Name: Obrazowanie wapnia neuronów korowych za pomocą Fura-2 AM (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-01-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Poznaj technikę obrazowania wapnia w neuronach korowych za pomocą Fura-2 AM. Ta metoda umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowych stężeń wapnia w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

hodowla komórkowa
Komórki można hodować przy użyciu uznanych technik, jednak muszą one zostać wysiane na szklanych lamellkach nr 1 pokrytych adhezywem komórkowym (takim jak polilizyna, poliornityna lub laminina), aby zapobiec odrypaniu się lub przemieszczaniu komórek podczas eksperymentów obrazowych.
Roztwory
Eksperymenty z obrazowaniem wapnia można przeprowadzać z użyciem różnych roztworów fizjologicznych, w tym pożywek do hodowli komórkowych. Ważne jest jednak, aby upewnić się, że roztwory są wolne od czerwieni fenolowej, która znacznie zwiększa tło fluorescencyjne. Stosujemy roztwór Tyrodesa, który jest łatwy do przygotowania i naśladuje płyn mózgowo-rdzeniowy, uzupełniając go o 0,1% Bovine Serum Albumin. W celu aktywacji napięciowo zależnych kanałów wapniowych stosujemy depolaryzację za pomocą 60-90 mM chlorku potasu, a w celu aktywacji kanałów CRAC sterowanych przez magazyny wapnia – 1μM Thapsigargin (roztwór stokowy 1 mM w DMSO) lub 2μM Ionomycin (roztwór stokowy 1 mM w DMSO). Często wygodne jest usunięcie wapnia z roztworu zewnątrzkomórkowego, aby wykazać, że wzrost poziomu wapnia wynika z jego napływu. Podczas usuwania wapnia konieczne jest utrzymanie stałego całkowitego stężenia kationów dwuwartościowych (Mg2+ i Ca2+). Przy zastępowaniu sodu potasem niezbędne jest zachowanie równowagi osmotycznej.
Roztwory Tyrodesa:
<table border="1">
<tbody>
<tr>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roztwór Tyrodes z niską zawartością potasu i 2mM Ca2+ (mM)</td>
<td>Roztwór Tyrodes z niską zawartością potasu i 0 Ca2+ (mM)</td>
<td>Roztwór Tyrodes z wysoką zawartością potasu i 2mM Ca2+ (mM)</td>
<td>Roztwór Tyrodes z wysoką zawartością potasu i 0 Ca2+ (mM)</td>
</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>129</td>
<td>129</td>
<td>5</td>
<td>5</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>5</td>
<td>5</td>
<td>129</td>
<td>129</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>2</td>
<td>0</td>
<td>2</td>
<td>0</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>1</td>
<td>3</td>
<td>1</td>
<td>3</td>
</tr>
<tr>
<td>Glukoza</td>
<td>30</td>
<td>30</td>
<td>30</td>
<td>30</td>
</tr>
<tr>
<td>Hepes</td>
<td>25</td>
<td>25</td>
<td>25</td>
<td>25</td>
</tr>
</tbody>
</table>
Dostosować pH do 7.4 za pomocą NaOH
Ładowanie barwnika wapniowego Fura-2
Obciążamy komórki acetoksymetylowym estrem Fura-2 (Fura-2 AM), który dyfunduje przez błonę komórkową i ulega odwstryczności przez esterazy komórkowe, tworząc wolny kwas Fura-2. Dokładne parametry obciążania Fura-2 różnią się znacznie w zależności od typu komórek. Zalecamy przetestowanie różnych warunków poprzez przygotowanie kilku roztworów obciążających o różnych stężeniach Fura-2 w zakresie od 1- 4 µM, inkubację komórek w roztworze obciążającym przez różny czas (od 15 minut do 2 godzin) oraz testowanie obciążania w temperaturze pokojowej i w 37 °C. Poniżej przedstawiono uproszczony protokół dla neuronów korowych:
<ol>
<li>W pierwszej kolejności przygotować roztwór stokowy Fura-2 AM o stężeniu 1 mM, dodając 50µl DMSO do fiolki zawierającej 50µg substancji firmy Invitrogen. Ważne jest użycie suchego DMSO pakowanego w atmosferze azotu; konieczne jest pobranie DMSO za pomocą igły poprzez przebicie septa, aby zapobiec nawilżeniu DMSO. Po przygotowaniu roztworu Fura-2 AM należy przechowywać go w ciemnym, suchym miejscu. Fura-2 AM w DMSO jest stabilny w temperaturze pokojowej przez 24 godziny oraz stabilny w temperaturze - 20 stopni w suchym pojemniku przez kilka miesięcy.</li>
<li>Do stożkowej probówki o pojemności 15 ml odmierzyć 2 ml pożywki hodowlanej, ogrzać do 37 stopni i dodać 2µl roztworu stokowego Fura-2 AM, aby uzyskać roztwór Fura-2 AM o stężeniu 1µM. Intensywnie mieszać roztwór na wortexie przez 1 minutę.</li>
<li>Przenieść roztwór ładujący do naczynia hodowlanego o średnicy 35 mm i przenieść do niego szkiełko nakrywki z komórkami.</li>
<li>Inkubować neurony w temperaturze 37 stopni przez 30 minut w ciemnym inkubatorze. Należy precyzyjnie odmierzyć czas inkubacji.</li>
<li>Przygotować naczynie o średnicy 35 mm zawierające 2 ml pożywki hodowlanej bez Fura-2 AM. Wyjąć szkiełko nakrywki z roztworu ładującego i umieścić je w nowym naczyniu.</li>
<li>Zamontować szkiełko nakrywki w komorze obrazowania. Wyjąć szkiełko nakrywki z naczynia 35 mm i szybko zamontować je w komorze, dbając o to, aby nie dopuścić do wyschnięcia komórek. Stosujemy komorę obrazowania firmy Warner Instruments, która umożliwia zamontowanie szkiełka nakrywki o średnicy 10mm z komórkami na spodzie oraz zamontowanie drugiego szkiełka nakrywki na górze, tworząc strukturę kanapkową. Oba szkiełka nakrywkowe są mocowane do komory za pomocą smaru próżniowego, a dwie rurki na obu końcach komory umożliwiają perfuzję roztworów przez komorę. Linia doprowadzająca jest podłączona do strzykawki, a linia odpływowa do otworu opróżnianego przez linię ssącą podłączoną do pułapki próżniowej.</li>
</ol>
Mikroskop
Używamy odwróconego mikroskopu Nikon Eclipse TE2000-U wyposażonego w lampę ksenonową (Sutter Instruments), zautomatyzowany stolik (Ludl), koło filtrów wzbudzeń (Ludl) oraz chłodzoną kamerę CCD (Hamamatsu Orka II). Mikroskop jest sterowany komputerem Macintosh z oprogramowaniem Open Lab (Improvision). Dostępnych jest kilka innych pakietów oprogramowania do obrazowania ratiometrycznego. Do obrazowania wykorzystujemy obiektywy immersyjne Nikon Fluor 40, 60 lub 100x z aperturą numeryczną (NA) przekraczającą 1,2.
Protokół obrazowania
<ol>
<li>Kalisz stolik mikroskopu.</li>
<li>Wprowadź roztwór Tyrodes do linii doprowadzającej, dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza.</li>
<li>Podłącz komorę do linii perfuzyjnych i ponownie przepłucz komorę roztworem Tyrodes, dbając o to, aby wewnątrz komory nie powstały pęcherzyki powietrza.</li>
<li>Nałóż kroplę oleju na obiektyw, umieść komorę na stoliku mikroskopu i ustaw ostrość na komórkach, korzystając ze światła przechodzącego.</li>
<li>Zbadaj fluorescencję komórek za pomocą okularów, stosując oświetlenie przy 340 nm i 380 nm. Komórki w stanie spoczynku powinny być ciemne przy 340 nm i jasne przy 380 nm. Generalnie komórki nie powinny być naświetlane światłem UV przez więcej niż 10 lub 15 sekund, a intensywność światła wzbudzenia należy zredukować za pomocą filtra neutralnego, aby zapobiec fototoksyczności.</li>
<li>Zbadaj komórki za pomocą kamery i ustaw wzmocnienie (gain) oraz czas ekspozycji tak, aby uzyskać obraz bliski nasycenia (ale nie nasycony) przy oświetleniu 380 nm i znacznie poniżej nasycenia przy 340 nm. Jeśli to możliwe, utrzymuj ekspozycję poniżej 200 ms. Po ustawieniu nie zmieniaj wzmocnienia ani ekspozycji kamery, chyba że planujesz również zmienić tło, RMin i RMax (patrz poniżej).</li>
<li>Wykonaj obraz dla każdej długości fali i użyj narzędzia wyznaczania obszaru zainteresowania (ROI), aby zmierzyć intensywność tła w różnych miejscach obrazów dla każdej długości fali.</li>
<li>Oblicz średnią z wartości tła i wprowadź te wartości w odpowiednie miejsca w programie do obrazowania. Wartość tła zostanie odjęta od każdego piksela w polu widzenia.</li>
<li>Wykonaj próbny obraz stosunku (ratio) i dostosuj wartości progowe (Threshold) dla każdej długości fali, aby uzyskać obraz stosunku, który obejmuje tylko komórki, a nie tło, i nie jest zaszumiony w obszarach bliskich krawędziom komórek.</li>
<li>Ustaw minimalną wartość stosunku (RMin) na około 10% poniżej najniższego stosunku dowolnej komórki w polu widzenia.</li>
<li>Ustaw RMax na około 12-krotność RMin. Nie zmieniaj wartości RMin ani RMax pomiędzy eksperymentami, które planujesz porównać, ponieważ utrudni to porównanie. W naszym zestawie do obrazowania rzadko zmieniamy wartości RMin i RMax.</li>
<li>Użyj automatycznego stolika, aby znaleźć pola, które planujesz obrazować, i zapisz lokalizację każdego pola za pomocą oprogramowania. Zazwyczaj podczas eksperymentu rejestrujemy pięć pól widzenia. Automatyczny stolik przemieszcza się do pola, wykonuje obraz stosunku, a następnie przechodzi do następnego pola.</li>
<li>Ustaw interwał time-lapse tak, aby zbierać obrazy w odstępach od 0,1 do 10 sekund, w zależności od rodzaju sygnałów, których spodziewasz się zaobserwować.</li>
<li>Rozpocznij eksperyment.</li>
<li>Podczas testowania systemu obrazowania wapnia często przydatne jest stosowanie bodźców takich jak roztwór Tyrodes z wysokim stężeniem potasu (65 mM KCl) lub jonomycyna (2 µM), które wywołują wzrost stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego, oraz pozbawiony wapnia roztwór zewnątrzkomórkowy (zawierający bufory wapniowe, takie jak EGTA i BAPTA), który obniży stężenie wapnia.</li>
</ol>
Analiza
Po zakończeniu eksperymentu należy przekształcić zestaw obrazów stosunków w pomiary wapnia w czasie dla poszczególnych komórek lub obszarów zainteresowania wewnątrz komórek. Aby to zrobić:
<ol>
<li>Użyj narzędzia do definiowania obszarów zainteresowania (ROI), aby wyznaczyć obszary obrazu, w których chcesz zmierzyć poziom wapnia. Zazwyczaj użyteczne jest wyznaczenie co najmniej jednego ROI obejmującego ciało komórki. Podczas definiowania ROI warto odtworzyć film z obrazami, aby upewnić się, że komórki nie przemieszczają się w trakcie trwania eksperymentu.</li>
<li>Użyj oprogramowania do zbierania pomiarów stosunku (ratio) w czasie dla każdego ROI w każdym obrazie.</li>
<li>Zaimportuj pomiary stosunku do programu analitycznego. Będziesz musiał przeanalizować przebiegi stężeń wapnia dla konkretnych komórek lub ROI, wyciągnąć średnią z wielu komórek lub ROI oraz przeliczyć pomiary stosunku na wartości wewnątrzkomórkowego wapnia. Korzystamy z zestawu makr napisanych w programie Igor Pro, które pozwalają na wykonanie wszystkich tych typowych zadań analitycznych, jednak można również użyć innych programów, takich jak Excel, choć są one mniej wygodne.</li>
<li>Do przeliczenia wartości stosunku Fura-2 na stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego można użyć równania [Ca] = (R-Rmin)/(Rmax-R)Sf*Kd. [Ca] oznacza stężenie wapnia, R to stosunek Fura-2 340/380, RMin i RMax to odpowiednio stosunki 340/380 w obecności lub braku wapnia bądź w obecności nasycającego stężenia wapnia, a Sf*Kd to iloczyn Kd dla Fura-2 (około 120 nM w RT) i wartości skalującej. Aby zmierzyć RMin, RMax oraz Sf*Kd, konieczne jest przeprowadzenie kalibracji in vivo lub in vitro. Kalibracja in vivo wymaga połączenia techniki patch clamp i obrazowania wapnia, co może być skomplikowane, ale jest bardzo precyzyjne. Kalibrację in vitro można przeprowadzić przy użyciu własnoręcznie wykonanej komory kalibracyjnej, składającej się z dwóch szkiełek podstawowych rozdzielonych cienką przekładką, co pozwala na wytworzenie cienkiej warstwy roztworu, w której wykonuje się kalibrację. Najwygodniejszym sposobem pomiaru wartości stosunku Fura-2 w funkcji stężeń wapnia jest zastosowanie zestawu kalibracyjnego zawierającego kilka buforowanych roztworów wapnia oraz kwas wolny Fura-2. Można je nabyć od firmy Invitrogen (Molecular Probes); zestawy zawierają precyzyjne instrukcje użycia.</li>
</ol>

<ol><li>Grynkiewicz, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J. Biol. Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Lewis, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Dolmetsch, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+between+intracellular+Ca2%2B+stores+and+depletion-activated+Ca2%2B+channels+generates+%5BCa2%2B%5Di+oscillations+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signaling between intracellular Ca2+ stores and depletion-activated Ca2+ channels generates [Ca2+]i oscillations in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 103, 365-388 (1994).</li>
</ol>

W tej prezentacji omówiliśmy wszystkie etapy obrazowania wapnia z wykorzystaniem Fura-2 AM. Jako model wykorzystaliśmy neurony kory mózgowej, jednak obrazowanie wapnia można zastosować do pomiaru stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego w czasie rzeczywistym w wielu rodzajach komórek. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest stosowanie szklanych szkiełek podstawowych zamiast plastikowych, ponieważ plastik często wykazuje fluorescencję w zakresie fal ultrafioletowych, co utrudnia obrazowanie. Ponadto istotne jest uprze...

<table><tbody><tr><td>Nowy element</td><td>Fura-2 AM</td><td>Invitrogen</td><td>F1221</td><td>Chronić przed światłem</td></tr><tr><td>Nowy element</td><td>DMSO</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>MX1457-6</td><td>Przechowywać w suchym miejscu, aby zapobiec hydratacji</td></tr><tr><td>Nowy element</td><td>Albuminy z surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8022-100G</td><td>Przechowywać w 4&amp;deg;</td></tr><tr><td>Nowy element</td><td>Komora obrazowania</td><td>Warner Instruments</td><td>Model RC-20H</td><td></td></tr><tr><td>Nowy element</td><td>Mikroskop</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse TE2000-U</td><td></td></tr><tr><td>Nowy element</td><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>Nowy element</td><td>Zestaw kalibracyjny</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>F6774</td><td>Chronić przed światłem</td></tr></tbody></table>

obrazowanie wapniowe neuronów korowych z użyciem fura-2 am

Calcium Imaging of Cortical Neurons using Fura-2 AM

Obrazowanie wapnia jest powszechną techniką przydatną do pomiaru sygnałów wapniowych w hodowlach komórkowych. Techniki obrazowania wapnia wykorzystują barwniki wskaźnikowe wapnia, które są organicznymi cząsteczkami opartymi na BAPTA, zmieniającymi swoje właściwości widmowe w odpowiedzi na wiązanie jonów Ca2+. Barwniki wskaźnikowe wapnia dzielą się na dwie kategorie: barwniki ratiometryczne, takie jak Fura-2 i Indo-1, oraz barwniki jednofalowe, takie jak Fluo-4. Barwniki ratiometryczne zmieniają swoje widma wzbudzenia lub emisji w odpowiedzi na obecność wapnia, co pozwala na wyznaczenie stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego na podstawie stosunku emisji lub wzbudzenia fluorescencji przy różnych długościach fal. Główną zaletą stosowania barwników ratiometrycznych nad sondami jednofalowymi jest fakt, że sygnał stosunku jest niezależny od stężenia barwnika, natężenia oświetlenia oraz długości drogi optycznej, co umożliwia określenie stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego niezależnie od tych artefaktów. Jednym z najczęściej stosowanych wskaźników wapnia jest Fura-2, który posiada szczyt emisji przy 505 nm i zmienia swój szczyt wzbudzenia z 340 nm na 380 nm w odpowiedzi na wiązanie wapnia. W niniejszym opracowaniu opisujemy zastosowanie Fura-2 do pomiaru wzrostu poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego w neuronach i innych komórkach pobudliwych.

Sygnały wapniowe odgrywają kluczową rolę w wielu procesach komórkowych, w tym w ekspresji genów, przeżywalności i różnicowaniu. W niniejszym materiale demonstrujemy, jak przeprowadzić obrazowanie wapnia z wykorzystaniem Fura-2 AM. Obrazowanie wapnia jest cennym narzędziem do badania w czasie rzeczywistym regulacji wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia oraz jego wpływu na kaskady sygnałowe.

Obrazowanie wapniowe neuronów korowych z użyciem Fura-2 AM

Obrazowanie wapnia jest powszechną techniką, która jest przydatna do pomiaru sygnałów wapniowych w hodowlach komórkowych. Techniki obrazowania wapnia wykorzystują wapń...

Obrazowanie wapnia pozwala na badanie ruchu jonów wapnia do cytoplazmy i z niej w odpowiedzi na różne bodźce fizjologiczne. Aby rozpocząć eksperymenty z obrazowaniem wapnia w neuronach kory mózgowej, komórki są obciążane barwnikiem wskaźnikowym wapnia RA 2:00 AM, zamontowane w komorze perfuzyjnej w mediach RA two free i umieszczone pod mikroskopem fluorescencyjnym, gdzie są naświetlane światłem o długości fali 340 nm oraz 380 nm, która jest pochłaniana przez barwnik. Emisje o długości 505 nm z barwnika przy tych dwóch długościach fal są zbierane, a poziom wewnątrzkomórkowego wapnia można obliczyć z stosunku tych wartości.Cześć, nazywam się Mar Barreto i pracuję w laboratorium Ricarda Domisha w Katedrze Neurobiologii na Uniwersytecie Stanforda. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę pomiaru wzrostu stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego w neuronach. Zapraszam do oglądania.Neurony korowe wykorzystywane w tej procedurze obrazowania wapnia można hodować z zastosowaniem uznanych technik, jednak należy je wysiewać na szklane szkiełka nakrywkowe o średnicy 15 mm nr 1. Wynika to z faktu, że obrazowanie niskiej fluorescencji żywych komórek najlepiej przeprowadzać przy użyciu obiektywów o wysokiej ap

calcium-imaging-of-cortical-neurons-using-fura-2-am

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie wapnia neuronów korowych z użyciem Fura-2 AM

Aby zrozumieć dynamikę sieci mikroukładów w neocortex, niezbędne jest jednoczesne rejestrowanie aktywności dużej liczby neuronów. Dwufotonowy obrazowanie wapnia in-vivo jest jedyną metodą pozwalającą na rejestrację aktywności gęstej populacji neuronów z rozdzielczością pojedynczych komórek.

Obrazowanie wapnia metodą dwufotonową in vivo w warstwie 2/3 kory mózgowej myszy

Spontaniczną aktywność rozwijających się sieci neuronalnych można mierzyć przy użyciu form estrów AM barwników wskaźnikowych wrażliwych na wapń. Zmiany wewnątrzkomórkowego poziomu wapnia, wskazujące na aktywację neuronalną, są wykrywane jako przejściowe zmiany fluorescencji wskaźnika za pomocą obrazowania jedno- lub dwufotonowego. Niniejszy protokół można dostosować do różnych sieci neuronalnych zależnych od etapu rozwoju in vitro.

Funkcjonalne obrazowanie wapnia w rozwijających się sieciach korowych

W niniejszym protokole aktualizujemy opis ostatnich postępów w obrazowaniu sygnałów Ca2+ w neuronach znakowanych GFP w skrawkach tkanki mózgowej z wykorzystaniem czerwonego fluorescencyjnego wskaźnika Ca2+.

Obrazowanie odpowiedzi wapniowych w neuronach z etykietą GFP w skrawkach mózgu myszy z obszaru podwzgórza

Procedury są opisane w celu jednoczesnego rejestrowania potencjału błonowego lub prądu oraz zmian wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Neurony jądra nadskrzyżowaniowego są wypełnione wskaźnikiem wapnia bis-fura-2 za pomocą elektrody patch clamp w konfiguracji patch clamp całej komórki.

Jednoczesny zapis elektrofizjologiczny i obrazowanie wapnia neuronów jądra nadskrzyżowaniowego

Opisujemy połączenie ogniskowej fotoaktywacji związków neuroaktywnych wywołanej promieniowaniem UV z całokomórkowym patch-clampem i wielofotonowym obrazowaniem wewnątrzkomórkowych tranustów sodu w dendrytach i kolcach neuronów hipokampa w ostrych wycinkach tkanki mózgu myszy.

Wielofotonowe wewnątrzkomórkowe obrazowanie sodu w połączeniu z ogniskowym rozpakowywaniem glutaminianu za pośrednictwem promieniowania UV w neuronach piramidowych CA1

Po usunięciu z organizmu, tkanka neuronalna jest bardzo podatna na wpływ warunków środowiskowych, co prowadzi do ostatecznej degradacji tkanki po 6 - 8 godzinach. Dzięki unikalnej metodzie inkubacji, która ściśle monitoruje i reguluje zewnątrzkomórkowe środowisko tkanki, żywotność tkanek może być znacznie przedłużona przez &gt;24 godziny.

Przedłużona inkubacja ostrej tkanki neuronalnej do elektrofizjologii i obrazowania wapnia

Prezentujemy metodę łączącą zapisy z całokomórkowego patch-clampu i obrazowania dwufotonowego w celu zarejestrowania stanów przejściowych Ca2+ w dendrytach neuronalnych w ostrych wycinkach mózgu.

Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu

Obrazowanie wapnia w komórkach jest wszechstronną metodologią do badania dynamicznej sygnalizacji pojedynczych komórek, na mieszanych populacjach w kulturze, a nawet na przebudzonych zwierzętach, w oparciu o ekspresję przepuszczalnych dla wapnia kanałów/receptorów, które dają unikalne sygnatury funkcjonalne.

Wizualizacja zmian w obwodzie neuron-glej za pomocą techniki obrazowania wapnia

Obecne metody opisują nieratiometryczne podejście do wysokorozdzielczego, subkompartmentowego obrazowania wapnia in vivo u Caenorhabditis elegans przy użyciu łatwo dostępnych genetycznie kodowanych wskaźników wapnia.

Subkomórkowe obrazowanie neuronalnej obsługi wapnia in vivo

Ten artykuł przedstawia metodę ilościowego monitorowania stężenia jonów wapnia (Ca2+) w komórkach w czasie rzeczywistym za pomocą jednokomórkowego obrazowania Ca2+ barwnikiem Fura-2/AM. Technika ta umożliwia efektywne ładowanie barwnika i dokładne obliczanie poziomów Ca2+ za pomocą współczynników intensywności fluorescencji, dzięki czemu jest to proste i szybkie podejście do zastosowań badawczych.

Obrazowanie wapnia w pojedynczych komórkach do badania aktywacji kanałów jonowych wapnia

Poznaj technikę obrazowania wapnia w neuronach korowych za pomocą Fura-2 AM. Ta metoda umożliwia pomiar wewnątrzkomórkowych stężeń wapnia w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie wapniowe neuronów korowych z użyciem Fura-2 AM

Przeglądaj więcej filmów