Name: Wykrywanie i izolacja żywotnych mysich limfocytów T wydzielających IL-17 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-18T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Poznaj metodę izolacji żywotnych mysich limfocytów T wydzielających IL-17 przy użyciu technologii cytokinowej analizy wydzielania. Protokół umożliwia dokładne wykrywanie komórek TH17 na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przygotowanie odczynników
<ol>
<li>Przygotować bufor zawierający PBS z BSA (0,5%) oraz 2 mM EDTA. Ponieważ pęcherzyki powietrza mogą blokować kolumny separacyjne MACS, bufor musi zostać odgazowany i przechowywany w temperaturze 2-8°C przed użyciem.</li>
<li>Stosujemy pożywkę RPMI 1640 zawierającą 5% surowicy mysiej. Pożywka hodowlana nie powinna zawierać BSA ani FCS, ponieważ związki te zmieniają specyficzność stymulacji komórek.</li>
<li>Zestaw do wzbogacania komórek i detekcji wydzielania IL-17 u myszy (Mouse IL-17 Secretion Assay - Cell Enrichment and Detection Kit) firmy Miltenyi-Biotec. Zestaw zawiera następujące komponenty: odczyn wychwytujący IL-17 (IL-17 Catch Reagent), przeciwciało detekcyjne IL-17 (biotynylowane), Anti-Biotin-PE oraz mikrokuleczki Anti-PE.</li>
</ol>
Stymulowanie splenocytów
<ol>
<li>Protokół ten wykonuje się w obecności kontroli negatywnej i pozytywnej, takich jak nieymulowane splenocyty oraz barwienie kontrastowe dla limfocytów T. Procedurę przeprowadzono z zachowaniem zasad aseptyki.</li>
<li>Przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek ze splenocytów mysich wyizolowanych za pomocą urządzenia gentleMACS™ Dissociator. Stężenie komórek powinno zostać wcześniej określone poprzez zliczenie komórek. Odwiruj komórki przy 200×g przez 10 minut w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Po odwirowaniu odessać supernatant znad osadu za pomocą pipety. Nie wysypywać zawartości probówki, aby uniknąć utraty osadu.</li>
<li>Następnie resuspenduj komórki w medium hodowlanym, a potem przenieś je do studzienki. Dodaj odpowiednią ilość medium, aby uzyskać stężenie dziesięciu milionów komórek na mL i pięć milionów komórek na cm².</li>
<li>Aby stymulować odpowiedź immunologiczną w resuspendowanych komórkach, do próbki dodajemy ionomycin (1 μg/mL) i PMA (10 ng/mL), a następnie mieszamy roztwór, delikatnie pipetując w górę i w dół. Następnie studzienki są odpowiednio opisane.</li>
<li>Teraz inkubujemy komórki przez 3 godziny w temperaturze 37 °C bez mieszania, aby rozpocząć okres stymulacji. Przejdź do analizy IL-17 3 godziny od rozpoczęcia stymulacji, planując czas odpowiednio.</li>
<li>Aby zatrzymać sekrecję, komórki umieszcza się na lodzie, a następnie zbiera stymulowane komórki, delikatnie pipetując w górę i w dół z użyciem zimnego buforu. Komórki są następnie przenoszone ze studzienki do probówki i płukane po raz drugi.</li>
<li>Aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane, warto sprawdzić naczynie pod mikroskopem. Jeśli niektóre komórki nadal pozostają przytwierdzone, można je zebrać, płucząc naczynie zimnym buforem. Wszelkie skupiska komórek w zawiesinie można usunąć za pomocą filtrów do wstępnej separacji.</li>
</ol>
Znakowanie komórek odczynnikiem wychwytującym
<ol>
<li>Należy przede wszystkim zauważyć, że ten test działa optymalnie, gdy obecność komórek wydzielających IL-17 wynosi mniej niż 2%.</li>
<li>Jeśli przewiduje się, że stężenie komórek wydzielających IL-17 będzie większe niż 2%, należy odpowiednio dostosować objętości. <img src="/files/ftp_upload/old/1037_2008_12_8_6/figure8.png" alt="Tabela wydzielania IL-17; objętości reagentów komórkowych dla analizy częstotliwości cytokin." width="500" height="162" data-altupdatedat="1761735611000" data-alt="rycina 8">
</li>
<li>Potencjalną pułapką w tej procedurze jest kontaminacja krzyżowa odczynnika Catch Reagent, która może wystąpić podczas znakowania, gdy przeciwciało bispecyficzne zwiąże się z niewydzielającą limfocytem T i uwięzi IL-17 wydzielone przez sąsiedni limfocyt, generując w ten sposób wyniki fałszywie dodatnie.</li>
<li>Aby uniknąć tego problemu, krytyczne jest schłodzenie komórek przed znakowaniem oraz praca z zimnym buforem, aby spowolnić dyfuzję IL-17 i zapobiec tej kontaminacji krzyżowej. Oprócz utrzymywania komórek w niskiej temperaturze, muszą one być utrzymywane w określonym stężeniu.</li>
<li>Aby rozpocząć procedurę znakowania, używamy dziesięciu milionów komórek w probówce zamykanej o pojemności 15 ml. Jeśli konieczne jest użycie większej liczby komórek, należy po prostu odpowiednio zwiększyć wszystkie objętości. Po uzyskaniu optymalnego stężenia komórek, należy je przemyć, dodając 10 ml zimnego buforu.</li>
<li>Wirować komórki przy 300×g przez 10 minut w wirówce chłodzącej (2–8 °C).</li>
<li>Po odwirowaniu całkowicie odessać supernatant za pomocą pipety. Nie należy zlewać supernatantu, ponieważ doprowadzi to do utraty komórek i niedokładności objętości. Powtórzyć etap płukania, który polega na dodaniu 10 ml zimnego buforu, wirowaniu i odessaniu.</li>
<li>Po uzyskaniu osadu o pożądanej czystości, zawiesić komórki w 80 μL zimnej pożywki hodowlanej. W celu ich oznakowania dodajemy teraz 20 μL Mouse IL-17 Catch Reagent.</li>
<li>Inkubować komórki przez 5 minut na lodzie.</li>
<li>Po 5-minutowym okresie inkubacji na lodzie, wyjąć probówkę i rozcieńczyć komórki w 10 ml podgrzanej do 37°C pożywki. Następnie umieścić probówkę w rotatorze MACSmix Tube Rotator i inkubować w temperaturze 37°C przez 45 min przy ciągłym ruchu. Podniesienie temperatury do 37°C wznowi wydzielanie cytokin.</li>
</ol>
Znakowanie komórek przeciwciałem do wykrywania IL-17 (biotynowanym) oraz przeciwciałem antybiotyna-PE
<ol>
<li>Po 45-minutowym okresie sekrecji w temperaturze 37°C natychmiast umieść probówkę na lodzie. Przerwie to sekrecję cytokin. Od tego momentu krytyczne jest utrzymywanie komórek na lodzie. Praca z zimnym buforem zapobiegnie zanieczyszczeniu krzyżowemu odczynnika Catch Reagent.</li>
<li>Napełnij probówkę zimnym buforem i wiruj przy 300xg w temperaturze 2–8 °C przez 10 min. Całkowicie odessij supernatant. Powtórz etap płukania jeszcze raz.</li>
<li>Osad komórkowy resuspenduj w 80 μL zimnego buforu i umieść probówkę na lodzie.</li>
<li>Aby uniknąć niespecyficznego wiązania przeciwciał, zalecamy dodanie 10µl FcR Blocking Reagent i inkubację na lodzie przez 5 min. Następnie dodajemy 20 μL przeciwciała wykrywającego Mouse IL-17 Detection Antibody (Biotin), które jest koniugowane z biotyną, i inkubujemy przez 10 minut na lodzie.</li>
<li>Ponownie opłucz komórki w sposób opisany wcześniej, dodając 10 mL zimnego buforu i wirując przy 300xg w temperaturze 2–8 °C przez 10 min.</li>
<li>Teraz odessij supernatant i resuspenduj osad komórkowy w 80 µl zimnego buforu.</li>
<li>Dodaj 20 μL naszego przeciwciała wtórnego, Anti-Biotin-PE.</li>
<li>Wymieszaj komórki z roztworem przeciwciała wtórnego i ponownie inkubuj probówkę przez 10 minut na lodzie.</li>
<li>Po zakończeniu tej drugiej inkubacji opłucz komórki 10 mL zimnego buforu i odwiruj.</li>
<li>Osad można teraz resuspender w 500 μL zimnego buforu.</li>
<li>Jeśli komórki muszą zostać wyizolowane do dalszych analiz, można je znakować magnetycznie za pomocą Anti-PE-MicroBeads i separować ręcznie lub automatycznie przy użyciu kolumn MACS oraz separatorów MACS.</li>
<li>Znakowanie splenocytów zostało zakończone i próbki są gotowe do analizy.</li>
</ol>
Analiza FACS
<ol>
<li>W ramach analizy porównamy stymulowane i nestymulowane splenocyty za pomocą cytometrii przepływowej.</li>
<li>Przed analizą cytometryczną komórki barwi się jodkiem propidyny w stężeniu 0,5 μg/mL w celu wykluczenia martwych komórek. Do analizatora MACSQuant™ wprowadzono 200 000 komórek dla każdej próbki; teraz przeanalizujemy wykresy rozrzutu względnej reaktywności przeciwciał w próbkach. Dwie istotne kwestie przy analizie rzadkich komórek – takich jak komórki pozytywne dla IL-17 – za pomocą cytometrii przepływowej to: 
<ul>
<li>ustawienie bramki dla limfocytów na wykresie rozrzutu światła przedniego (forward scatter) względem światła bocznego (side scatter)</li>
<li>oraz wykluczenie martwych komórek (zbarwionych jodkiem propidyny) i limfocytów B (które mogą powodować nieswoiste barwienie tła), aby zwiększyć czułość detekcji</li>
</ul>
</li>
<li>Do wykrywania limfocytów T zastosowano przeciwciało CD4-APC, a do wykrywania limfocytów B przeciwciało CD45R/B220-PerCP. Analizujemy właściwości rozproszenia światła przedniego i bocznego próbek i nakładamy bramkę na populację limfocytów.</li>
<li>Zastosowano drugą bramkę, aby zidentyfikować zbarwione martwe komórki oraz zbarwione limfocyty B (oś Y). Komórki te są wykluczane z analizy limfocytów T.</li>
<li>W tym przykładzie, który stanowi w istocie naszą kontrolę negatywną, widać, że w próbkach niestymulowanych znajduje się bardzo mało wydzielających IL-17 limfocytów T pozytywnych dla CD4 – około 0,003% (Rycina 4). Analizując populację stymulowanych limfocytów T, obserwujemy znaczną liczbę limfocytów T pozytywnych dla CD4 wydzielających IL-17 – około 0,367% (Rycina 5A) przed separacją oraz 60,76% po separacji magnetycznej z wykorzystaniem technologii MACS (Rycina 5B).</li>
</ol>

Wszystkie protokoły i arkusze danych są dostępne na stronie www.miltenyibiotec.com.

Ostrzeżenia 
Odczynniki zawierają azotek sodu. W warunkach kwasowych azotek sodu tworzy kwas azotawodorykowy, który jest niezwykle toksyczny. Związki azotkowe należy rozcieńczyć bieżącą wodą przed zutylizowaniem. Środki ostrożności te są zalecane, aby uniknąć osadów w instalacji hydraulicznej, w której mogą powstać warunki sprzyjające eksplozji.

Komórki TH17 odgrywają istotną rolę w odporności adaptacyjnej i odpowiedzi zapalnej, stanowiąc kluczowy element napędzający zapalenie autoimmunizacyjne.
Niniejszy film dokumentuje sposób użycia zestawu Miltenyi Mouse IL-17 Secretion Assay – Cell Enrichment and Detection Kit (PE). Podczas wykonywania tej procedury ważne jest oszacowanie częstotliwości występowania komórek wydzielających IL-17 w początkowej preparacji komórkowej. Odpowiednie stężenie komórek podczas etapu znakowania oraz okresu wydzielania cytokin zapobiega kontaminacji krzyżowej przez inne komórki w zawiesinie i zapewnia wiarygodne wyniki.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do wzbogacania i detekcji komórek w teście wydzielania IL-17 u myszy (PE)</td><td>Odczynnik</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-213</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_98_1005_Mouse_IL_17_Secretion_Assay_Cell_Enrichment_and_Detection_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Pożywka</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-440</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_243_293_RPMI_1640.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Odczynnik</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-611</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_327_CD4.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>CD8a-FITC</td><td>Odczynnik</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-605</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_599_328_CD8a.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Roztwór jodku propidyny</td><td>Odczynnik</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-233</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_337_744_Propidium_Iodide_Solution.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący FcR, mysi</td><td>Odczynnik</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-575</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_601_435_FcR_Blocking_Reagent_mouse_.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Zestaw do usuwania martwych komórek</td><td>Odczynnik</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Mieszalnik do probówek MACSmix</td><td>Urządzenie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_34_251_MACSmix_Tube_Rotator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Dysocjator gentleMACS&amp;#8482;</td><td>Urządzenie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_709_763_gentleMACS_Dissociator.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Zestaw startowy autoMACS Pro</td><td>Urządzenie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/PG_651_679_autoMACS_Pro_Starting_Kit.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Kolumny MACS</td><td>Narzędzie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td>&lt;a href=&quot;http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx">http://www.miltenyibiotec.com/en/NN_115_Columns_at_a_glance.aspx&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Separator MACS</td><td>Narzędzie</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wykrywanie i izolacja żywych limfocytów t wydzielających il-17 u myszy

Detection and Isolation of Viable Mouse IL-17-Secreting T Cells

Technologia MACS Cytokine Secretion Assay umożliwia wykrywanie wydzielanych cytokin na poziomie pojedynczych komórek oraz czułą izolację żywych komórek wydzielających cytokiny. W celu znakowania komórek wydzielających IL-17 przygotowuje się zawiesinę pojedynczych komórek splenocytów mysich, które następnie stymuluje się w temperaturze 37°C za pomocą PMA/ionomycyny w celu indukcji sekrecji cytokin. Aby zatrzymać sekrecję, komórki umieszcza się na lodzie i poddaje działaniu odczynnika IL-17 Catch Reagent – przeciwciała bispecyficznego, które wiąże się z CD45 na powierzchni komórek leukocytów oraz z IL-17 w momencie jej wydzielania, wychwytując ją w pobliżu powierzchni komórki. Następnie sekrecję ponownie uruchamia się poprzez zwiększenie temperatury do 37°C, a IL-17 jest wychwytywana przez Catch Reagent. Kolejnie sekrecję ponownie zatrzymuje się, umieszczając komórki na lodzie. Aby wykryć wychwycone IL-17, komórki inkubuje się z drugim przeciwciałem specyficznym dla IL-17 sprzężonym z biotyną oraz przeciwciałem Anti-Biotin-PE. Komórki mogą teraz zostać poddane bezpośredniej analizie metodą cytometrii przepływowej lub przygotowane do izolacji i wzbogacenia poprzez późniejsze znakowanie MicroBeads sprzężonymi z Anti-PE.

Niniejsza procedura opisuje detekcję i izolację leukocytów TH17 myszy, które po stymulacji aktywnie wydzielają IL-17.

Wykrywanie i izolacja żywych limfocytów T wydzielających IL-17 u myszy

Technologia MACS Cytokine Secretion Assay umożliwia wykrywanie wydzielanych cytokin na poziomie pojedynczych komórek oraz czułą izolację żywych ...

Technologia analizy wydzielania cytokin max pozwala na detekcję wydzielanych cytokin na poziomie pojedynczych komórek oraz czułą izolację żywych komórek wydzielających cytokiny w celu znakowania komórek wydzielających IL 17. Przygotowuje się zawiesinę pojedynczych komórek leukocytów mysich, a następnie stymuluje je w temperaturze 37 °C przy użyciu PMA i ionomycyny, aby indukowanie wydzielania cytokin, a następnie zatrzymuje ten proces. Komórki są następnie przenoszone na lód, gdzie poddaje się je działaniu odczynnika wychwytującego IL 17.Po ponownym zainicjowaniu sekrecji poprzez zwiększenie temperatury do 37 °C, IL 17 zostaje przechwycona przez odczyn chwytający. Przeciwciało bispecyficzne, które wiąże się z CD 45 na powierzchni komórek leukocytów oraz z IL 17 w momencie jej sekrecji i wychwycenia w pobliżu powierzchni komórki, zatrzymuje proces sekrecji ponownie po umieszczeniu komórek w lodzie w celu wykrycia przechwyconego IL 17. Komórki inkubuje się z drugim przeciwciałem specyficznym dla IL 17 sprzężonym z biotyną oraz z przeciwciałem antybiotynowym sprzężonym z PE. Komórki mogą teraz zostać poddane bezpośredniej analizie za pomocą cytometrii przepływowej lub przygotowane do izolacji i wzbogacenia poprzez następujące znakowanie mikrokulkami sprzężonymi z anty-PE. Cześć, nazywam się Ellie Rankin i jestem jedną z naukowców w Miltenyi Biotec.Dzisiaj zaprezentuję procedurę izolacji i detekcji leukocytów Th17, które po stymulacji wydzielają IL-17. IL-17 odgrywa istotną rolę w odporności adaptacyjnej i odpowiedzi zapalnej, a także ma duże znaczenie w indukowaniu zapaleń autoimmunologicznych. Przedstawię teraz sposób wykonania tego testu. Do dzisiejszego protokołu musimy najpierw przygotować bufor zawierający PBS z BSA i 2 mM EDTA. Ponieważ pęcherzyki powietrza mogą blokować kolumny separacyjne Max, bufor musi zostać odgazowany i przechowywany w temperaturze od 2 do 8 °C przed użyciem.Po drugie, stosujemy pożywkę RPMI 1640 zawierającą 5% surowicy mysiej. Pożywka hodowlana nie powinna zawierać BSA ani FCS, ponieważ związki te zmieniają specyficzność stymulacji komórek. Na koniec będą Państwo potrzebować zestawu do wzbogacania komórek i wykrywania sekrecji IL 17 u myszy firmy MIL 10 E Biotech.Zestaw zawiera następujące komponenty: odczyn wychwytujący IL 17, przeciwciało detekcyjne IL 17, biotynę, przeciwciało przeciwbiotynowe sprzężone z PE oraz mikrokulki przeciw-PE. Logicznie rzecz biorąc, protokół ten zostanie prawdopodobnie przeprowadzony z wykorzystaniem kontroli negatywnej i pozytywnej, takich jak niestymulowane limfocyty T oraz przeciwbarwienie dla komórek T. W naszej demonstracji skupimy się wyłącznie na komórkach stymulowanych.Protokół ten zostanie przeprowadzony z zachowaniem technik sterylnych. Nasz protokół rozpoczyna się od zawiesiny pojedynczych komórek cytocytów śledziony myszy wyizolowanych przy użyciu urządzenia GentleMax Associator. Stężenie komórek powinno być wcześniej określone poprzez liczenie komórek.Odwiruj komórki przy 200 Gs przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po wirowaniu odessaj znad osadu supernatant za pomocą pipety. Nie przelewaj zawartości probówki, aby uniknąć utraty osadu. Następnie komórki należy resuspender w pożywce hodowlanej, a potem dodać je do dołka, dodając odpowiednią ilość pożywki tak, aby uzyskać stężenie 10 milionów komórek na mililitr oraz 5 milionów komórek na centymetr kwadratowy.Aby pobudzić odpowiedź immunologiczną w resuspenderowanych komórkach, dodajemy do próbki jonomycynę i PMA, a następnie mieszamy roztwór, delikatnie pipetując go w górę i w dół. Następnie odpowiednio oznakowujemy dołki. Teraz inkubujemy próbki przez trzy godziny w temperaturze 37 °C bez mieszania, aby rozpocząć okres stymulacji.Przejdź do analizy IL 17 trzy godziny po rozpoczęciu stymulacji, dlatego zaplanuj pracę odpowiednio. Tutaj widzimy stymulowane komórki śledziony myszy.Należy zwrócić uwagę na odmienną morfologię i grupowanie się komórek stymulowanych. Dla przejrzystości będziemy śledzić wyłącznie komórki stymulowane. W celu zatrzymania sekrecji zbieramy teraz komórki stymulowane, delikatnie pipetując je w górę i w dół.Następnie komórki przenosi się z dołka do probówki za pomocą zimnego buforu i płucze po raz drugi. Aby upewnić się, że wszystkie komórki zostały zebrane, warto sprawdzić naczynie pod mikroskopem. Jeśli niektóre komórki nadal pozostają przytwierdzone, można je zebrać, płucząc naczynie.Używając zimnego buforu, wszelkie skupiska komórek w zawiesinie komórkowej można usunąć za pomocą filtrów wstępnych. Potencjalną pułapką tej procedury jest kontaminacja krzyżowa odczynnika wychwytującego, która może wystąpić podczas znakowania. Ma ona miejsce, gdy przeciwciało bispecyficzne wiąże się z nie-sekrecyjną komórką T i wychwytuje IL 17 wydzielaną przez sąsiedni limfocyt, generując tym samym wyniki fałszywie dodatnie. Aby uniknąć tego problemu, kluczowe jest schłodzenie komórek przed znakowaniem oraz praca z zimnym buforem, co ogranicza sekrecję i spowalnia dyfuzję IL 17, zapobiegając tym samym kontaminacji krzyżowej.Należy pamiętać, że do kontaminacji krzyżowej może dojść również w przypadku, gdy obecność komórek wydzielających IL 17 przekracza 2%. Jeśli przewidywana koncentracja komórek wydzielających IL 17 będzie wyższa niż 2%, należy odpowiednio dostosować objętości. W związku z tym, oprócz utrzymywania komórek w niskiej temperaturze, muszą być one przechowywane w określonej koncentracji.Aby rozpocząć procedurę znakowania, należy użyć 10 milionów komórek w 15 mililitrowej probówce z zakrętką. W przypadku konieczności użycia większej liczby komórek, należy odpowiednio proporcjonalnie zwiększyć wszystkie objętości. Po uzyskaniu optymalnej koncentracji komórek, należy je wypłukać, dodając 10 mililitrów zimnego buforu.Następnie odwirować komórki przy 300 Gs przez 10 minut w wirówce chłodzącej; po wirowaniu całkowicie odessać nadosad pamiętając o użyciu pipety. Nie należy zlewać nadosadu, ponieważ doprowadzi to do utraty komórek i nieprecyzyjnych objętości. Powtórzyć etap płukania, który polega na dodaniu 10 ml zimnego buforu, wirowaniu i odessaniu.Po uzyskaniu osadu o pożądanej czystości, resuspenduj komórki w odpowiedniej ilości mikrolitrów zimnej pożywki hodowlanej w celu ich oznakowania. Następnie dodaj 20 µL odczynnika wychwytującego mouse IL 17. Inkubuj komórki przez pięć minut na lodzie.Po pięciominutowej inkubacji na lodzie wyjąć probówkę i rozcieńczyć komórki w 10 mililitrach podgrzanego do 37 °C medium. Następnie umieścić probówkę w rotatorze Max Mix i inkubować w temperaturze 37 °C przez 45 minut.Przy ciągłym mieszaniu należy zwiększyć temperaturę do 37 °C, aby wznowić sekrecję cytokin. Po 45-minutowym okresie sekrecji w temperaturze 37 °C probtkę należy natychmiast umieścić na lodzie. Spowoduje to zatrzymanie sekrecji cytokin.Od tego momentu kluczowe jest utrzymywanie komórek w lodzie. Praca z zimnym buforem zapobiegnie kontaminacji krzyżowej odczynnika wychwytującego. Napełnić probówkę zimnym buforem i odwirować przy 300 Gs w temperaturze od 2 do 8 °C przez 10 minut.Całkowicie odessaj supernatant. Powtórz etap płukania jeszcze raz. Osad komórkowy resuspenduj w 80 µL zimnego buforu, a następnie umieść probówkę na lodzie.Aby uniknąć niespecyficznego wiązania przeciwciał, zalecamy dodanie 10 µL odczynnika blokującego FCR i inkubację w lodzie przez pięć minut. Następnie dodajemy 20 µL biotynilowanego przeciwciała detekcyjnego przeciwko mysiej IL 17 i inkubujemy przez 10 minut w lodzie. Ponownie przemywamy komórki w sposób opisany wcześniej, dodając 10 ml zimnego buforu i wirując przy 300 Gs w temperaturze od 2 do 8 °C przez 10 minut.Następnie odessaj nadmiar cieczy i resuspender osad komórkowy w 80 µL zimnego buforu, a następnie dodaj 20 µL przeciwciała wtórnego Anti biotin pe. Wymieszaj komórki z roztworem przeciwciała wtórnego i ponownie inkubuj probówkę przez 10 minut w lodzie.Po zakończeniu drugiej inkubacji komórki należy przemyć 10 mililitrami zimnego buforu i odwirować. Osad można teraz resuspender w 500 mikrolitrach zimnego buforu. Jeśli komórki muszą zostać rozdzielone do dalszych analiz, można je znakować magnetycznie za pomocą mikrokulek anty-PE i rozdzielać ręcznie lub automatycznie, wykorzystując kolumny Max Column oraz separatory Max Separator.Zakończyliśmy znakowanie naszych cytocytów SPLU i jesteśmy gotowi do przeprowadzenia analizy. Przed rozpoczęciem pomiarów porównamy stymulowane i niestymulowane cyty SP za pomocą cytometrii przepływowej. Komórki barwi się jodkiem propidyum w stężeniu 0,5 µg/mL w celu wykluczenia martwych komórek.Do cytometru przepływowego wprowadzono 200 000 komórek dla każdej próbki; teraz przeanalizujemy wykresy rozrzutu względnej reaktywności przeciwciał w próbkach. Dwiema istotnymi kwestiami przy analizie rzadkich komórek, takich jak komórki dodatnie pod kątem IL 17, metodą cytometrii przepływowej są: ustawienie bramki dla limfocytów na wykresie rozrzutu przedniego względem bocznego oraz wykluczenie za pomocą bramkowania martwych komórek barwionych jodkiem propidium oraz limfocytów B, które mogą powodować nieswoiste barwienie tła. W celu dalszego zwiększenia czułości detekcji.W tym przypadku wykorzystujemy przeciwciało anty-CD4 APC do detekcji limfocytów T oraz przeciwciało anty-CD45RB2.20 PE do detekcji limfocytów B. Analizujemy właściwości rozproszenia światła w przód (forward scatter) i z boku (side scatter) próbek, a następnie nakładamy bramkę na populację limfocytów. Drugą bramkę zastosowano w celu rozróżnienia barwionych martwych komórek od barwionych limfocytów B na osi Y.Komórki te są wykluczone z analizy limfocytów T. W tym przykładzie, który stanowi w istocie naszą kontrolę negatywną, widać, że w próbkach niepobudzonych znajduje się bardzo mało limfocytów T CD4+ wydzielających IL 17, około 0,003%. Analizując populację pobudzonych limfocytów T, możemy zauważyć znaczną liczbę limfocytów T CD4+ wydzielających IL 17 – około 0,367% przed separacją i 60,76% po separacji magnetycznej z wykorzystaniem technologii Mag Tecnología. Przedstawiliśmy właśnie w dokumentacji wideo, jak używać zestawu do wzbogacania komórek i detekcji z wykorzystaniem PE w teście wydzielania IL 17 u myszy firmy Mul 10 Biotech.Najważniejszym elementem tej procedury jest określenie częstotliwości występowania komórek wydzielających IL 17 w populacji wyjściowej. Odpowiednie stężenie komórek zapewni mniejszą kontaminację krzyżową podczas znakowania i okresu wydzielania cytokin, co zagwarantuje wiarygodność wyników. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

detection-and-isolation-of-viable-mouse-il-17-secreting-t-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykrywanie i izolowanie żywych komórek T mysich wydzielających IL-17

Ten film ilustruje metodę izolowania niezmiennych limfocytów T NK, znanych również jako komórki iNKT. Zabieg rozpoczyna się od wstrzyknięcia syntetycznego glikolipidu myszowi w celu stymulacji aktywacji i proliferacji komórek iNKT w śledzionie. Następnie przygotowuje się zawiesiny jednokomórkowe ze śledziony i inkubuje z kompleksami rozpoznającymi komórki iNKT znakowanymi fluoroforami, a następnie rozdziela się za pomocą kulek magnetycznych w celu wyizolowania komórek iNKT.

Izolowanie niezmiennych limfocytów T NK z modelu mysiego

Z funkcjami efektorowymi odmiennymi od innych podzbiorów limfocytów T, komórki Th17 są centralnie zaangażowane w autoimmunizację zapalną. Ten protokół różnicowania Th17 in vitro zapewnia środki do określenia, czy naiwne limfocyty T CD4 + mogą różnicować się w komórki Th17 i dalszego badania ich roli w autoimmunizacji i odpowiedzi gospodarza.

Izolacja i różnicowanie Th17 naiwnych limfocytów T CD4

Analiza in vitro rekombinacji przełączników klas u myszy jest trudna ze względu na cytofilne cząsteczki IgE związane z receptorami Fc na powierzchni komórek B.  Opisujemy metodę wykrywania IgE za pomocą rozszczepienia IgE związanego powierzchniowo za pośrednictwem trypsyny przed utrwaleniem i przepuszczalnością w celu barwienia fluorescencji cytoplazmatycznej.

Wykrywanie prawdziwych mysich komórek linii B z ekspresją IgE

Naiwne limfocyty T CD4+ polaryzują się na różne podzbiory w zależności od środowiska w momencie aktywacji.  Różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4 + do różnych podzbiorów efektorowych można osiągnąć in vitro poprzez dodanie bodźców receptora limfocytów T i specyficznych sygnałów cytokin.

Naiwna izolacja mysich limfocytów T CD4 + i różnicowanie in vitro w podzbiory limfocytów T

Odrębne podzbiory komórek dendrytycznych istnieją jako rzadkie populacje w narządach limfoidalnych, dlatego są trudne do wyizolowania w wystarczającej liczbie i czystości do eksperymentów immunologicznych. W tym miejscu opisujemy metodę o wysokiej skuteczności i wysokiej wydajności do izolacji wszystkich obecnie znanych głównych podzbiorów komórek dendrytycznych śledziony myszy.

Wydajna i wysokowydajna metoda izolacji podzbiorów komórek dendrytycznych myszy

Tutaj opisujemy protokół analizy fenotypu limfocytów regulatorowych T (T reg) wyizolowanych od naiwnych i przewlekłych myszy zakażonych wirusem limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych. Ponadto zapewniamy proces oceny aktywności supresyjnej limfocytówT reg.

Analiza fenotypowa i funkcjonalna aktywowanych limfocytów T regulatorowych wyizolowanych od myszy zakażonych wirusem przewlekłego limfocytarnego zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych

Opisujemy tutaj transgeniczny model myszy reporterowej do wizualizacji komórek wytwarzających IL-22 wewnątrz różnych tkanek myszy. Ta metoda może być wykorzystana do śledzenia lokalizacji innych cytokin lub białek wydzielniczych u myszy.

Wizualizacja limfocytów z ekspresją IL-22 przy użyciu myszy reporterowych

Wrodzone komórki limfoidalne grupy 2 (ILC2), zaangażowane w zapalenie typu 2, głównie uczestniczą w odpowiedzi na infekcję robakami pasożytniczymi, choroby alergiczne, homeostazę metaboliczną i naprawę tkanek. W tym badaniu przedstawiono procedurę izolacji ILC2 z mysiej błony śluzowej nosa i wykrywania ekspresji CD226.

Izolacja wrodzonych komórek limfoidalnych grupy 2 z błony śluzowej nosa myszy w celu wykrycia ekspresji CD226

Ten protokół opisuje różnicowanie naiwnych limfocytów T CD4+ w patogenne komórki Th17 in vitro. W szczególności, w połączeniu z podejściem opartym na wieloparametrowej cytometrii przepływowej, można uzyskać 90% czystość patogennych komórek Th17 z naiwnych limfocytów T CD4 + przy użyciu tej metody różnicowania.

Różnicowanie in vitro naiwnych limfocytów T CD4 + w patogenne komórki Th17 u myszy

Obecne badanie prezentuje protokoły oceny wczesnego losu specyficznych dla wirusa komórek TFH i manipulowania ekspresją genów w tych komórkach.

Dostęp do wczesnego różnicowania specyficznych dla wirusa pęcherzykowych komórek T pomocniczych CD4 + u myszy zakażonych ostrą LCMV

Dostarczamy szczegółowy protokół do izolowania i identyfikacji rzadkich populacji limfocytów T specyficznych dla antygenu w płucach myszy poprzez magnetyczne wzbogacanie limfocytów T na bazie kulek magnetycznych i tetramery peptydu:głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC).

Identyfikacja rzadkich limfocytów T specyficznych dla antygenu z płuc myszy za pomocą peptydów: głównych tetramerów kompleksu zgodności tkankowej

Poznaj metodę izolacji żywotnych mysich limfocytów T wydzielających IL-17 przy użyciu technologii cytokinowej analizy wydzielania. Protokół umożliwia dokładne wykrywanie komórek TH17 na poziomie pojedynczych komórek.

Wykrywanie i izolacja żywych limfocytów T wydzielających IL-17 u myszy

Przeglądaj więcej filmów