Szybka amplifikacja końców cDNA

0 views09:44 min

1. Zestaw eksperymentalny dla 3' RACE

Zaprojektuj specyficzny dla 5' starter dla interesującego nas genu (gen-specific primer 1, GSP-1). Musi być bardzo konkretny, ponieważ jest to jedyny elementarz, który wprowadza konkretność. Dlatego preferowany byłby stosunkowo długi starter (typowa długość około 24 nukleotydów, Tm w zakresie 55-65°C).
Zaprojektuj drugi, zagnieżdżony starter (GSP-2), tzn. starter powinien znajdować się 3' od GSP-1. Ten krok jest opcjonalny, ale wykonanie drugiego PCR z zagnieżdżonym starterem zwiększy wydajność i swoistość PCR dla interesującego genu. Startery używane do amplifikacji cDNA dSmad2 są wymienione w Tabeli 2.

2. Synteza cDNA

Ekstrahować RNA z próbek, stosując metodę ekstrakcji RNA lub zestaw zgodnie z protokołem producenta. Potraktuj próbki DNazą, aby uniknąć amplifikacji genomowego DNA. W naszym przykładzie wyekstrahowaliśmy RNA z 10 całych dorosłych muszek.
Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i w razie potrzeby dostosować wodą wolną od RNaz do maksimum 100 ng/μl.
Przygotuj cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji (RT), używając zestawu zalecanego do RACE. Przygotuj mieszankę wzorcową z następującymi odczynnikami na próbkę:
- 4 μl Bufor do odwrotnej transkrypcji (5x)
- 2 μl Oligo(dT)₂₀ starter (oligo składający się z 20 deoksytymidyn)
- 10 μl RNA (maks. 1 μg)
- 3 μl ddH₂O
- 1 μl odwrotnej transkryptazy
- RAZEM: 20 μl
Inkubować reakcję przez 90 minut w temperaturze 42 °C. Włączyć kontrolę ujemną z pominięciem odwrotnej transkryptazy.
Dezaktywuj odwrotną transkryptazę przez inkubację w temperaturze 85ºC przez 5 minut.
Aby rozcieńczyć poziom DNA w celu skutecznego PCR, dodaj 80 μl buforu TE, aby zwiększyć całkowitą objętość do 100 μl.

3. Amplifikacja fragmentów cDNA

Przygotuj pierwszą rundę amplifikacyjnej mieszanki PCR przy użyciu polimerazy Taq o wysokiej wierności (HF):
- 4 μl 5x bufor polimerazy HF Taq
- 0,4 μl mieszaniny dNTP (po 10 mM)
- 1 μl podkładu GSP1 (10 μM)
- 1 μl Oligo(dT)20 primer (10 μM)
- 1 μl matrycy cDNA
- 0,2 μl polimerazy HF Taq DNA
- 12,4 μl ddH2O
- Razem: 20 μl
Uruchom PCR za pomocą programu PCR1 (Tabela 1). Włączyć kontrolę ujemną, używając jako matrycy oryginalnego produktu RNA bez RT. Ponadto może być dołączona kontrola "bez podkładu".
Opcjonalnie: zagnieżdżony PCR w celu zwiększenia swoistości i ilości produktów cDNA. Rozcieńczyć 1 μl produktów PCR i kontroli ujemnej w stosunku 1:20 w buforze TE. Użyj ich jako szablonu dla drugiej reakcji PCR:
- 4 μl 5x bufor polimerazy HF Taq
- 0,4 μl mieszaniny dNTP (po 10 mM)
- 1 μl podkładu GSP2 (10 μM)
- 1 μl Oligo(dT)₂₀ primer (10 μM)
- 1 μl szablonu produktu PCR
- 0,2 μl polimerazy HF Taq DNA
- 12,4 μl ddH2O
- Razem: 20 μl
Uruchom drugi PCR za pomocą programu PCR2 (Tabela 1)

4. Izolacja fragmentów cDNA

Przygotuj 1-2% żel agarozowy z buforem TAE, używając bromku etydyny lub alternatywnego barwienia DNA.
Zmieszać 5 μl próbki z 1 μl 6x żelowego buforu ładującego.
Załaduj próbki i drabinkę DNA o pojemności 1 kb jako marker i uruchom żel pod napięciem 120 V przez około 45 minut lub do momentu, gdy przód barwnika znajdzie się w ~75% w dół żelu. Upewnij się, że w próbkach nie zabraknie żelu.
Sprawdź opaski żelowe pod lampą UV. Do dalszej obróbki produktów użyj promieniowania UV o niskiej intensywności, zlokalizuj wzmocnione pasma i odetnij je od żelu za pomocą skalpela.
Oczyść DNA z żelu za pomocą metody takiej jak zamrażanie lub zestaw.
Oczyszczone fragmenty cDNA należy przechowywać w temperaturze -20ºC lub natychmiast wykorzystać do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie lub klonowanie.

Overview

Loading...

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Pablo Sanchez Bosch², Sean Corcoran² i Katja Brückner^1,2,3
¹Eli i Edythe Szerokie Centrum Medycyny Regeneracji i Badań nad Komórkami Macierzystymi
²Zakład Biologii Komórki i Tkanki,
³Instytut Badań Sercowo-Naczyniowych, Uniwersytet Kalifornijski w San Francisco, San Francisco, Kalifornia, USA

Szybka amplifikacja końców cDNA (RACE) to technika, która umożliwia amplifikację cDNA o pełnej długości z mRNA poprzez rozszerzenie do końca 3' lub 5', nawet bez wcześniejszej znajomości sekwencji (Frohman i wsp., 1988). W przeciwieństwie do zwykłego PCR, wykorzystuje tylko jeden specyficzny starter PCR i drugi niespecyficzny starter, który bezkrytycznie wiąże się z większością mRNA. W zależności od tego, czy obszar do amplifikacji znajduje się na końcu 3' czy 5' mRNA, drugi starter jest wybierany do wiązania ogona polyA (koniec 3') lub syntetyczny łącznik dodawany do wszystkich transkryptów (koniec 5'). Wiadomo, że te kombinacje starterów dają "jednostronny" lub "zakotwiczony" PCR dzięki amplifikacji PCR przy użyciu znanej sekwencji jednej strony - 3' lub 5' (Ohara i wsp., 1989). Podejście to pozwala na wychwycenie rzadkich mRNA specyficznych dla genu, które w przeciwnym razie byłyby trudne do wykrycia, np. ze względu na ich stosunkowo niską ekspresję lub nieznaną pełną sekwencję (Frohman i wsp., 1988).

RACE jest inicjowany etapem odwrotnej transkrypcji (RT) w celu syntezy jednoniciowego komplementarnego DNA (cDNA) z mRNA. Następnie przeprowadzane są dwa kolejne PCR, które amplifikują fragmenty cDNA z genu będącego przedmiotem zainteresowania. Aby przeprowadzić RACE, sekwencja genu będącego przedmiotem zainteresowania musi być przynajmniej częściowo znana, ponieważ jest potrzebna do zaprojektowania starterów specyficznych dla genu (GSP; Frohman, 1994; Liu i Gorovsky, 1993). Ponieważ druga para starterów jest ogólnym starterem, który będzie się wyżarzał do wszystkich transkryptów obecnych w próbce, specyficzność reakcji PCR jest zmniejszona. RACE jest zatem idealnie wykonywany z dwoma zagnieżdżonymi PCR, aby zmniejszyć szanse na amplifikację niespecyficznych transkryptów (Figura 1). W zależności od kierunku wzmocnienia w stosunku do GSP, technika ta jest klasyfikowana jako 5' lub 3' RACE (rysunek 1).

3' RACE (Figura 1A) wykorzystuje ogon poli(A) obecny w mRNA jako ogólne miejsce wiązania dla niespecyficznego startera. Upraszcza to technikę, ponieważ można syntetyzować cDNA za pomocą starterów oligo (dT). GSP znajdują się w obszarze 5' transkrypcji. Ten wariant RACE umożliwia wykrywanie wariantów transkryptu i różnych 3' UTR (Scotto Lavino i wsp., 2007a). W 5' RACE (ryc. 1B) GSP znajdują się w regionie 3' genu. Aby móc użyć niespecyficznego startera, który wiąże się ze wszystkimi transkryptami, adapter, który służy jako ogólne miejsce wiązania startera, jest dołączony do końców 5' RNA. Aby przymocować adapter do mRNA, należy usunąć nasadkę 5', która chroni mRNA przed egzonukleazami i sprzyja translacji (Bird i wsp., 2016). W przeciwieństwie do 3' RACE, 5' RACE pomaga znaleźć różnicowe warianty spawów 5' i alternatywne 5' UTR (Scotto Lavino i in., 2007b).

Tutaj wykonamy 3' RACE, aby zidentyfikować i wyizolować różne warianty transkryptu przy użyciu znanej sekwencji 5' (Figura 2A) kodowanej przez gen Drosophila dSmad2 (Smox). dSmad2, białko Smad muchy, jest ważnym przetwornikiem sygnalizacji aktywiny-β, szlaku nadrodziny TGF-β. dSmad2 reguluje wiele procesów komórkowych, takich jak proliferacja komórek, apoptoza i różnicowanie (Upadhyay i wsp., 2017). Ponieważ różnie splicowane transkrypty dSmad2 mogą pełnić różne funkcje u dorosłej muchy, pierwszym krokiem w badaniu tych potencjalnych funkcji jest ocena wszystkich wariantów transkryptu dSmad2 na tym etapie rozwoju.

Procedure

Loading...

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Zestaw eksperymentalny dla 3' RACE

Zaprojektuj specyficzny dla 5' starter dla interesującego nas genu (gen-specific primer 1, GSP-1). Musi być bardzo konkretny, ponieważ jest to jedyny elementarz, który wprowadza konkretność. Dlatego preferowany byłby stosunkowo długi starter (typowa długość około 24 nukleotydów, Tm w zakresie 55-65°C).
Zaprojektuj drugi, zagnieżdżony starter (GSP-2), tzn. starter powinien znajdować się 3' od GSP-1. Ten krok jest opcjonalny, ale wykonanie drugiego PCR z zagnieżdżonym starterem zwiększy wydajność i swoistość PCR dla interesującego genu. Startery używane do amplifikacji cDNA dSmad2 są wymienione w Tabeli 2.

2. Synteza cDNA

Ekstrahować RNA z próbek, stosując metodę ekstrakcji RNA lub zestaw zgodnie z protokołem producenta. Potraktuj próbki DNazą, aby uniknąć amplifikacji genomowego DNA. W naszym przykładzie wyekstrahowaliśmy RNA z 10 całych dorosłych muszek.
Zmierzyć stężenie RNA za pomocą spektrofotometru mikroobjętościowego i w razie potrzeby dostosować wodą wolną od RNaz do maksimum 100 ng/μl.
Przygotuj cDNA w reakcji odwrotnej transkrypcji (RT), używając zestawu zalecanego do RACE. Przygotuj mieszankę wzorcową z następującymi odczynnikami na próbkę:
- 4 μl Bufor do odwrotnej transkrypcji (5x)
- 2 μl Oligo(dT)₂₀ starter (oligo składający się z 20 deoksytymidyn)
- 10 μl RNA (maks. 1 μg)
- 3 μl ddH₂O
- 1 μl odwrotnej transkryptazy
- RAZEM: 20 μl
Inkubować reakcję przez 90 minut w temperaturze 42 °C. Włączyć kontrolę ujemną z pominięciem odwrotnej transkryptazy.
Dezaktywuj odwrotną transkryptazę przez inkubację w temperaturze 85ºC przez 5 minut.
Aby rozcieńczyć poziom DNA w celu skutecznego PCR, dodaj 80 μl buforu TE, aby zwiększyć całkowitą objętość do 100 μl.

3. Amplifikacja fragmentów cDNA

Przygotuj pierwszą rundę amplifikacyjnej mieszanki PCR przy użyciu polimerazy Taq o wysokiej wierności (HF):
- 4 μl 5x bufor polimerazy HF Taq
- 0,4 μl mieszaniny dNTP (po 10 mM)
- 1 μl podkładu GSP1 (10 μM)
- 1 μl Oligo(dT)20 primer (10 μM)
- 1 μl matrycy cDNA
- 0,2 μl polimerazy HF Taq DNA
- 12,4 μl ddH2O
- Razem: 20 μl
Uruchom PCR za pomocą programu PCR1 (Tabela 1). Włączyć kontrolę ujemną, używając jako matrycy oryginalnego produktu RNA bez RT. Ponadto może być dołączona kontrola "bez podkładu".
Opcjonalnie: zagnieżdżony PCR w celu zwiększenia swoistości i ilości produktów cDNA. Rozcieńczyć 1 μl produktów PCR i kontroli ujemnej w stosunku 1:20 w buforze TE. Użyj ich jako szablonu dla drugiej reakcji PCR:
- 4 μl 5x bufor polimerazy HF Taq
- 0,4 μl mieszaniny dNTP (po 10 mM)
- 1 μl podkładu GSP2 (10 μM)
- 1 μl Oligo(dT)₂₀ primer (10 μM)
- 1 μl szablonu produktu PCR
- 0,2 μl polimerazy HF Taq DNA
- 12,4 μl ddH2O
- Razem: 20 μl
Uruchom drugi PCR za pomocą programu PCR2 (Tabela 1)

4. Izolacja fragmentów cDNA

Przygotuj 1-2% żel agarozowy z buforem TAE, używając bromku etydyny lub alternatywnego barwienia DNA.
Zmieszać 5 μl próbki z 1 μl 6x żelowego buforu ładującego.
Załaduj próbki i drabinkę DNA o pojemności 1 kb jako marker i uruchom żel pod napięciem 120 V przez około 45 minut lub do momentu, gdy przód barwnika znajdzie się w ~75% w dół żelu. Upewnij się, że w próbkach nie zabraknie żelu.
Sprawdź opaski żelowe pod lampą UV. Do dalszej obróbki produktów użyj promieniowania UV o niskiej intensywności, zlokalizuj wzmocnione pasma i odetnij je od żelu za pomocą skalpela.
Oczyść DNA z żelu za pomocą metody takiej jak zamrażanie lub zestaw.
Oczyszczone fragmenty cDNA należy przechowywać w temperaturze -20ºC lub natychmiast wykorzystać do dalszych zastosowań, takich jak sekwencjonowanie lub klonowanie.

Log in or to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Transcript

Loading...

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zazwyczaj w przypadku nowych mRNA znana jest tylko część jego pełnej sekwencji. Brakujące sekwencje nukleotydowe na końcach mRNA można określić za pomocą metody opartej na PCR zwanej szybką amplifikacją końców cDNA lub RACE.

U eukariontów dojrzałe mRNA mają charakterystyczne cechy strukturalne na obu końcach. Na końcu pięciu pierwszych większość z nich ma metylowaną resztę guanozyny połączoną z mRNA za pośrednictwem wiązania trifosforanowego od pięciu do pięciu pierwszych. Jest to również znane jako czapka z pięcioma liczbami pierwszymi. Na trzecim końcu większość eukariontów ma ogon składający się z 20 do 250 reszt adenylowych, zwany ogonem poli(A).

Teraz, jeśli sekwencja nukleotydowa nawet małego segmentu jest znana w dowolnym miejscu mRNA, sekwencja do jej trzech pierwszych końców może być amplifikowana za pomocą startera specyficznego dla genu i niespecyficznego startera oligo(dT), który wyżarza się do ogona poli(A) na końcu trzech pierwszych. Ten podzbiór techniki RACE nazywa się three-prime RACE i pozwala na wykrywanie wariantów transkryptu i różnych trzech pierwszych regionów nieulegających translacji (UTR).

Sekwencja na końcu pięciu liczb pierwszych może być wzmocniona w podobny sposób. Aby to zrobić, najpierw mocuje się ogon poli(A) na końcu pięcioma pierwszymi. Następnie, używając niespecyficznego startera oligo(dT), który wyżarza się do dołączonego ogona, i startera specyficznego dla genu, sekwencja do końca pięciu liczb pierwszych może zostać amplifikowana. Ten podzbiór RACE jest znany jako five-prime RACE i służy do znajdowania różnicowych wariantów spawów z pięcioma liczbami pierwszymi i alternatywnych pięciokrotnych UTR.

Aby wykonać tri-prime RACE w celu zidentyfikowania różnych transkryptów kodowanych przez dany gen, RNA jest najpierw izolowane z organizmu lub tkanki będącej przedmiotem zainteresowania. Następnie cDNA jest syntetyzowane z wyizolowanych mRNA z reakcją odwrotnej transkrypcji, która wykorzystuje starter oligo(dT) i enzym odwrotnej transkryptazy, który generuje komplementarne DNA z matrycy RNA. Następnie, z wygenerowanej puli cDNA, nieznany trójgłówny koniec docelowego cDNA jest rozszerzany za pomocą PCR, wykorzystując niespecyficzny starter oligo(dT) i starter specyficzny dla genu, a następnie amplifikowany podczas reakcji PCR.

Jednak ze względu na ogólny charakter niespecyficznego startera i losowe błędne torbowanie przez starter specyficzny dla genu, mogą one wygrzewać się do niedocelowych cDNA, powodując również ich amplifikację. Aby przezwyciężyć ten problem, przeprowadza się drugą rundę PCR przy użyciu zagnieżdżonych starterów, które wiążą się za pierwszym zestawem starterów. Ten drugi zestaw starterów dodatkowo amplifikuje interesujące nas cDNA, ale nie produkt niespecyficzny, zwiększając specyficzność i wydajność reakcji.

Na koniec produkty PCR są rozdzielane za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym, która oddziela różne transkrypty genu docelowego na podstawie ich rozmiarów, tworząc wyraźne prążki. Pasmo zainteresowania można następnie wyciąć, oczyścić i ostatecznie zsekwencjonować, aby uzyskać pełną sekwencję transkrypcji.

W tym filmie zademonstrujemy technikę trzech liczb głównych RACE w celu identyfikacji i wyizolowania różnych transkryptów kodowanych przez gen Drosophila dSmad2.

Przed rozpoczęciem syntezy i amplifikacji cDNA użyj oprogramowania do projektowania starterów, aby stworzyć pięciokrotny specyficzny starter dla interesującego nas genu, w tym przykładzie dSmad2. Aby zapewnić wysoką specyficzność startera, powinien mieć około 24 nukleotydów i Tm w zakresie od 55 do 65 stopni Celsjusza. Następnie zaprojektuj drugi zagnieżdżony starter znajdujący się trzy razy od pierwszego startera, który jest również specyficzny dla sekwencji docelowej.

Na początek wyekstrahuj RNA z 10 całych dorosłych much za pomocą dostępnego w handlu zestawu do ekstrakcji RNA. Po wyekstrahowaniu RNA ponownie zawieś osad w 20 mikrolitrach wody wolnej od nukleaz. Aby uzyskać reakcję o pojemności 50 mikrolitrów, dodaj 5 mikrolitrów buforu reakcyjnego do każdej probówki z próbką i zwiększ objętość reakcji, dodając 24 mikrolitry wody wolnej od nukleaz. Następnie dodaj 1 mikrolitr DNazy I, aby zapobiec amplifikacji genomowego DNA. Na koniec inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut.

Po leczeniu DNazą należy inaktywować enzym za pomocą 1 mikrolitra 25-milimolowego EDTA w każdej z probówek. Dodaj próbkę do kolumny wirowej, aby oczyścić RNA. Następnie użyj spektrofotometru mikroobjętościowego, aby zmierzyć stężenie RNA. Dostosuj stężenie do 100 nanogramów na mikrolitr, dodając wodę wolną od nukleaz.

Teraz przygotuj mieszankę wzorcową do reakcji odwrotnej transkrypcji. Oprócz badanych próbek DNA należy uwzględnić jedną kontrolę ujemną poprzez pominięcie odwrotnej transkryptazy z odpowiedniej probówki. Inkubować reakcje przez 90 minut w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Następnie dezaktywuj odwrotną transkryptazę, inkubując probówki w temperaturze 85 stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie rozcieńczyć poziomy DNA, dodając 80 mikrolitrów buforu TE do każdej probówki, aby doprowadzić całkowitą reakcję do 100 mikrolitrów.

Teraz, gdy cDNA jest zsyntetyzowane, amplifikuj interesujący Cię gen za pomocą PCR. Aby to zrobić, najpierw przygotuj pierwszą rundę amplifikacji PCR mix. Oprócz matrycy cDNA należy uwzględnić reakcję kontroli ujemnej, która wykorzystuje matrycę z produktu bez odwrotnej transkrypcji, a także reakcję, która nie ma startera specyficznego dla genu jako kontroli bez startera.

Po przygotowaniu reakcji należy przeprowadzić amplifikacje PCR w termocyklerze wyposażonym w podgrzewaną pokrywę. Następnie rozcieńczyć produkty od 1 do 20, dodając 1 mikrolitr produktów PCR do 19 mikrolitrów buforu TE. Używając tych rozcieńczonych produktów, przygotuj drugą rundę amplifikacji PCR. Następnie użyj termocyklera, aby uruchomić drugi PCR.

Aby wyizolować fragmenty PCR, przygotuj 1% żel agarozowy, dodając 1 gram agarozy na 100 mililitrów buforu TAE. Rozpuść mieszaninę przez dwie minuty w kuchence mikrofalowej, a następnie dodaj barwnik SYBR Safe lub bromek etydyny. Wlej stopioną mieszaninę do tacki na żel i pozwól jej stężeć.

Podczas gdy żel twardnieje, odpipetuj 1 mikrolitrowe kropelki 6X Loading Dye na kawałek parafilmu odpowiadający liczbie próbek. Dodaj 5 mikrolitrów próbki do każdej kropli. Teraz załaduj próbki wraz z drabinką DNA o długości 1 kilozasady na żel. Uruchom żel pod napięciem 120 V przez około 45 minut lub do momentu, gdy przód barwnika znajdzie się w 75% w dół żelu.

Gdy żel zakończy działanie, sprawdź opaski żelowe pod transilluminatorem UV. Zlokalizuj opaski i wytnij je za pomocą skalpela. Oczyść fragmenty cDNA za pomocą dostępnego w handlu zestawu kolumn wirowych. Po oczyszczeniu fragmenty cDNA mogą być przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza lub natychmiast wykorzystane do dalszej analizy.

Przed tym eksperymentem dwa transkrypty dla Drosophila dSmad2 zostały oznaczone w genomowej bazie danych Drosophila, FlyBase. Opierając się na oczekiwanym splicingu tego genu, dwa produkty powinny zostać zidentyfikowane za pomocą protokołu three-prime RACE.

Wyniki tego eksperymentu ujawniają jednak trzy różne transkrypty dla dSmad2. Wśród przewidywanych produktów jeden transkrypt jest dominujący, a jeden ulega ekspresji na niższym poziomie. Ponadto wykryto wcześniej nieopisany mniejszy produkt, widoczny w 750 parach zasad.

Learning Objectives

Questions that this video will help you answer

Explore More Videos

Rapid Amplification Of CDNA Ends

PCR based Method

Nucleotide Sequences

Three prime End

Gene specific Primer

Non specific Oligo dT Primer

Three prime RACE

Transcript Variants

Three prime Untranslated Regions UTRs

Five prime RACE

Five prime Splice Variants

Alternative Five prime UT