Szybka amplifikacja końców cDNA

1. Zestaw eksperymentalny dla 3' RACE

1. Zaprojektuj specyficzny dla 5' starter dla interesującego nas genu (gen-specific primer 1, GSP-1). Musi być bardzo konkretny, ponieważ jest to jedyny elementarz, który wprowadza konkretność. Dlatego preferowany byłby stosunkowo długi starter (typowa długość około 24 nukleotydów, Tm w zakresie 55-65°C).
2. Zaprojektuj drugi, zagnieżdżony starter (GSP-2), tzn. starter powinien znajdować się 3' od GSP-1. Ten krok jest opcjonalny, ale wykonanie drugiego PCR z zagnieżdżonym starterem zwiększy wydajność i swoistość PCR dla interesującego genu. Startery używane do amplifikacji cDNA dSmad2 są wymienione w Tabeli 2.

2. Synteza cDNA

1. Ekstrahować RNA z próbek, stosując metodę ekstrakcji RNA lub zestaw zgodnie z protokołem producenta. Potraktuj próbki DNazą, aby uniknąć amplifikacji genomowego DNA. W naszym przykładzie wyekstrahowaliśmy RNA z 10 całych dorosłych muszek.
2. Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i w razie potrzeby dostosować wodą wolną od RNaz do maksimum 100 ng/μl.
3. Przygotuj cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji (RT), używając zestawu zalecanego do RACE. Przygotuj mieszankę wzorcową z następującymi odczynnikami na próbkę:
   - 4 μl Bufor do odwrotnej transkrypcji (5x)
   - 2 μl Oligo(dT)₂₀ starter (oligo składający się z 20 deoksytymidyn)
   - 10 μl RNA (maks. 1 μg)
   - 3 μl ddH₂O
   - 1 μl odwrotnej transkryptazy
   - RAZEM: 20 μl
4. Inkubować reakcję przez 90 minut w temperaturze 42 °C. Włączyć kontrolę ujemną z pominięciem odwrotnej transkryptazy.
5. Dezaktywuj odwrotną transkryptazę przez inkubację w temperaturze 85ºC przez 5 minut.
6. Aby rozcieńczyć poziom DNA w celu skutecznego PCR, dodaj 80 μl buforu TE, aby zwiększyć całkowitą objętość do 100 μl.

3. Amplifikacja fragmentów cDNA

1. Przygotuj pierwszą rundę amplifikacyjnej mieszanki PCR przy użyciu polimerazy Taq o wysokiej wierności (HF):
   - 4 μl 5x bufor polimerazy HF Taq
   - 0,4 μl mieszaniny dNTP (po 10 mM)
   - 1 μl podkładu GSP1 (10 μM)
   - 1 μl Oligo(dT)20 primer (10 μM)
   - 1 μl matrycy cDNA
   - 0,2 μl polimerazy HF Taq DNA
   - 12,4 μl ddH2O
   - Razem: 20 μl
2. Uruchom PCR za pomocą programu PCR1 (Tabela 1). Włączyć kontrolę ujemną, używając jako matrycy oryginalnego produktu RNA bez RT. Ponadto może być dołączona kontrola "bez podkładu".
3. Opcjonalnie: zagnieżdżony PCR w celu zwiększenia swoistości i ilości produktów cDNA. Rozcieńczyć 1 μl produktów PCR i kontroli ujemnej w stosunku 1:20 w buforze TE. Użyj ich jako szablonu dla drugiej reakcji PCR:
   - 4 μl 5x bufor polimerazy HF Taq
   - 0,4 μl mieszaniny dNTP (po 10 mM)
   - 1 μl podkładu GSP2 (10 μM)
   - 1 μl Oligo(dT)₂₀ primer (10 μM)
   - 1 μl szablonu produktu PCR
   - 0,2 μl polimerazy HF Taq DNA
   - 12,4 μl ddH2O
   - Razem: 20 μl
4. Uruchom drugi PCR za pomocą programu PCR2 (Tabela 1)

4. Izolacja fragmentów cDNA

1. Przygotuj 1-2% żel agarozowy z buforem TAE, używając bromku etydyny lub alternatywnego barwienia DNA.
2. Zmieszać 5 μl próbki z 1 μl 6x żelowego buforu ładującego.
3. Załaduj próbki i drabinkę DNA o pojemności 1 kb jako marker i uruchom żel pod napięciem 120 V przez około 45 minut lub do momentu, gdy przód barwnika znajdzie się w ~75% w dół żelu. Upewnij się, że w próbkach nie zabraknie żelu.
4. Sprawdź opaski żelowe pod lampą UV. Do dalszej obróbki produktów użyj promieniowania UV o niskiej intensywności, zlokalizuj wzmocnione pasma i odetnij je od żelu za pomocą skalpela.
5. Oczyść DNA z żelu za pomocą metody takiej jak zamrażanie lub zestaw.
6. Oczyszczone fragmenty cDNA należy przechowywać w temperaturze -20ºC lub natychmiast wykorzystać do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie lub klonowanie.