Name: Produkcja elektrod amperometrycznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Naucz się produkcji elektrod węglowych do amperometrii w celu wykrywania katecholamin z pęcherzyków komórkowych. Ta metoda umożliwia badanie uwalniania neuroprzekaźników na poziomie pojedynczych komórek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy dr. Aaronowi P. Foxowi z University of Chicago, w którego laboratorium protokół ten został pierwotnie opracowany, oraz Williamowi Rodenowi (Saint Louis University) za jego dalszy rozwój.
Dziękujemy fundacji Whitehall Foundation oraz National Science Foundation za wsparcie.

Część 1: Przygotowanie włókna węglowego
<ol>
<li>Odetnij pęk włókien węglowych (stosujemy włókna o średnicy 7μm) o długości wynoszącej około 1,25 X długości pipety kapilarnej.</li>
<li>Usuń apreturę, gotując około 100 mL acetonu w naczyniu i umieszczając włókna w gorącym, wrzącym acetonie na 30 minut lub dłużej.</li>
<li>Wyjmij włókna z ciepłego acetonu i przenieś je do czystego zlewki zawierającej 50-100 mL świeżego acetonu.</li>
<li>Wysusz włókna, kładąc pęk na otwartej szalce Petriego o średnicy 150 mm i pozostawiając do wyschnięcia na powietrzu przez noc.</li>
</ol>
Część 2: Wypalanie końcówek szklanych kapilar
<ol>
<li>Wypoleruj ogniowo każdą rurkę kapilarną (stosujemy kapilary do mikrohematokrytu o średnicy zewnętrznej 1,5mm, średnicy wewnętrznej 1,3mm i długości 7,5cm), trzymając rurkę w środku pęsetą i wystawiając koniec na działanie płomienia. Obracaj rurkę około 3 razy podczas przebywania w płomieniu.</li>
<li>Odwróć rurkę i umieść przeciwległy koniec w płomieniu, ponownie obracając ją 3 razy.</li>
<li>Umieść wypolerowane ogniowo rurki w szklanym naczyniu i przełóż do pieca do czasu, aż będą gotowe do wypełnienia włóknami węglowymi.</li>
</ol>
Część 3: Przewlekanie włókna węglowego do rurki kapilarnej
<ol>
<li>Zgodnie z opisami Machado et al. (2008) oraz Mundroff and Wightman (2002), wciągnij włókno do szklanej rurki, używając plastikowego przewodu podłączonego do pompy próżniowej z filtrem.</li>
<li>Odetnij włókno za pomocą skalpela. Pozostaw ¼ cala włókna poza rurką.</li>
</ol>
Część 4: Wytwarzanie pipet światłowodowych w wyciągaczu elektrod
<ol>
<li>Umieść rurkę kapilarną w wyciągaczu elektrod (używamy modelu PP-830 firmy Narishige Japan) i dokręć pokrętła, aby unieruchomić kapilarę.</li>
<li>Użyj przełączników, aby wykonać dwa wyciągnięcia, stosując optymalne ustawienia urządzenia.</li>
<li>Gdy pipeta zostanie wyciągnięta i podzielona na pół, rozdziel obie części, przecinając gołe włókno w centrum za pomocą nożyczek.</li>
<li>Wyjmij każdą z połówek elektrody i pociągnij za wystające włókno, aby przełamać szklaną uszczelkę. Przytnij włókno nożyczkami tak, aby poza rurką pozostało jedynie 1/8 inch włókna.</li>
<li>Powtarzaj kroki 1-4, aż do przygotowania około 16 elektrod włóknistych.</li>
</ol>
Część 5: Przygotowanie uszczelnienia z epoksydowego szkła
<ol>
<li>Podgrzać przygotowaną wcześniej alikwot żywicy epoksydowej na płycie grzejnej ustawionej na 55°C przez 6 minut w dygestorium.</li>
<li>Podczas podgrzewania żywicy, owinąć ok. 16 wyciągniętych elektrod w pęk za pomocą taśmy.</li>
<li>Po 6-minutowym podgrzaniu żywicy Epon, dodać 0,7 g MPDA do gorącej żywicy Epon (14%, w/v). Wymieszać, obracając fiolką.</li>
<li>Zanurzyć pęk elektrod w gorącym roztworze żywicy epoksydowej z utwardzaczem. Po około 20 s odpowiednia ilość żywicy wpłynie do szklanych końcówek dzięki działaniu kapilarnemu.</li>
<li>Rozwiązać pęk, ułożyć elektrody na tekturze z nacięciami i umieścić tackę w piekarniku ustawionym na 100°F.</li>
<li>Po co najmniej 48 godzinach zbadać każdą elektrodę pod mikroskopem stereoskopowym. Odrzucić elektrody, które nie wypełniły się żywicą, mają zmiażdżoną końcówkę, zawierają więcej niż jedno włókno itp. Po sprawdzeniu każdej elektrody umieścić je z powrotem w uchwycie tekturowym i ponownie włożyć do piekarnika. Elektrody są zazwyczaj zdatne do użytku przez około 1 miesiąc od momentu wykonania.</li>
</ol>
Część 6: Cięcie włókna węglowego
<ol>
<li>Ostrożnie umieść elektrodę z włókna węglowego na szkiełku przedmiotowym za pomocą taśmy teflonowej.</li>
<li>Obejrzyj końcówkę pod mikroskopem stereoskopowym.</li>
<li>Używając czystego ostrza skalpela, wykonaj cięcie prostopadłe do włókna węglowego, aby uzyskać płaską i czystą powierzchnię umożliwiającą przykładanie włókna do komórki.</li>
</ol>

<ol><li>Mundorf, M. L., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amperometry+and+cyclic+voltammetry+with+carbon+fiber+microelectrodes+at+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protocols+in+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Amperometry and cyclic voltammetry with carbon fiber microelectrodes at single cells.</a> Curr Protocols in Neurosci. 6 (14), 1-6 (2002).</li>
<li>Machado, D. J., Montesinos, M. S., Borges, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Good+practices+in+single-cell+amperometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molec.+Biol%22%5BJournal%5D)">Good practices in single-cell amperometry.</a> Methods in Molec. Biol. 440, 297-313 (2008).</li>
</ol>

Niniejszy protokół opisuje sposób wytwarzania i przycinania elektrod amperometrycznych. Podczas pomiarów amperometrycznych elektrodę z włókna węglowego umieszcza się przy powierzchni komórki wydzielniczej. Aktywność egzocytarną obserwuje się w postaci skoków amperometrycznych, które wskazują na prąd elektrochemiczny wywołany transferem elektronów po utlenieniu katecholamin. Dzięki praktyce w wykonywaniu i przycinaniu elektrod amperometrycznych można znacznie zredukować poziom szumów w porównaniu do wielu dostępnych komer...

<table><tbody><tr><td>Utwardzacz epoksydowy, płatki 1,3-fenylenodiaminy</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P23954-100G04 716AJ</td><td>Aliquoty przechowuje się w eksykatore i nie należy ich wystawiać na działanie światła.</td></tr><tr><td>Włókna węglowe</td><td>Materiał</td><td>Goodfellow</td><td>C005725</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary do mikrohematokrytu</td><td>Materiał</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9836768</td><td></td></tr><tr><td>Żywica epoksydowa</td><td>Odczynnik</td><td>Miller-Stephenson</td><td>Epon Resin 828</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereotypowy</td><td>Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wytwornica elektrod (puller)</td><td>Instrument</td><td>Narishige International</td><td>PP-830</td><td>1. wyciągnięcie = 24.8 °C; 2. wyciągnięcie = 62.7 °C</td></tr><tr><td>Piec</td><td>Instrument</td><td></td><td></td><td>ustawiony na 100 °F.</td></tr><tr><td>Płyta grzewcza</td><td>Instrument</td><td></td><td></td><td>ustawiona na 55 °C</td></tr></tbody></table>

wytwarzanie elektrod amperometrycznych

Fabrication of Amperometric Electrodes

Elektrody z włókna węglowego są kluczowe dla detekcji uwalniania katecholamin z pęcherzyków w pojedynczych komórkach podczas pomiarów amperometrycznych. W niniejszym opracowaniu opisujemy techniki niezbędne do wytworzenia elektrod o niskim poziomie szumów (<0,5 pA). Techniki te zostały zmodyfikowane na podstawie opisów opublikowanych przez poprzednich badaczy (1,2). Elektrody wykonuje się poprzez przygotowanie włókien węglowych i indywidualne wprowadzanie ich do każdej rurki kapilarnej z wykorzystaniem próżni z filtrem w celu zasysania włókna. Następnie rurkę kapilarną z włóknem przeciąga się w wyciągaczu do elektrod, tworząc dwie połowy, z których każda posiada cienką, ostrą końcówkę. Elektrody zanurza się w gorącej, płynnej żywicy epoksydowej zmieszanej z utwardzaczem, aby stworzyć uszczelnienie epoksydowo-szklane. Na koniec elektrody umieszcza się w piekarniku w celu utwardzenia żywicy. Ostrożne obchodzenie się z elektrodami jest krytyczne dla zapewnienia ich powtarzalnego wykonania i braku uszkodzeń. Niniejszy protokół przedstawia sposób wytwarzania i przycinania elektrod amperometrycznych do rejestracji z pojedynczych komórek.

Niniejszy protokół opisuje sposób przygotowania elektrod z włókna węglowego. Elektrody te są następnie wykorzystywane do detekcji uwalniania katecholamin z pęcherzyków za pomocą amperometrii włóknem węglowym.

Wytwarzanie elektrod amperometrycznych

Elektrody z włókna węglowego są kluczowe dla detekcji uwalniania katecholamin z pęcherzyków w pojedynczych komórkach podczas pomiarów amperometrycznych. W niniejszej pracy...

Niniejszy protokół opisuje sposób wytwarzania elektrod z włókna węglowego. W pierwszej kolejności wypełnimy kapilary szklane włóknami węglowymi, z których usunięto apreturę. Następnie przeciągniemy zespół kapilary z włóknem w celu utworzenia dwóch elektrod i przetniemy włókno.Następnie ułożymy elektrody tak, aby mogły zostać zanurzone w żywicy epoksydowej. Aby uszczelnić włókno w elektrodzie, będziemy przechowywać elektrody światłowodowe na statywie w gorącym piecu. Elektrody te są następnie wykorzystywane do wykrywania uwalniania katecholamin z pęcherzyków w pojedynczych komórkach przy użyciu włókien węglowych i barometrii.Pomyślne rejestracje charakteryzują się niskim poziomem szumów i wyraźnie zarysowanymi piki skierowanymi w górę na śladzie zapisu. Cześć, nazywam się Carrie Pike i pracuję w laboratorium dr Amy Harkins w Katedrze Nauk Farmakologicznych i Fizjologicznych na Wydziale Medycznym Uniwersytetu w St. Louis. Przedstawię Państwu procedurę wytwarzania niskoszumnych elektrod z włókna węglowego, stosowanych w pyrometrii do pomiaru uwalniania katecholamin z pojedynczych komórek.Zacznijmy od przygotowania włókien węglowych do wykonania elektrod. Najpierw, w dygestorium, odetnij pęk włókien węglowych na długość wynoszącą około 1,25 raza długości pipety kapilarnej. Usuń preparację powierzchniową (sizing), gotując około 100 ml acetonu w naczyniu i umieszczając włókna w gorącym, wrzącym acetonie na 30 minut lub dłużej.Po zagotowaniu wyjmij włókna z podgrzanego acetonu i przenieś je do czystego zlewki zawierającej od 50 do 100 ml świeżego acetonu. Przenieś włókna ponownie na folię aluminiową, którą można wyjąć z dygestorium. Osusz włókna, kładąc wiązkę na otwartej szalce Petriego o średnicy 150 mm i pozostawiając włókna węglowe do wyschnięcia na powietrzu przez noc.Po przygotowaniu włókien węglowych należy przejść do przygotowania szklanych rurek kapilarnych w celu ich wypalenia. Należy użyć szklanych rurek kapilarnych do mikrohematokryty o długości 7,5 centymetra, średnicy zewnętrznej 1,5 milimetra i średnicy wewnętrznej 1,3 milimetra. Trzymając rurkę za środek, należy wystawić jeden z jej końców na działanie płomienia.Obracaj probówkę około trzech razy, gdy znajduje się w płomieniu. Odwróć probówkę, umieść przeciwległy koniec w płomieniu i ponownie obróć ją trzy razy. Oba końce kapilary są teraz wypalone.Umieść rurki wypalane ogniowo w szklanym naczyniu i przełóż je do pieca, aż będą gotowe do wypełnienia włóknami węglowymi. Przed rozpoczęciem wprowadzania włókna węglowego do rurki kapilarnej należy założyć maskę ochronną. Następnie użyj plastikowego przewodu podłączonego do pompy próżniowej z filtrem, aby zassać włókno do szklanej rurki.Następnie przetnij włókno za pomocą skalpela. Należy upewnić się, że z obu końców rurki wystaje około 6,35 mm włókna. Przewleczone włókno węglowe jest teraz gotowe do wyciągnięcia w celu uformowania elektrody z włókna pipety.Wprowadź kapilarę do bieguna elektrody i dokręć pokrętła, aby unieruchomić kapilarę w miejscu. Następnie ustaw biegun na optymalne parametry i użyj przełączników, aby uruchomić oba bieguny. Gdy pipeta zostanie wciągnięta do połowy, rozdziel obie części, przecinając gołe włókno w centrum.Używając nożyczek, usuń każdą połowę elektrody i pociągnij za wystające włókno, aby przerwać szklaną uszczelkę. Przytnij włókno nożyczkami tak, aby poza rurką pozostał tylko jeden ósemka cala włókna.Powtarzaj te kroki do uzyskania około 16 elektrod. Elektrody światłowodowe należy wyciągnąć przed przejściem do uszczelniania elektrod w celu wykonania szklanej uszczelki epoksydowej. Po pierwsze, podgrzej przygotowaną porcję żywicy epoksydowej na płytce grzejnej ustawionej na 55 °C przez sześć minut. W czasie podgrzewania żywicy w wyciągu, zwiń około 16 wyciągnętych elektrod w wiązkę.Używając taśmy, po podgrzewaniu żywicy epoksydowej przez sześć minut, należy dodać 0,7 g utwardzacza do gorącej żywicy. Wymieszać zawartość, obracając fiolkę. Zanurzyć wiązkę elektrod w roztworze gorącej żywicy epoksydowej z utwardzaczem.Zanurz wiązkę dwukrotnie, za każdym razem na około pięć sekund, aby wystarczająca ilość epoksydy wniknęła do szklanych końcówek poprzez działanie kapilarne. Rozwiąż wiązkę i umieść elektrody w tekturowym uchwycie z nacięciami. Umieść tackę w piekarniku ustawionym na 100 stopni Fahrenheita.Po upływie co najmniej 48 godzin należy zbadać każdą elektrodę pod mikroskopem stereoskopowym. Odrzucić elektrody, które nie zostały wypełnione żywicą epoksydową. Przygotować końcówkę do rozbicia.Posiadają więcej niż jedno włókno lub nie mogą być użyte z innych powodów. Po sprawdzeniu każdej elektrody należy umieścić je z powrotem na tekturowym uchwycie i ponownie włożyć do piekarnika. Elektrody są zazwyczaj przydatne przez około jeden miesiąc od momentu wykonania i wymagają odcięcia włókna węglowego przed użyciem do pyrometrii w komórce.Aby przyciąć włókno węglowe, należy ostrożnie umieścić elektrodę z włókna węglowego na szkiełku przedmiotowym z taśmą teflonową. Końcówkę włókna należy obejrzeć pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie, używając czystego ostrza skalpela, należy przeciąć włókno węglowe prostopadle, aby uzyskać płaską i czystą powierzchnię, która umożliwi prawidłowe przyłożenie włókna węglowego do komórki.Bezpośrednio przed rozpoczęciem rejestracji. Napełnić kapilarę 3 M KCl za pomocą strzykawki do napełniania, dbając o osuszenie końca przeciwległego do włókna, aby usunąć nadmiar soli.Umieść elektrodę na srebrnym pelletcie chlorku srebra w uchwycie elektrody. Połącz elektrycznie z głowicą pyrometryczną. Dokręć uchwyt elektrody, aby zapewnić jej stabilność.Umieść elektrodę obok komórki i przystąp do rejestracji zdarzeń w metryce RO. Niniejszy protokół opisuje sposób wytwarzania i przycinania elektrod tric. Podczas rejestracji tric elektrodę z włókna węglowego przykłada się do powierzchni komórki wydzielniczej.Aktywność egzocytarną obserwuje się jako kolce trójfazowe (tric spikes), które wskazują na prąd elektrochemiczny wywołany transferem elektronów po utlenieniu katecholamin. Dzięki praktyce w przygotowywaniu i przycinaniu elektrod metrycznych EmPro, poziom szumów może zostać znacznie zredukowany w porównaniu do wielu dostępnych w sprzedaży elektrod komercyjnych. Przedstawiłem właśnie sposób wytwarzania i parametryzowania elektrod z włókna węglowego podczas wykonywania tej procedury.Ważne jest, aby zwrócić szczególną uwagę na szczegóły protokołu, aby uzyskać spójne elektrody o niskim poziomie szumów. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Produkcja elektrod amperometrycznych

Manipulowanie cieczami i zawieszonymi cząstkami w skali mikro i nano staje się coraz bardziej realne dzięki dalszemu rozwojowi technologii umożliwiających, takich jak elektrokinetyka prądu przemiennego (AC electrokinetics). W niniejszym opracowaniu omawiamy podstawy fizyczne elektrokinetyki AC, sposób wytwarzania tych urządzeń oraz metodę interpretacji obserwacji eksperymentalnych.

Zjawiska elektrokinetyczne AC generowane przez struktury mikroelektrodowe

Niniejszy artykuł szczegółowo opisuje konstrukcję multipleksowego czujnika opartego na mikroiigłach. Urządzenie to jest opracowywane w celu prowadzenia pobierania próbek in situ oraz analizy elektrochemicznej wielu analitów w sposób szybki i selektywny. Przewidujemy zastosowanie tych czujników opartych na mikroigłach w medycynie klinicznej oraz badaniach biomedycznych.

Czujnik oparty na pustych mikroiğłach do multipleksowego transdermalanego detekcji elektrochemicznej

Niniejszy artykuł opisuje podejście w zakresie biofabrykacji: osadzanie polisacharydów reagujących na bodźce w obecności spolaryzowanych elektrod w celu stworzenia biokompatybilnych filmów, które mogą zostać funkcjonalizowane komórkami lub białkami. Przedstawiamy laboratoryjną strategię wytwarzania tych filmów, a także ich podstawowe zastosowania w tworzeniu interaktywnych, biofunkcjonalizowanych powierzchni dla aplikacji typu lab-on-a-chip.

Łączenie interfejsu bioelektronicznego za pomocą biofabrykacji

Badanie pokazuje wzrost cienkich warstw nanohybrydowych cienkich warstw z tlenku grafenu o obniżonej zawartości tlenku irydu (IrO 2-RGO) na nieregularnym i szorstkim podłożu węglowym drukowanym sitodrukiem poprzez zieloną syntezę elektrochemiczną oraz ich implementację jako czujnika pH z wzorzystą platformą papierowo-fluidyczną.

Tlenek grafenu o obniżonej zawartości tlenku irydu Nanohybrydowe cienkowarstwowe modyfikowane elektrody z sitodrukiem jako jednorazowe elektrochemiczne papierowe mikroprzepływowe czujniki pH

Ten protokół opisuje strategię produkcji opartą na rozwiązaniach dla wysokowydajnych, elastycznych, przezroczystych elektrod z w pełni wbudowaną, grubą metalową siatką. Elastyczne przezroczyste elektrody wytwarzane w tym procesie wykazują jedne z najwyższych zgłoszonych parametrów, w tym bardzo niską rezystancję arkusza, wysoką przepuszczalność optyczną, stabilność mechaniczną przy zginaniu, silną przyczepność podłoża, gładkość powierzchni i stabilność środowiskową.

Skalowalna strategia produkcji oparta na roztworze dla wysokowydajnych, elastycznych i przezroczystych elektrod z wbudowaną metalową siatką

Przedstawiono łatwą metodę przygotowania elektrod przy użyciu materiału sypkiego Fe4.5Ni4.5S8. Metoda ta stanowi technikę alternatywną dla konwencjonalnego wytwarzania elektrod i opisuje wymagania wstępne dla niekonwencjonalnych materiałów elektrodowych, w tym prostą metodę badań elektrokatalitycznych.

Proste metody przygotowania elektrod masowych z metali nieszlachetnych do zastosowań elektrokatalitycznych

Techniki wzbogacania mikroorganizmów na miejscu lub hodowli in situ mogą ułatwić izolację trudnych do hodowli taksonów mikroorganizmów, zwłaszcza z ekstremalnych środowisk o niskiej biomasie lub geochemicznie. W tym miejscu opisujemy układ elektrochemiczny bez użycia zewnętrznego źródła zasilania w celu wzbogacenia szczepów drobnoustrojów, które są zdolne do zewnątrzkomórkowego transportu elektronów (EET).

Wolnostojący zestaw elektrochemiczny do wzbogacania bakterii oddychających anodą na miejscu

Tutaj przedstawiamy protokół produkcji chemicznie zredukowanego mikroczujnika pH z powłoką Nafion, funkcjonalizowanego polianiliną, elektrochemicznie zredukowanego tlenku grafenu. Ten półprzewodnikowy czujnik pH oparty na chemiorezystorze może wykrywać zmiany pH w czasie rzeczywistym podczas procesu fermentacji Lactococcus lactis.

Produkcja powlekanego nafionem, zredukowanego tlenku grafenu/polianiliny czujnika chemiorezystancyjnego do monitorowania pH w czasie rzeczywistym podczas fermentacji mikrobiologicznej

Ten artykuł ma na celu przedstawienie metody tworzenia gładkich i dobrze kontrolowanych warstw chlorku srebra (AgCl) z określonym pokryciem na cienkich warstwach srebrnych elektrod.

Wytwarzanie cienkowarstwowych elektrod srebrnych/chlorku srebra z precyzyjnie kontrolowanym jednowarstwowym chlorkiem srebra

Opisujemy wodne i organiczne systemy rozpuszczalnikowe do elektropolimeryzacji poli(3,4-etylenodioksytiofenu) do tworzenia cienkich warstw na powierzchni złotych mikroelektrod, które są używane do wykrywania analitów o niskiej masie cząsteczkowej.

Elektrochemiczne przygotowanie warstw poli(3,4-etylenodioksytiofenu) na mikroelektrodach złota do zastosowań związanych z wykrywaniem kwasu moczowego

Naszym celem było dostarczenie zaktualizowanego, łatwego do zrozumienia przewodnika na temat produkcji i testowania elektrod do elektromiografii epimysalnej. W tym celu udostępniamy instrukcje dotyczące pozyskiwania materiałów oraz szczegółowy przewodnik po procesie produkcji i testowania.

Opracowanie taniej elektrody do elektromiografii epimysjalnej: uproszczony przepływ pracy przy produkcji i testowaniu

Naucz się produkcji elektrod węglowych do amperometrii w celu wykrywania katecholamin z pęcherzyków komórkowych. Ta metoda umożliwia badanie uwalniania neuroprzekaźników na poziomie pojedynczych komórek.

Wytwarzanie elektrod amperometrycznych

Przeglądaj więcej filmów