objectives

Questions that this video will help you answer

Explore More Videos

Solid Phase Synthesis

Peptide Synthesis

Protecting Groups

Combinatorial Chemistry