What is Rapid Amplification of cDNA Ends and why is it used?

Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) is a PCR-based method that amplifies unknown nucleotide sequences at the ends of mRNA molecules. It is used when only a partial sequence of a novel mRNA is known. RACE allows researchers to determine missing sequences and identify transcript variants, even without prior knowledge of the complete sequence.

What are the structural features of eukaryotic mRNA ends?

Eukaryotic mature mRNAs have distinctive structural features at both ends. The five-prime end contains a methylated guanosine residue connected via a five-prime to five-prime triphosphate linkage, called the five-prime cap. The three-prime end typically has a poly(A) tail consisting of 20 to 250 adenylate residues that serves as a binding site for non-specific primers.

How does three-prime RACE differ from five-prime RACE?

Three-prime RACE amplifies sequences up to the three-prime end using a gene-specific primer and an oligo(dT) primer that binds the poly(A) tail, detecting transcript variants and different three-prime UTRs. Five-prime RACE first attaches a poly(A) tail at the five-prime end, then amplifies to that end, identifying differential five-prime splice variants and alternative five-prime UTRs.

Why are nested primers used in RACE protocols?

Nested primers are used in a second round of PCR to increase specificity and yield. Because the non-specific oligo(dT) primer and gene-specific primer can cause off-target amplification through random mispriming, nested primers bind downstream of the first set, amplifying only the target cDNA and reducing non-specific products.

What role does reverse transcription play in RACE?

Reverse transcription is the initial step in RACE that synthesizes complementary DNA (cDNA) from isolated mRNA templates. An oligo(dT) primer and reverse transcriptase enzyme generate single-stranded cDNA from the mRNA, creating a template pool from which the target cDNA's unknown ends can be extended and amplified during subsequent PCR reactions.

How are RACE products separated and identified?

RACE products are separated using agarose gel electrophoresis, which separates different transcripts based on their sizes, producing distinct bands. The band of interest is then excised from the gel, purified using a spin column kit, and sequenced to obtain the complete transcript sequence.

What primer design specifications are important for RACE?

Gene-specific primers for RACE should be approximately 24 nucleotides long with a melting temperature (Tm) ranging from 55 to 65 degrees Celsius to ensure high specificity. A second nested primer should be designed downstream of the first primer, also specific for the target sequence, to improve specificity in the second PCR round.

Szybka amplifikacja końców cDNA

0 wyświetleń09:44 min

1. Zestaw eksperymentalny dla 3' RACE

Zaprojektuj specyficzny dla 5' starter dla interesującego nas genu (gen-specific primer 1, GSP-1). Musi być bardzo konkretny, ponieważ jest to jedyny elementarz, który wprowadza konkretność. Dlatego preferowany byłby stosunkowo długi starter (typowa długość około 24 nukleotydów, Tm w zakresie 55-65°C).
Zaprojektuj drugi, zagnieżdżony starter (GSP-2), tzn. starter powinien znajdować się 3' od GSP-1. Ten krok jest opcjonalny, ale wykonanie drugiego PCR z zagnieżdżonym starterem zwiększy wydajność i swoistość PCR dla interesującego genu. Startery używane do amplifikacji cDNA dSmad2 są wymienione w Tabeli 2.

2. Synteza cDNA

Ekstrahować RNA z próbek, stosując metodę ekstrakcji RNA lub zestaw zgodnie z protokołem producenta. Potraktuj próbki DNazą, aby uniknąć amplifikacji genomowego DNA. W naszym przykładzie wyekstrahowaliśmy RNA z 10 całych dorosłych muszek.
Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i w razie potrzeby dostosować wodą wolną od RNaz do maksimum 100 ng/μl.
Przygotuj cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji (RT), używając zestawu zalecanego do RACE. Przygotuj mieszankę wzorcową z następującymi odczynnikami na próbkę:
- 4 μl Bufor do odwrotnej transkrypcji (5x)
- 2 μl Oligo(dT)₂₀ starter (oligo składający się z 20 deoksytymidyn)
- 10 μl RNA (maks. 1 μg)
- 3 μl ddH₂O
- 1 μl odwrotnej transkryptazy
- RAZEM: 20 μl
Inkubować reakcję przez 90 minut w temperaturze 42 °C. Włączyć kontrolę ujemną z pominięciem odwrotnej transkryptazy.
Dezaktywuj odwrotną transkryptazę przez inkubację w temperaturze 85ºC przez 5 minut.
Aby rozcieńczyć poziom DNA w celu skutecznego PCR, dodaj 80 μl buforu TE, aby zwiększyć całkowitą objętość do 100 μl.

3. Amplifikacja fragmentów cDNA

Przygotuj pierwszą rundę amplifikacyjnej mieszanki PCR przy użyciu polimerazy Taq o wysokiej wierności (HF):
- 4 μl 5x bufor polimerazy HF Taq
- 0,4 μl mieszaniny dNTP (po 10 mM)
- 1 μl podkładu GSP1 (10 μM)
- 1 μl Oligo(dT)20 primer (10 μM)
- 1 μl matrycy cDNA
- 0,2 μl polimerazy HF Taq DNA
- 12,4 μl ddH2O
- Razem: 20 μl
Uruchom PCR za pomocą programu PCR1 (Tabela 1). Włączyć kontrolę ujemną, używając jako matrycy oryginalnego produktu RNA bez RT. Ponadto może być dołączona kontrola "bez podkładu".
Opcjonalnie: zagnieżdżony PCR w celu zwiększenia swoistości i ilości produktów cDNA. Rozcieńczyć 1 μl produktów PCR i kontroli ujemnej w stosunku 1:20 w buforze TE. Użyj ich jako szablonu dla drugiej reakcji PCR:
- 4 μl 5x bufor polimerazy HF Taq
- 0,4 μl mieszaniny dNTP (po 10 mM)
- 1 μl podkładu GSP2 (10 μM)
- 1 μl Oligo(dT)₂₀ primer (10 μM)
- 1 μl szablonu produktu PCR
- 0,2 μl polimerazy HF Taq DNA
- 12,4 μl ddH2O
- Razem: 20 μl
Uruchom drugi PCR za pomocą programu PCR2 (Tabela 1)

4. Izolacja fragmentów cDNA

Przygotuj 1-2% żel agarozowy z buforem TAE, używając bromku etydyny lub alternatywnego barwienia DNA.
Zmieszać 5 μl próbki z 1 μl 6x żelowego buforu ładującego.
Załaduj próbki i drabinkę DNA o pojemności 1 kb jako marker i uruchom żel pod napięciem 120 V przez około 45 minut lub do momentu, gdy przód barwnika znajdzie się w ~75% w dół żelu. Upewnij się, że w próbkach nie zabraknie żelu.
Sprawdź opaski żelowe pod lampą UV. Do dalszej obróbki produktów użyj promieniowania UV o niskiej intensywności, zlokalizuj wzmocnione pasma i odetnij je od żelu za pomocą skalpela.
Oczyść DNA z żelu za pomocą metody takiej jak zamrażanie lub zestaw.
Oczyszczone fragmenty cDNA należy przechowywać w temperaturze -20ºC lub natychmiast wykorzystać do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie lub klonowanie.

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Pablo Sanchez Bosch², Sean Corcoran² i Katja Brückner^1,2,3
¹Eli i Edythe Szerokie Centrum Medycyny Regeneracji i Badań nad Komórkami Macierzys…

Browse More Videos

Technika RACE

RACE 3

RACE 5

startery specyficzne dla genu

PCR zagnie d ony

elektroforeza w elu agarozowym

odwrotna transkrypcja

starter Oligo dT

warianty transkrypcyjne