Wytwarzanie elektrod amperometrycznych

Niniejszy protokół opisuje sposób wytwarzania elektrod z włókna węglowego. W pierwszej kolejności wypełnimy kapilary szklane włóknami węglowymi, z których usunięto apreturę. Następnie przeciągniemy zespół kapilary z włóknem w celu utworzenia dwóch elektrod i przetniemy włókno.

Następnie ułożymy elektrody tak, aby mogły zostać zanurzone w żywicy epoksydowej. Aby uszczelnić włókno w elektrodzie, będziemy przechowywać elektrody światłowodowe na statywie w gorącym piecu. Elektrody te są następnie wykorzystywane do wykrywania uwalniania katecholamin z pęcherzyków w pojedynczych komórkach przy użyciu włókien węglowych i barometrii.

Pomyślne rejestracje charakteryzują się niskim poziomem szumów i wyraźnie zarysowanymi piki skierowanymi w górę na śladzie zapisu. Cześć, nazywam się Carrie Pike i pracuję w laboratorium dr Amy Harkins w Katedrze Nauk Farmakologicznych i Fizjologicznych na Wydziale Medycznym Uniwersytetu w St. Louis. Przedstawię Państwu procedurę wytwarzania niskoszumnych elektrod z włókna węglowego, stosowanych w pyrometrii do pomiaru uwalniania katecholamin z pojedynczych komórek.

Zacznijmy od przygotowania włókien węglowych do wykonania elektrod. Najpierw, w dygestorium, odetnij pęk włókien węglowych na długość wynoszącą około 1,25 raza długości pipety kapilarnej. Usuń preparację powierzchniową (sizing), gotując około 100 ml acetonu w naczyniu i umieszczając włókna w gorącym, wrzącym acetonie na 30 minut lub dłużej.

Po zagotowaniu wyjmij włókna z podgrzanego acetonu i przenieś je do czystego zlewki zawierającej od 50 do 100 ml świeżego acetonu. Przenieś włókna ponownie na folię aluminiową, którą można wyjąć z dygestorium. Osusz włókna, kładąc wiązkę na otwartej szalce Petriego o średnicy 150 mm i pozostawiając włókna węglowe do wyschnięcia na powietrzu przez noc.

Po przygotowaniu włókien węglowych należy przejść do przygotowania szklanych rurek kapilarnych w celu ich wypalenia. Należy użyć szklanych rurek kapilarnych do mikrohematokryty o długości 7,5 centymetra, średnicy zewnętrznej 1,5 milimetra i średnicy wewnętrznej 1,3 milimetra. Trzymając rurkę za środek, należy wystawić jeden z jej końców na działanie płomienia.

Obracaj probówkę około trzech razy, gdy znajduje się w płomieniu. Odwróć probówkę, umieść przeciwległy koniec w płomieniu i ponownie obróć ją trzy razy. Oba końce kapilary są teraz wypalone.

Umieść rurki wypalane ogniowo w szklanym naczyniu i przełóż je do pieca, aż będą gotowe do wypełnienia włóknami węglowymi. Przed rozpoczęciem wprowadzania włókna węglowego do rurki kapilarnej należy założyć maskę ochronną. Następnie użyj plastikowego przewodu podłączonego do pompy próżniowej z filtrem, aby zassać włókno do szklanej rurki.

Następnie przetnij włókno za pomocą skalpela. Należy upewnić się, że z obu końców rurki wystaje około 6,35 mm włókna. Przewleczone włókno węglowe jest teraz gotowe do wyciągnięcia w celu uformowania elektrody z włókna pipety.

Wprowadź kapilarę do bieguna elektrody i dokręć pokrętła, aby unieruchomić kapilarę w miejscu. Następnie ustaw biegun na optymalne parametry i użyj przełączników, aby uruchomić oba bieguny. Gdy pipeta zostanie wciągnięta do połowy, rozdziel obie części, przecinając gołe włókno w centrum.

Używając nożyczek, usuń każdą połowę elektrody i pociągnij za wystające włókno, aby przerwać szklaną uszczelkę. Przytnij włókno nożyczkami tak, aby poza rurką pozostał tylko jeden ósemka cala włókna.

Powtarzaj te kroki do uzyskania około 16 elektrod. Elektrody światłowodowe należy wyciągnąć przed przejściem do uszczelniania elektrod w celu wykonania szklanej uszczelki epoksydowej. Po pierwsze, podgrzej przygotowaną porcję żywicy epoksydowej na płytce grzejnej ustawionej na 55 °C przez sześć minut. W czasie podgrzewania żywicy w wyciągu, zwiń około 16 wyciągnętych elektrod w wiązkę.

Używając taśmy, po podgrzewaniu żywicy epoksydowej przez sześć minut, należy dodać 0,7 g utwardzacza do gorącej żywicy. Wymieszać zawartość, obracając fiolkę. Zanurzyć wiązkę elektrod w roztworze gorącej żywicy epoksydowej z utwardzaczem.

Zanurz wiązkę dwukrotnie, za każdym razem na około pięć sekund, aby wystarczająca ilość epoksydy wniknęła do szklanych końcówek poprzez działanie kapilarne. Rozwiąż wiązkę i umieść elektrody w tekturowym uchwycie z nacięciami. Umieść tackę w piekarniku ustawionym na 100 stopni Fahrenheita.

Po upływie co najmniej 48 godzin należy zbadać każdą elektrodę pod mikroskopem stereoskopowym. Odrzucić elektrody, które nie zostały wypełnione żywicą epoksydową. Przygotować końcówkę do rozbicia.

Posiadają więcej niż jedno włókno lub nie mogą być użyte z innych powodów. Po sprawdzeniu każdej elektrody należy umieścić je z powrotem na tekturowym uchwycie i ponownie włożyć do piekarnika. Elektrody są zazwyczaj przydatne przez około jeden miesiąc od momentu wykonania i wymagają odcięcia włókna węglowego przed użyciem do pyrometrii w komórce.

Aby przyciąć włókno węglowe, należy ostrożnie umieścić elektrodę z włókna węglowego na szkiełku przedmiotowym z taśmą teflonową. Końcówkę włókna należy obejrzeć pod mikroskopem stereoskopowym. Następnie, używając czystego ostrza skalpela, należy przeciąć włókno węglowe prostopadle, aby uzyskać płaską i czystą powierzchnię, która umożliwi prawidłowe przyłożenie włókna węglowego do komórki.

Bezpośrednio przed rozpoczęciem rejestracji. Napełnić kapilarę 3 M KCl za pomocą strzykawki do napełniania, dbając o osuszenie końca przeciwległego do włókna, aby usunąć nadmiar soli.

Umieść elektrodę na srebrnym pelletcie chlorku srebra w uchwycie elektrody. Połącz elektrycznie z głowicą pyrometryczną. Dokręć uchwyt elektrody, aby zapewnić jej stabilność.

Umieść elektrodę obok komórki i przystąp do rejestracji zdarzeń w metryce RO. Niniejszy protokół opisuje sposób wytwarzania i przycinania elektrod tric. Podczas rejestracji tric elektrodę z włókna węglowego przykłada się do powierzchni komórki wydzielniczej.

Aktywność egzocytarną obserwuje się jako kolce trójfazowe (tric spikes), które wskazują na prąd elektrochemiczny wywołany transferem elektronów po utlenieniu katecholamin. Dzięki praktyce w przygotowywaniu i przycinaniu elektrod metrycznych EmPro, poziom szumów może zostać znacznie zredukowany w porównaniu do wielu dostępnych w sprzedaży elektrod komercyjnych. Przedstawiłem właśnie sposób wytwarzania i parametryzowania elektrod z włókna węglowego podczas wykonywania tej procedury.

Ważne jest, aby zwrócić szczególną uwagę na szczegóły protokołu, aby uzyskać spójne elektrody o niskim poziomie szumów. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.