Magnetyczny system wiązania do badania kontroli lotu zapośredniczonej przez wzrok i węch u Drosophila

Rozwijająca się dziedzina węchu owadów doprowadziła do opracowania coraz bardziej zaawansowanych testów behawioralnych, takich jak aparat do magnetycznego wiązania węchowego, czyli OMT. Procedura ta polega na przyklejeniu grzbietowej części klatki piersiowej muchy do szpilki mnuchin. Mucha zostaje zawieszona pod kątem 30 stopni z odpowiednio ustawioną szpilką, a następnie wyrównana pomiędzy dwoma magnesami ziemiami rzadkimi.

Prawidłowe wykonanie tej czynności zapewni swobodę ruchu. Następnie ustawia się port zapachowy tak, aby wytworzona struga zapachowa przechodziła płynnie z dyszy doprowadzającej nad głową muchy do komory próżniowej. Następnie w obecności bodźców wzrokowych testuje się zdolność muchy do lokalizacji substancji zapachowej.

Witajcie, jestem Brian DeMars z laboratorium dr. Marka Fry’ego w Katedrze Nauk Fizjologicznych na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. Dzisiaj pokażemy wam, jak przymocowywać muchy do aparatury magnetycznej do badań węchowych. Pokażemy również, jak wyrównać magnesy oraz porty zapachowe i jak ustawić natężenie przepływu masy w systemie dostarczania zapachów.

W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania kontroli lotu za pośrednictwem wzroku i węchu u muszek owocówek. Przejdźmy zatem do pracy. Aby rozpocząć unieruchamianie, należy zebrać muszki od czterech do sześciu dni po wykluciu (ELOs) i poddać je głodzeniu przez cztery do sześciu godzin.

Do fiolki z pożywką zawierającej wilgotną chusteczkę Kim wipe, aby zapobiec wysychaniu, przenieś partię zaznaczonych much do małej fiolki umieszczonej w mosiężnym bloku na chłodni Peltier ustawionej na 4 °C. W tej temperaturze muchy zostaną znieczulone w ciągu około 30 sekund.

Umieść chusteczkę Kim wipe na górnej części chłodzonej platformy, aby absorbować wilgoć. Następnie umieść znieczulone muchy na platformie w celu sortowania i wybierz największe samice do unieruchomienia (tethering). Za pomocą cienkiego pędzelka przesuń pojedynczą muchę na pozycję w specjalnie zbudowanym sarkofagu, którego kształt jest dostosowany do pojedynczej samicy muszki owocówki typu dzikiego.

Teraz należy użyć mikroskopu, aby upewnić się, że mucha jest prawidłowo ułożona stroną grzbietową do góry. Przednia część muchy powinna być skierowana w stronę badacza, a tylna w przeciwną stronę. Następnie należy ustawić szpilkę Minuchin z prętem magnetycznym zamontowanym na mikromanipulatorze.

Szpilka powinna być ustawiona tak, aby jej tępy koniec był skierowany w stronę grzbietowej części klatki piersiowej muchy. Znajduje się ona tuż za głową, pomiędzy obiema skrzydłami. Mucha powinna być prawidłowo ustawiona na szpilce wzdłuż trzech osi.

Kąty pochylenia, przechyłu i odchylenia – szpilka powinna być idealnie pionowa podczas oglądania z przodu, w stronę oczu; nie można dopuścić nawet niewielkiego przechyłu między muchą a szpilką. Kąt widoku z boku między szpilką a osią długą ciała lub kąt pochylenia powinien wynosić 30 stopni w górę względem horyzontu. Należy pamiętać, że szpilka może wymagać przycięcia w celu optymalnego działania uwięzi.

Będzie to zależeć od odległości między magnesami zawieszenia. Po wyrównaniu pinu Mnuchina, za pomocą cienkiego stalowego drutu nanieś małą kroplę kleju utwardzanego promieniami UV na tępy koniec pinu Mnuchina. Następnie manipuluj pinem tak, aby kropla kleju dotknęła przedplecza muchy tuż nad głową.

Należy uważać, aby nie użyć zbyt dużej ilości kleju. Przy odpowiedniej wielkości kropli klej powinien lekko wypuklić się i spłynąć z pinezki na klatkę piersiową. Następnie utwardź klej za pomocą dwóch 22-sekundowych impulsów światła UV.

Po zakończeniu unieruchomienia, za pomocą pincety podaj mały kwadratowy ręcznik papierowy Kim wipe do każdej muchy, wykorzystując jej instynktowny odruch lądowania. Muchy uchwycą ręczniki papierowe. Po godzinie odpoczynku unieruchomione muchy są gotowe do eksperymentów.

Aby uzyskać płynny zakres ruchu o 360 stopni, kluczowe jest prawidłowe ustawienie magnesów. W tym celu należy trzymać magnetyczne pierścienie dolne poziomo za pomocą plastikowej tulei i umieścić je bezpośrednio na przezroczystej komorze próżniowej. Górny magnes prętowy jest zamocowany pionowo około trzech czwartych cala nad magnesami dolnymi, a do dolnej powierzchni magnesu górnego za pomocą epoksydowego kleju przytwierdzone jest podwójne łożysko V.

Pozwoli to na ustandaryzowanie położenia much i zminimalizowanie tarcia rotacyjnego. Należy pamiętać, że magnesy te mogą być niebezpieczne, a niewłaściwe użytkowanie może doprowadzić do uszkodzenia sprzętu lub lekkich obrażeń ciała. Następnie należy wstępnie wyrównać górny i dolny magnes wizualnie.

Umieszczając górny magnes prętowy bezpośrednio nad punktem centralnym dolnych magnesów pierścieniowych, warto przymocować górny magnes do mikromanipulatora w celu precyzyjnej regulacji. Teraz należy umieścić muchę w arenie i dostosować poziomą oraz pionową pozycję górnego magnesu, aż mucha będzie mogła płynnie i stabilnie obracać się o 360 stopni; na początku każdego eksperymentu należy sprawdzić, czy każda mucha obraca się płynnie, aby upewnić się, że magnesy są odpowiednio wyrównane, a piny mnuchina nie są uszkodzone. Jeśli ustawienie jest nieprawidłowe, mucha może w ogóle nie obracać się.

Mucha może mieć ograniczony zakres ruchu lub obracać się z niezmienną prędkością. Może to wynikać z problemów z przyklejeniem, co można sprawdzić, obracając przed muchą pasiastą siatkę w celu wywołania odpowiedzi omo. Jeśli mucha nie obraca się lub robi to w sposób niespójny, należy zastąpić ją innym okazem.

Jeśli mucha nie obraca się prawidłowo i problemy te występują u każdej muchy, prawdopodobną przyczyną jest niewłaściwe ustawienie magnesów i konieczna będzie dalsza regulacja w celu uzyskania stabilnego zapachu. Śledzenie wstępnej konfiguracji systemu zapachowego wymaga poprowadzenia rurek teflonowych o wąskiej średnicy od multipleksera gazu do wykonanych na zamówienie fiolek z wodnym roztworem zapachowym. Wylot z tych fiolek powinien być połączony bezpośrednio z rurkami portów hipodermicznych za pomocą tych samych rurek teflonowych.

Następnie pod areną umieszcza się przezroczystą akrylową komorę próżniową, aby podtrzymać magnesy. Należy użyć szklanej rurki o średnicy czterech milimetrów, zamontowanej pod muchą i połączonej z komorą próżniową, aby zbliżyć otwór próżniowy do muchy i zmniejszyć średnicę otworu. Teraz za pomocą pęsety należy umieścić przywiązaną muchę w arenie.

Gdy mucha znajdzie się na miejscu, włącz wabiący zapach. Można wizualnie sprawdzić, czy mucha kieruje się w stronę otworu zapachowego po włączeniu zapachu. Jeśli mucha nie wykazuje preferencji wobec zapachu, należy zoptymalizować OMT metodą prób i błędów.

Aby to zrobić, należy najpierw dostosować położenie portu zapachowego, aż mucha zacznie podążać za zapachem. W tym przypadku porty zapachowe są zamontowane na mikromanipulatorach i ustawione 4 mm grzbietowo oraz 3 mm przednio względem głowy muchy. Jeśli zmiana położenia portu zapachowego nie poprawia śledzenia zapachu, należy dostosować natężenie przepływu masy, aż mucha zacznie podążać za zapachem.

Stosujemy ustawienia wynoszące 7 mL/min. Jeśli regulacja masowego natężenia przepływu nie poprawi śledzenia zapachu, należy regulować natężenie przepływu próżni, aż mucha zacznie śledzić zapach. Natężenie przepływu próżni ustawiliśmy na 13 L/min za pomocą regulatora przepływu.

Po ustawieniu pozycji portu i szybkości przepływu należy okresowo przełączać się między podawaniem pary wodnej a pary zapachowej, korzystając z przełączalnego multipleksera gazowego. Przy prawidłowej konfiguracji aparatury powinny zostać zaobserwowane dwa zjawiska. Po pierwsze, pod wpływem stałych, obrotowych bodźców wizualnych, przymocowana mucha umieszczona w OMT powinna płynnie obracać się o 360 stopni w pionowej osi ya. Po drugie, szarpane obroty, zwane kos, są charakterystyczne dla spontanicznego zachowania obrotowego w przypadku braku stałych bodźców wizualnych.

Jeśli muchy nie mogą obracać się płynnie, przyczyną może być niewłaściwe przyklejenie lub źle dopasowane magnesy. Po drugie, należy upewnić się, że po włączeniu zapachu mucha kieruje się w stronę portu zapachowego. Po wyłączeniu zapachu mucha powinna poruszać się spontanicznie, nie wykazując preferencji do żadnej pozycji w arenie.

Jeśli muchy nie śledzą aktywnie pióropusza zapachowego, może to oznaczać konieczność skorygowania położenia wylotu zapachowego, natężenia przepływu powietrza i/lub natężenia przepływu próżni. Przedstawiliśmy właśnie sposób przytwierdzania muchy do wykorzystania w magnetycznym aparacie do badań węchowych. Pokazaliśmy również, jak prawidłowo wyrównać magnesy oraz wyloty zapachowe, a także jak ustawić masowe natężenia przepływu w systemie podawania zapachu.

To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.