Name: System magnetycznej linki do badania wizualnej i węchowej kontroli lotu u Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-11-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 27 s
Description: Poznaj system magnetycznej linki do badania zachowań węchowych u Drosophila. Ta metoda umożliwia precyzyjną analizę śledzenia zapachów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie zapewnione przez National Science Foundation (M.F.).

Wstęp
OMT jest adaptacją magnetycznego systemu przywiązywania [1], zaprojektowaną w celu włączenia „wirtualnego symulatora pióropusza zapachowego”. Poniższe protokoły wyjaśnią, jak prawidłowo przywiązywać muchy (Część 1), oraz przedstawią strategie konfiguracji magnesów (Część 2) i systemu dostarczania zapachów z regulowanym przepływem masy (Część 3). Opisane tutaj informacje są zoptymalizowane pod kątem tego konkretnego systemu i mogą różnić się w przypadku komponentów o innych specyfikacjach technicznych.
Część 1: Uwiązanie much
Opisane tutaj etapy przymocowania są podobne do wielu wcześniejszych badań [2], lecz zostały dostosowane do zastosowania w OMT [3]. Prawidłowe przymocowanie jest kluczowe dla zapewnienia rzetelnych i powtarzalnych prób doświadczalnych. Znaczenia starannego przymocowania nie można przecenić.
<ol>
	<li>zebrać muchy 4-6 dni po wykluciu i poddać je głodzeniu przez 4-6 godzin. W fiolce bez pożywki umieścić zwilżony wodą ręcznik Kimwipe, aby zapobiec wysychaniu.</li>
	<li>przenieść partię much z butelki do małej fiolki i włożyć ją do mosiężnego bloku na platformie chłodzącej Peltiera ustawionej na około 4°C. Odpowiednia temperatura znieczula muchy w ciągu około 30 sekund.</li>
	<li>posegregować muchy na zimnej powierzchni platformy chłodzącej. Wilgotny ręcznik Kimwipe zapewnia stałe chłodzenie i odprowadzanie wilgoci z kutykuli. Wybrać największe samice do unieruchomienia (tethering).</li>
	<li>za pomocą cienkiego pędzelka przesunąć pojedynczą muchę do pozycji w specjalnie zbudowanym sarkofagu, dostosowanym do rozmiarów jednej samicy muszki owocówki typu dzikiego. 
	<img alt="Diagram równowagi statycznej z siłami obrotowymi; koncepcje ΣFx=0, MA=0 w badaniu fizyki." src="/files/ftp_upload/old/1063_2008_11_26_2/1063_Figure-01_thumb.png" data-altupdatedat="1787630408000"> 
	Rycina 1. 
	<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/old/1063_2008_10_28_1/1063_Figure-01.png">Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję ryciny.</a></li>
	<li>umieścić szpilkę minutien (Fines Science Tools) z prętem magnetycznym zamontowanym na mikromanipulatorze. Szpilka powinna być ustawiona tak, aby tępy koniec dotykał grzbietowej strony klatki piersiowej tuż za głową, pomiędzy skrzydłami. Patrząc od przodu na oczy, szpilka powinna być idealnie pionowa. Niedopuszczalne jest nawet niewielkie odchylenie (roll) między muchą a szpilką. Kąt widoku z boku między szpilką a długą osią ciała powinien wynosić 30 stopni w górę względem poziomu (Ryc. 1). Uwaga: Dla optymalnego działania w uchwycie magnetycznym szpilki mogą wymagać skrócenia. Zależy to całkowicie od odległości między magnesami zawieszenia.</li>
	<li>po ustawieniu szpilki minutien, za pomocą cienkiego stalowego drutu nanieść małą kroplę kleju aktywowanego promieniami UV (ElectroLite Corp) na tępy koniec szpilki.</li>
	<li>manipulować szpilką tak, aby kropla kleju dotknęła klatki piersiowej muchy tuż nad głową. Przy odpowiedniej wielkości kropli klej powinien stopić się i spłynąć z szpilki na klatkę piersiową. Należy uważać, aby nie użyć zbyt dużej ilości kleju.</li>
	<li>utwardzić klej za pomocą dwóch 20-sekundowych impulsów światła UV.</li>
	<li>odłożyć unieruchomioną muchę i powtórzyć czynność. Wyciąć małe kwadraty z ręcznika Kimwipe i za pomocą pęsety podać jeden każdej unieruchomionej muszce, aby ograniczyć jej lot.</li>
	<li>po godzinie regeneracji unieruchomione muchy są gotowe do eksperymentów.</li>
	<li>nieprawidłowe przyklejenie może utrudnić zdolność muchy do funkcjonowania w arenie magnetycznej. Każda mucha powinna zostać sprawdzona pod kątem płynności obrotu na początku każdego eksperymentu, aby upewnić się, że są one prawidłowo przyklejone. Można to osiągnąć poprzez obracanie wzoru paskowego o dostatecznie dużym okresie przestrzennym, aby wywołać silne odpowiedzi optomotorowe [4]. Jeśli mucha jest przyklejona pod złym kątem nachylenia lub jest pochylona na szpilce względem osi obrotu, mucha może (i) w ogóle się nie obracać, (ii) mieć ograniczony zakres ruchu lub (iii) obracać się z niestabilną prędkością. W powyższych przypadkach mucha powinna zostać odrzucona i zastąpiona nowym osobnikiem. Jeśli to rozwiąże problem, najprawdopodobniej wynikało on z nieprawidłowego przyklejenia. (jeśli wymiana muchy nie rozwiązuje problemu, należy przejrzeć Część 2.4)</li>
</ol>
Część 2: Wyrównywanie magnesów
Prawidłowe wyrównanie magnesów (Rare-earth-magnets.com) jest niezbędne, aby mucha mogła uzyskać płynny zakres ruchu o 360 stopniach. Wykonaj poniższe kroki, aby odpowiednio wyrównać magnesy.
<ol>
	<li>Dolne magnesy pierścieniowe są utrzymywane poziomo przez plastikową tuleję i umieszczone bezpośrednio na przejrzystej komorze próżniowej (Ryc. 1; opisano szczegółowo w części 3). Górny magnes prętowy jest zamocowany pionowo około 3/4" powyżej dolnych magnesów.</li>
	<li>Wstępnie ustaw górny i dolny magnesy wizualnie, umieszczając górny magnes prętowy bezpośrednio nad punktem centralnym dolnych magnesów pierścieniowych. W celu precyzyjnej regulacji warto przymocować górny magnes do mikromanipulatora (Siskiyou Inc.).</li>
	<li>Przyklej za pomocą epoksydu łożysko V-jewel (Small Parts) do dolnej powierzchni górnego magnesu, aby zminimalizować tarcie obrotowe i ustandaryzować pozycjonowanie muchy.</li>
	<li>Umieść muchę w arenie i dostosuj poziome oraz pionowe położenie górnego magnesu, aż mucha będzie mogła płynnie i stabilnie obracać się o 360 stopni w osi odchylenia (yaw axis). Każdą muchę należy sprawdzić pod kątem płynnego obrotu na początku każdego eksperymentu, aby upewnić się, że magnesy są prawidłowo ustawione, a poszczególne piny minutien nie są uszkodzone (patrz Część 1.11). Jeśli magnesy nie są prawidłowo ustawione, mucha może (i) w ogóle się nie obracać (ii) mieć ograniczony zakres ruchu (iii) obracać się z niestabilną prędkością. Jeśli problem zostanie rozwiązany poprzez zastąpienie muchy nowym okazem, najprawdopodobniej wynikało to z błędu w klejeniu (patrz Część 1). Jeśli problemy te występują przy każdej musze, prawdopodobnie jest to kwestia ustawienia magnesów i wymagana będzie dalsza regulacja.</li>
	<li>Ostrzeżenie: choć zabawa z magnesami ziemskimi może być interesująca, są one bardzo niebezpieczne. Niewłaściwe użytkowanie prowadzi do uszkodzenia sprzętu i/lub lekkich obrażeń ciała. Zachowaj szczególną ostrożność w obchodzeniu się z tymi kuszącymi, lecz często niedocenianymi magnesami.</li>
</ol>
Część 3: Dostarczanie zapachów
<ol>
	<li>System dostarczania zapachu opiera się na rozwiązaniu opisanym wcześniej [5] i jest najtrudniejszym elementem do zoptymalizowania (Rys. 1). Wymaga on dużej cierpliwości oraz metody prób i błędów. Wykonaj poniższe kroki, aby uzyskać stabilne śledzenie zapachu.</li>
	<li>Wstępna konfiguracja systemu zapachowego wymaga poprowadzenia teflonowych rurek o małej średnicy (Small Parts) z multipleksera gazowego (Sable Systems International) do specjalnie wykonanych fiolek z wodą/zapachem. Wyloty tych fiolek łączą się bezpośrednio z rurkami portu hipodermicznego za pomocą tych samych teflonowych rurek.</li>
	<li>Przezroczysta akrylowa komora próżniowa jest umieszczona pod areną, aby podtrzymywać magnesy. Stosujemy zamontowaną pod muchą szklaną rurkę o średnicy 4mm, połączoną z komorą próżniową, aby zbliżyć otwór próżniowy do muchy i zmniejszyć średnicę otworu.</li>
	<li>Za pomocą pęsety umieść przymocowaną muchę na arenie.</li>
	<li>Włącz atrakcyjny zapach (dobrze sprawdza się ocet jabłkowy) i wizualnie zweryfikuj, czy mucha śledzi zapach. Jeśli mucha nie wykazuje preferencji wobec zapachu, wykonaj kolejne trzy kroki. Może to wymagać użycia kilku much i przeprowadzenia kilku prób.</li>
	<li>Reguluj położenie portu zapachowego, aż mucha zacznie śledzić zapach. Porty zapachowe zamontowaliśmy na mikromanipulatorach (Siskiyou Inc.) i ustawiliśmy 4mm grzbietowo oraz 3mm przed głową muchy.</li>
	<li>Reguluj masowe natężenie przepływu, aż mucha zacznie śledzić zapach. Nasze ustawienia to 7ml/min (Sable Systems International MFC-4).</li>
	<li>Reguluj natężenie przepływu próżni, aż mucha zacznie śledzić zapach. Natężenie przepływu próżni ustawiliśmy na 13l/min, korzystając z regulatora przepływu (Cole Parmer). Uwaga: Budynkowe linie doprowadzające próżnię mogą ulegać wahaniom w czasie, co powoduje zmiany w strukturze pióropusza zapachowego. W celu zapewnienia stałych warunków przepływu próżni warto podłączyć zewnętrzną pompę próżniową do regulatora przepływu.</li>
	<li>Po ustawieniu pozycji portu i natężeń przepływu, okresowo przełączaj się między dostarczaniem pary wodnej a parą zapachową za pomocą multipleksera gazowego i wizualnie weryfikuj, czy mucha śledzi zapach tylko wtedy, gdy jest on podawany. Czasami pozostałości zapachu wewnątrz portu zapachowego mogą wywoływać śledzenie zapachu po jego wyłączeniu. Można to wyeliminować bez usuwania prawidłowo ustawionego portu zapachowego, wypełniając rurki hipodermiczne etanolem i zbierając go na końcu doprowadzającym za pomocą chusteczki Kimwipe. Używając sprężonego powietrza, wydmuchaj pozostały etanol i wznowij eksperymenty.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Przy prawidłowym wykonaniu tych kroków należy zaobserwować dwie rzeczy. Po pierwsze, podczas stałej stymulacji wizualnej rotacyjnej, mucha unieruchomiona w OMT powinna płynnie obracać się o 360 stopni w osi odchylenia (yaw). „Szarpane” obroty (zwane sakadami) są charakterystyczne dla spontanicznego zachowania obrotowego w przypadku braku stałych bodźców wizualnych. Jeśli muchy najwyraźniej nie potrafią obracać się płynnie, przyczyną może być niewłaściwe przyklejenie (patrz Część 1) lub źle ustawione magnesy (patrz Część 2). Po drugie, po włączeniu zapachu mucha powinna skierować się w stronę źródła zapachu. Po wyłączeniu zapachu mucha powinna wykonywać spontaniczne sakady, nie wykazując preferencji do żadnej konkretnej pozycji w arenie. Jeśli muchy nie śledzą aktywnie pióropusza zapachowego, konieczna może być korekta położenia wlotu zapachu, natężenia przepływu powietrza i/lub natężenia przepływu próżni (patrz Część 3).

<ol><li>Bender, J. A., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+stimulation+of+saccades+in+magnetically+tethered+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Visual stimulation of saccades in magnetically tethered Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 209, 3170-3182 (2006).</li>
<li>Tammero, L. F., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collision-avoidance+and+landing+responses+are+mediated+by+separate+pathways+in+the+fruit+fly%2C+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Collision-avoidance and landing responses are mediated by separate pathways in the fruit fly, Drosophila melanogaster.</a> J. Exp. Biol. 205, 2785-2798 (2002).</li>
<li>Duistermars, B. J., Frye, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crossmodal+visual+input+for+odor+tracking+during+fly+flight%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Crossmodal visual input for odor tracking during fly flight.</a> Curr. Biol. 18, 270-275 (2008).</li>
<li>Reiser, M. B., Dickinson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+display+system+for+insect+behavioral+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">A modular display system for insect behavioral neuroscience.</a> J. Neurosci. Methods. 167, 127-139 (2008).</li>
<li>Frye, M. A., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+output+reflects+the+linear+superposition+of+visual+and+olfactory+inputs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Motor output reflects the linear superposition of visual and olfactory inputs in Drosophila.</a> J. Exp. Biol. 207, 123-131 (2004).</li>
</ol>

Przywiązanie much i wywołanie stabilnego śledzenia zapachu w tej arenie jest stosunkowo proste. Wymaga to jednak praktyki, cierpliwości oraz metody prób i błędów. Wiele elementów tej areny można dodatkowo zoptymalizować lub zastąpić, aby uzyskać warianty o innym potencjale eksperymentalnym. Na przykład nowsze wersje komory próżniowej są znacznie mniejsze i zapewniają więcej miejsca pod areną. Ponadto można nieco zmieniać siłę i rodzaj magnesów ziem rzadkich oraz dodać dodatkowe porty zapachowe, aby zwiększyć liczbę rodza...

<table><tbody><tr><td>Stopień chłodzenia</td><td>Teca</td><td>LHP-300CP</td><td></td></tr><tr><td>Mosiężny blok chłodzący</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td></td><td>~4 x 8 x 2cm</td></tr><tr><td>Sarkofag</td><td>Wykonany na zamówienie</td><td></td><td>Skontaktuj się z nami w celu uzyskania szczegółów</td></tr><tr><td>Klej utwardzany promieniami UV</td><td>Kemxert corp</td><td>KOA300</td><td>Butelka 1oz wystarcza na lata</td></tr><tr><td>System paneli</td><td>Caltech</td><td>http://www.dickinson.caltech.edu/panels</td><td>[4]</td></tr><tr><td>Pincety precyzyjne</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>Magnesy dolnego pierścienia</td><td>Rare-earth-magnets.com</td><td>NSN0615</td><td>5 - 0.75&quot; średnica zewnętrzna x 0.375&quot; średnica wewnętrzna x 0.125&quot;</td></tr><tr><td>Magnes górnego pręta</td><td>Rare-earth-magnets.com</td><td>NSN0750</td><td>0.125&quot; x 1&quot;</td></tr><tr><td>Łożysko V-Jewel</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>VJ-0469-01</td><td></td></tr><tr><td>Regulatory przepływu MFC-4</td><td>Sable Systems International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multipleksor gazowy</td><td>Sable Systems International</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przewody teflonowe</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>STT-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Igły hipodermiczne 20G</td><td>Small Parts, Inc.</td><td>HTX-20R-06</td><td></td></tr><tr><td>Rurki szklane</td><td></td><td></td><td>4mm średnica zewnętrzna</td></tr><tr><td>Regulator przepływu próżni</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-32464-52</td><td></td></tr></tbody></table>

magnetyczny system wiązania do badania kontroli lotu zapośredniczonej przez wzrok i węch u drosophila

A Magnetic Tether System to Investigate Visual and Olfactory Mediated Flight Control in Drosophila

Od wielu lat wiadomo, że owady wykorzystują wskazówki wizualne do stabilizacji kierunku lotu w strumieniu powietrza. Wiele zwierząt śledzi zapachy przenoszone przez wiatr. W związku z tym wizualna stabilizacja śledzenia kierunku podwiatrowego bezpośrednio wspomaga śledzenie zapachu. Czy jednak sygnały olfaktoryczne bezpośrednio wpływają na zachowanie śledzenia wizualnego niezależnie od wskazówek wiatru? Ponadto ostatni wysyp badań nad neurofizjologią i neurobehawioralną genetyką węchu u Drosophila stał się motywacją do opracowania coraz bardziej zaawansowanych technicznie i ilościowych testów behawioralnych. W niniejszej pracy zmodyfikowaliśmy system magnetycznego uwięzienia, pierwotnie zaprojektowany do eksperymentów nad wzrokiem, poprzez wyposażenie areny w wąskie, laminarne pióropusze zapachowe. Mucha zostaje przyklejona do małego stalowego pinu i zawieszona w polu magnetycznym, które umożliwia jej swobodny obrót wokół osi pionowej. Pióropusze zapachowe pożywienia o małej średnicy są kierowane w dół nad głową muchy, co wywołuje stabilne śledzenie u głodnego owada. W niniejszym opracowaniu skupiamy się na kluczowych aspektach mechanicznych uwięzienia, ustawianiu magnesów, projektowaniu pióropusza zapachowego oraz potwierdzaniu stabilnego śledzenia zapachu.

W niniejszej pracy opisujemy sposób unieruchomienia muchy w aparaturze do magnetycznego unieruchomienia węchowego (OMT). Opisujemy sposób ustawienia magnesów ziem rzadkich oraz portów zapachowych, a także sposób konfiguracji przepływów masowych dla podawania bodźca i ssania próżniowego w celu uzyskania optymalnego śledzenia zapachu.

Magnetyczny system wiązania do badania kontroli lotu zapośredniczonej przez wzrok i węch u Drosophila

Od wielu lat wiadomo, że owady wykorzystują bodźce wzrokowe do stabilizacji swojego kierunku poruszania się w strumieniu powietrza. Wiele zwierząt śledzi zapachy przenoszone przez wiatr. ...

Rozwijająca się dziedzina węchu owadów doprowadziła do opracowania coraz bardziej zaawansowanych testów behawioralnych, takich jak aparat do magnetycznego wiązania węchowego, czyli OMT. Procedura ta polega na przyklejeniu grzbietowej części klatki piersiowej muchy do szpilki mnuchin. Mucha zostaje zawieszona pod kątem 30 stopni z odpowiednio ustawioną szpilką, a następnie wyrównana pomiędzy dwoma magnesami ziemiami rzadkimi.Prawidłowe wykonanie tej czynności zapewni swobodę ruchu. Następnie ustawia się port zapachowy tak, aby wytworzona struga zapachowa przechodziła płynnie z dyszy doprowadzającej nad głową muchy do komory próżniowej. Następnie w obecności bodźców wzrokowych testuje się zdolność muchy do lokalizacji substancji zapachowej.Witajcie, jestem Brian DeMars z laboratorium dr. Marka Fry’ego w Katedrze Nauk Fizjologicznych na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. Dzisiaj pokażemy wam, jak przymocowywać muchy do aparatury magnetycznej do badań węchowych. Pokażemy również, jak wyrównać magnesy oraz porty zapachowe i jak ustawić natężenie przepływu masy w systemie dostarczania zapachów.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania kontroli lotu za pośrednictwem wzroku i węchu u muszek owocówek. Przejdźmy zatem do pracy. Aby rozpocząć unieruchamianie, należy zebrać muszki od czterech do sześciu dni po wykluciu (ELOs) i poddać je głodzeniu przez cztery do sześciu godzin.Do fiolki z pożywką zawierającej wilgotną chusteczkę Kim wipe, aby zapobiec wysychaniu, przenieś partię zaznaczonych much do małej fiolki umieszczonej w mosiężnym bloku na chłodni Peltier ustawionej na 4 °C. W tej temperaturze muchy zostaną znieczulone w ciągu około 30 sekund.Umieść chusteczkę Kim wipe na górnej części chłodzonej platformy, aby absorbować wilgoć. Następnie umieść znieczulone muchy na platformie w celu sortowania i wybierz największe samice do unieruchomienia (tethering). Za pomocą cienkiego pędzelka przesuń pojedynczą muchę na pozycję w specjalnie zbudowanym sarkofagu, którego kształt jest dostosowany do pojedynczej samicy muszki owocówki typu dzikiego.Teraz należy użyć mikroskopu, aby upewnić się, że mucha jest prawidłowo ułożona stroną grzbietową do góry. Przednia część muchy powinna być skierowana w stronę badacza, a tylna w przeciwną stronę. Następnie należy ustawić szpilkę Minuchin z prętem magnetycznym zamontowanym na mikromanipulatorze.Szpilka powinna być ustawiona tak, aby jej tępy koniec był skierowany w stronę grzbietowej części klatki piersiowej muchy. Znajduje się ona tuż za głową, pomiędzy obiema skrzydłami. Mucha powinna być prawidłowo ustawiona na szpilce wzdłuż trzech osi.Kąty pochylenia, przechyłu i odchylenia – szpilka powinna być idealnie pionowa podczas oglądania z przodu, w stronę oczu; nie można dopuścić nawet niewielkiego przechyłu między muchą a szpilką. Kąt widoku z boku między szpilką a osią długą ciała lub kąt pochylenia powinien wynosić 30 stopni w górę względem horyzontu. Należy pamiętać, że szpilka może wymagać przycięcia w celu optymalnego działania uwięzi.Będzie to zależeć od odległości między magnesami zawieszenia. Po wyrównaniu pinu Mnuchina, za pomocą cienkiego stalowego drutu nanieś małą kroplę kleju utwardzanego promieniami UV na tępy koniec pinu Mnuchina. Następnie manipuluj pinem tak, aby kropla kleju dotknęła przedplecza muchy tuż nad głową.Należy uważać, aby nie użyć zbyt dużej ilości kleju. Przy odpowiedniej wielkości kropli klej powinien lekko wypuklić się i spłynąć z pinezki na klatkę piersiową. Następnie utwardź klej za pomocą dwóch 22-sekundowych impulsów światła UV.Po zakończeniu unieruchomienia, za pomocą pincety podaj mały kwadratowy ręcznik papierowy Kim wipe do każdej muchy, wykorzystując jej instynktowny odruch lądowania. Muchy uchwycą ręczniki papierowe. Po godzinie odpoczynku unieruchomione muchy są gotowe do eksperymentów.Aby uzyskać płynny zakres ruchu o 360 stopni, kluczowe jest prawidłowe ustawienie magnesów. W tym celu należy trzymać magnetyczne pierścienie dolne poziomo za pomocą plastikowej tulei i umieścić je bezpośrednio na przezroczystej komorze próżniowej. Górny magnes prętowy jest zamocowany pionowo około trzech czwartych cala nad magnesami dolnymi, a do dolnej powierzchni magnesu górnego za pomocą epoksydowego kleju przytwierdzone jest podwójne łożysko V.Pozwoli to na ustandaryzowanie położenia much i zminimalizowanie tarcia rotacyjnego. Należy pamiętać, że magnesy te mogą być niebezpieczne, a niewłaściwe użytkowanie może doprowadzić do uszkodzenia sprzętu lub lekkich obrażeń ciała. Następnie należy wstępnie wyrównać górny i dolny magnes wizualnie.Umieszczając górny magnes prętowy bezpośrednio nad punktem centralnym dolnych magnesów pierścieniowych, warto przymocować górny magnes do mikromanipulatora w celu precyzyjnej regulacji. Teraz należy umieścić muchę w arenie i dostosować poziomą oraz pionową pozycję górnego magnesu, aż mucha będzie mogła płynnie i stabilnie obracać się o 360 stopni; na początku każdego eksperymentu należy sprawdzić, czy każda mucha obraca się płynnie, aby upewnić się, że magnesy są odpowiednio wyrównane, a piny mnuchina nie są uszkodzone. Jeśli ustawienie jest nieprawidłowe, mucha może w ogóle nie obracać się.Mucha może mieć ograniczony zakres ruchu lub obracać się z niezmienną prędkością. Może to wynikać z problemów z przyklejeniem, co można sprawdzić, obracając przed muchą pasiastą siatkę w celu wywołania odpowiedzi omo. Jeśli mucha nie obraca się lub robi to w sposób niespójny, należy zastąpić ją innym okazem.Jeśli mucha nie obraca się prawidłowo i problemy te występują u każdej muchy, prawdopodobną przyczyną jest niewłaściwe ustawienie magnesów i konieczna będzie dalsza regulacja w celu uzyskania stabilnego zapachu. Śledzenie wstępnej konfiguracji systemu zapachowego wymaga poprowadzenia rurek teflonowych o wąskiej średnicy od multipleksera gazu do wykonanych na zamówienie fiolek z wodnym roztworem zapachowym. Wylot z tych fiolek powinien być połączony bezpośrednio z rurkami portów hipodermicznych za pomocą tych samych rurek teflonowych.Następnie pod areną umieszcza się przezroczystą akrylową komorę próżniową, aby podtrzymać magnesy. Należy użyć szklanej rurki o średnicy czterech milimetrów, zamontowanej pod muchą i połączonej z komorą próżniową, aby zbliżyć otwór próżniowy do muchy i zmniejszyć średnicę otworu. Teraz za pomocą pęsety należy umieścić przywiązaną muchę w arenie.Gdy mucha znajdzie się na miejscu, włącz wabiący zapach. Można wizualnie sprawdzić, czy mucha kieruje się w stronę otworu zapachowego po włączeniu zapachu. Jeśli mucha nie wykazuje preferencji wobec zapachu, należy zoptymalizować OMT metodą prób i błędów.Aby to zrobić, należy najpierw dostosować położenie portu zapachowego, aż mucha zacznie podążać za zapachem. W tym przypadku porty zapachowe są zamontowane na mikromanipulatorach i ustawione 4 mm grzbietowo oraz 3 mm przednio względem głowy muchy. Jeśli zmiana położenia portu zapachowego nie poprawia śledzenia zapachu, należy dostosować natężenie przepływu masy, aż mucha zacznie podążać za zapachem.Stosujemy ustawienia wynoszące 7 mL/min. Jeśli regulacja masowego natężenia przepływu nie poprawi śledzenia zapachu, należy regulować natężenie przepływu próżni, aż mucha zacznie śledzić zapach. Natężenie przepływu próżni ustawiliśmy na 13 L/min za pomocą regulatora przepływu.Po ustawieniu pozycji portu i szybkości przepływu należy okresowo przełączać się między podawaniem pary wodnej a pary zapachowej, korzystając z przełączalnego multipleksera gazowego. Przy prawidłowej konfiguracji aparatury powinny zostać zaobserwowane dwa zjawiska. Po pierwsze, pod wpływem stałych, obrotowych bodźców wizualnych, przymocowana mucha umieszczona w OMT powinna płynnie obracać się o 360 stopni w pionowej osi ya. Po drugie, szarpane obroty, zwane kos, są charakterystyczne dla spontanicznego zachowania obrotowego w przypadku braku stałych bodźców wizualnych.Jeśli muchy nie mogą obracać się płynnie, przyczyną może być niewłaściwe przyklejenie lub źle dopasowane magnesy. Po drugie, należy upewnić się, że po włączeniu zapachu mucha kieruje się w stronę portu zapachowego. Po wyłączeniu zapachu mucha powinna poruszać się spontanicznie, nie wykazując preferencji do żadnej pozycji w arenie.Jeśli muchy nie śledzą aktywnie pióropusza zapachowego, może to oznaczać konieczność skorygowania położenia wylotu zapachowego, natężenia przepływu powietrza i/lub natężenia przepływu próżni. Przedstawiliśmy właśnie sposób przytwierdzania muchy do wykorzystania w magnetycznym aparacie do badań węchowych. Pokazaliśmy również, jak prawidłowo wyrównać magnesy oraz wyloty zapachowe, a także jak ustawić masowe natężenia przepływu w systemie podawania zapachu.To wszystko. Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.

a-magnetic-tether-system-to-investigate-visual-olfactory-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

System magnetycznego linowa zaprojektowany do badania kontroli lotu u Drosophila wykorzystującej wzrok i węch

Pomiar momentu obrotowego odchylenia (yaw torque) przywiązanej muchy Drosophila za pomocą miernika momentu obrotowego pozwala neurobiologowi na precyzyjną kontrolę warunków stymulacji zwierzęcia doświadczalnego. W połączeniu z unikalnymi narzędziami genetycznymi dostępnymi u muszki owocówki, paradygmat ten jest wykorzystywany w szerokim zakresie badań neurobiologicznych.

Uczenie instrumentalne muszek *Drosophila* przy użyciu torquemetru

W niniejszym materiale opisujemy sposób optymalizacji pozyskanego obrazu wideo dla aparatury do magnetycznego więzienia węchowego (OMT). Przedstawiamy również dwa przykładowe protokoły eksperymentalne służące do badania fuzji wzrokowo-węchowej.

Wizualnie zapośredniczone śledzenie zapachu podczas lotu u Drosophila

Genetycznie kodowane narzędzia optogenetyczne umożliwiają nieinwazyjną manipulację specyficznymi neuronami w mózgu Drosophila. Takie narzędzia mogą identyfikować neurony, których aktywacja jest wystarczająca do wywołania lub stłumienia określonych zachowań. W tym miejscu przedstawiamy metodę aktywacji rodopsyny kanałowej2, która ulega ekspresji w docelowych neuronach u swobodnie chodzących muszek.

Optogenetyczna stymulacja zachowań ucieczkowych u Drosophila melanogaster

Prezentujemy nowatorską procedurę chirurgiczną polegającą na wszczepieniu elektrod w Manduca sexta podczas jej wczesnych stadiów metamorficznych. Technika ta pozwala na mechanicznie stabilne i elektrycznie niezawodne sprzężenie z tkanką nerwowo-mięśniową w celu badania dynamiki neurofizjologii lotu. Prezentujemy również nowatorską platformę lewitacji magnetycznej do badań ziewania owadów na uwięzi.

Wczesna technologia wprowadzania metamorficznego do monitorowania zachowania owadów w locie

Tutaj opisujemy metodę szybkiego i dokładnego pomiaru wydajności lotu u Drosophila, umożliwiając wysokoprzepustowe badania przesiewowe.

Ulepszona metoda dokładnego i szybkiego pomiaru charakterystyki lotu u Drosophila

Automatyczny system śledzenia Flywalk jest używany do wysokorozdzielczego oznaczania ilościowego zachowania kierowanego zapachem u Drosophila melanogaster.

Kwantyfikacja zachowania kierowanego zapachem w wysokiej rozdzielczości u Drosophila melanogaster przy użyciu paradygmatu Flywalk

Aby zidentyfikować nowe mutacje wpływające na mechanosensację, zaprojektowaliśmy test, który mierzy reakcję behawioralną na stymulację dotykową szczeciny muchy u zmutowanych klonów generowanych metodą MARCM. Połączenie technik pozwala na identyfikację mutacji mechanowrażliwych, które w przeciwnym razie byłyby śmiertelne.

Test behawioralny do mechanosensacji klonów opartych na MARCM u Drosophila melanogaster

Opisujemy tutaj konfigurację behawioralną i metodę analizy danych do oceny reakcji węchowych do 100 muszek octowych (Drosophila melanogaster). System ten może być stosowany z pojedynczymi lub wieloma bodźcami węchowymi i może być przystosowany do optogenetycznej aktywacji lub wyciszania podzbiorów neuronów.

Zachowania węchowe oceniane za pomocą komputerowego śledzenia Drosophila w czterokwadrantowym olfaktometrze

Ten protokół analizuje zachowanie nawigacyjne larwy Drosophila w odpowiedzi na jednoczesną optogenetyczną stymulację jej neuronów węchowych. Światło o długości fali 630 nm służy do aktywacji pojedynczych neuronów węchowych wyrażających rodopsynę z przesuniętym ku czerwieni kanałem. Ruch larw jest jednocześnie śledzony, rejestrowany cyfrowo i analizowany za pomocą specjalnie napisanego oprogramowania.

Śledzenie zachowań larw Drosophila w odpowiedzi na optogenetyczną stymulację neuronów węchowych

Ten protokół wykorzystuje drukarki trójwymiarowe (3D) i wycinarki laserowe znajdujące się w przestrzeniach twórczych, aby stworzyć bardziej elastyczny projekt młyna lotniczego. Korzystając z tej technologii, naukowcy mogą obniżyć koszty, zwiększyć elastyczność projektowania i generować powtarzalne prace podczas konstruowania młynów do badań nad lotem owadów na uwięzi.

Budowa ulepszonego młyna zgarniającego do badania lotu owadów na uwięzi

Poznaj system magnetycznej linki do badania zachowań węchowych u Drosophila. Ta metoda umożliwia precyzyjną analizę śledzenia zapachów w kontrolowanych warunkach laboratoryjnych.

Magnetyczny system wiązania do badania kontroli lotu zapośredniczonej przez wzrok i węch u Drosophila

Przeglądaj więcej filmów