Name: Test biologiczny in vivo na ludziach do specyficznego tkankowo pomiaru mediatorów nocyceptywnych i zapalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-12-01T00:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: Poznaj technikę mikrodializy do pobierania płynu międzykomórkowego z zapalonej skóry ludzkiej. Ta metoda umożliwia pomiar mediatorów nocyceptywnych i zapalnych w badaniach nad bólem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Indukcja stanu zapalnego w modelu eksperymentalnym:
<ol>
<li>Oparzenie słoneczne pierwszego stopnia indukuje się na nieopalonej skórze uda przy użyciu skalibrowanego źródła promieniowania ultrafioletowego B (Saalmann Multitester SBB LT 499, Saalmann GmbH, Hereford, Niemcy). Oparzenie słoneczne wywołuje się na 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu z mikrodializy, stosując dawkę promieniowania UVB trzykrotnie większą niż ta niezbędna do wywołania całkowitego zaczerwienienia odsłoniętej skóry, czyli trzykrotność minimalnej dawki erytemalnej (MED). Wartość MED określa się u każdego badanego przed rozpoczęciem badania. Precyzyjne dostarczenie energii zapewniane jest za pomocą miernika UV (RM 12, Dr. Grobel UV-Electronic GmbH, Ettlingen, Niemcy).</li>
</ol>
Umieszczenie cewnika i pobieranie próbek:
<ol>
<li>Przygotować stanowisko pracy z jałowymi rękawiczkami, jednym jałowym uchwytem do igieł, strzykawką 1 cc z końcówką luer i igłą 23G, strzykawką 1 cc z igłą 30G, 1% lidokainą, gazikami nasączonymi alkoholem, jałowymi gazikami 2x2, cewnikami do mikrodializy z przymocowaną na jednym końcu igłą 23G o długości 4 cm (Dermal Dialysis, Erlangen, Niemcy) oraz probówkami do zbierania próbek Microcent 1,5 ml (E&amp;K Scientific, Santa Clara, CA) z 4 µl roztworu inhibitora proteaz na każde 100 µl próbki, przechowywanymi na suchym lodzie. Roztwór inhibitora proteaz przygotowuje się zgodnie z instrukcją producenta, używając tabletek z koktajlem inhibitorów proteaz (Roche Diagnostics, GmbH, Mannheim, Niemcy).</li>
<li>Przygotować 1% roztwór albumin ludzkich w płynie Ringera z mleczanami i naciągnąć go do strzykawki 1 cc z końcówką luer, upewniając się, że w strzawce NIE pozostały pęcherzyki powietrza.</li>
<li>Umieścić strzykawkę z 1% roztworem płynu Ringera z mleczanami wzbogaconym albuminami ludzkimi w uchwycie (wielostrzykawkowe statywy do mikrodializy, Harvard Apparatus, South Natick, MA) zamontowanym na precyzyjnej pompie infuzyjnej (Pompa 22, Harvard Apparatus, South Natick, MA). Należy upewnić się, że ramię pompy infuzyjnej przesuwające strzykawkę w pełni przylega do tłoka strzykawki. Ustawić prędkość pompy po potwierdzeniu, że średnica strzykawki została prawidłowo wprowadzona do ustawień pompy. Powszechnie stosowane prędkości infuzji mieszczą się w zakresie od 2 do 4 µl/min.</li>
<li>Wyznaczyć obszar, z którego planowane jest pobranie próbki. W przypadku pobierania próbek z obszaru sztucznie wywołanego stanu zapalnego, takiego jak opisane powyżej oparzenie słoneczne, zaplanować wprowadzenie cewnika na brzegu oparzenia.</li>
<li>Oczyścić alkoholem niewielki obszar na przeciwległych krawędziach zmiany lub w miejscu, z którego planowane jest pobranie próbki. Oczyszczone obszary te będą punktami wprowadzenia i wyjścia cewnika. Wstrzyknąć śródskórnie taką ilość lidokainy (potwierdzoną bladością skóry podczas wstrzykiwania), aby utworzyć bardzo mały pęcherzyk (maksymalnie 2 mm). Wstrzyknięcie tak ograniczonej ilości lidokainy śródskórnie w punktach wejścia i wyjścia cewnika do mikrodializy nie powinno zmienić wyników bioanalizy, a sprawia, że wprowadzenie cewnika jest znacznie mniej bolesne dla badanych.</li>
<li>Stosując techniki aseptyczne, wprowadzić cewniki do mikrodializy przy pomocy przymocowanej igły 23G wzdłuż badanej powierzchni skóry. Głębokość wprowadzenia znajduje się na granicy skóry właściwej (cutis) i tkanki podskórnej (subcutis). Wprowadzenie na odpowiednią głębokość można zweryfikować optycznie. Podczas przesuwania igły i przymocowanego cewnika do przodu, igła powinna spowodować lekkie pofałdowanie skóry oraz jej pewne zblednięcie. Nie powinno wystąpić krwawienie. Jeśli wystąpi krwawienie, oznacza to, że igła znajduje się głębiej niż zamierzono i należy skorygować głębokość wprowadzenia. Po przebiciu igłą punktu wyjścia ze skóry, przepłukać cewniki 1% roztworem płynu Ringera z mleczanami wzbogaconym albuminami, aż do pojawienia się kropel wzdłuż cewnika. Wykonuje się to poprzez ostrożne wprowadzenie końcówki igły strzykawki (igła 23G) do dystalnego końca cewnika do mikrodializy i powolne wstrzykiwanie roztworu.</li>
<li>Po przepłukaniu cewnika delikatnie pociągnąć za igłę, aby przeprowadzić przymocowany cewnik przez skórę. Wymagana jest delikatna obsługa, ponieważ cewniki mają małą średnicę i w konsekwencji są kruche. Wyciągać cewnik, aż zostanie całkowicie przeprowadzony przez skórę, tzn. aż podstawa szerszej rurki plastikowej osłaniającej dystalny koniec cewnika dotknie skóry w punkcie wejścia. Jak wspomniano powyżej, brak lub minimalne krwawienie na koniec procedury potwierdza optymalne rozmieszczenie cewnika.</li>
<li>Przymocować dystalny koniec cewnika do końcówki igły 23G strzykawki znajdującej się w statywie pompy infuzyjnej. Należy zachować ostrożność, aby nie przebić igłą ścianki cewnika, co mogłoby spowodować wyciek.</li>
<li>Odciąć igłę z proksymalnego końca cewnika.</li>
<li>Używając różowej taśmy o szerokości ¼ cala, przymocować przygotowaną probówkę Microcent 1,5 ml do skóry w pobliżu miejsca wyjścia cewnika. Umieścić końcówkę cewnika w probówce, aby umożliwić zbieranie mikrodializatu. Uruchomić pompę perfuzyjną z ustaloną wcześniej prędkością i okresowo sprawdzać, czy objętość podana i zebrana są zgodne. W przypadku niezgodności objętości należy wykluczyć wyciek z miejsca wejścia do skóry (czasami można to rozwiązać, mocniej dociskając część cewnika osłoniętą rurką plastikową do miejsca wejścia w skórę). Alternatywnie, jeśli objętości podane i zebrane nie są zgodne, może być konieczna wymiana cewnika.</li>
<li>Po zakończeniu pobierania, próbki umieszcza się na suchym lodzie do czasu przechowywania w temperaturze -80ºC.</li>
</ol>

<ol><li>Angst, M. S., Clark, J. D., Carvalho, B., Tingle, M., Schmelz, M., Yeomans, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+profile+in+human+skin+in+response+to+experimental+inflammation%2C+noxious+stimulation+and+administration+of+a+COX-inhibitor%3A+A+microdialysis+study%5BTitle%5D)+AND+%22Pain%22%5BJournal%5D)">Cytokine profile in human skin in response to experimental inflammation, noxious stimulation and administration of a COX-inhibitor: A microdialysis study.</a> Pain. 139, 15-27 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Połączone zastosowanie technik mikrodializy i technologii wielotorowych testów immunoanalitycznych stanowi wartościową metodę bioanalizy in-vivo u ludzi w czasie rzeczywistym, dostarczającą informacji o zdarzeniach biochemicznych w analizowanej tkance. W połączeniu z testami behawioralnymi, takimi jak testy bólu, metoda ta pozwala na badanie złożonych oddziaływań substancji biochemicznych pośredniczących w bólu i zapaleniu. Metoda ta jest obiecująca w zakresie 1) identyfikacji specyficznych dla tkanki biomarkerów pośredn...

<table><tbody><tr><td>Kaniula do mikrodializy</td><td>Narzędzie</td><td>Dermal Dialysis</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pompa 22</td><td>Narzędzie</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552219</td><td></td></tr><tr><td>Multitester Saalmann SBB LT 400</td><td>Narzędzie</td><td>Saalmann GmbH</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Radiometr RM-12 IP-65</td><td>Narzędzie</td><td>Dr. Grobel UV Elektronik GmbH</td><td>82120000/81112100</td><td></td></tr><tr><td>Kompletny inhibitor proteaz</td><td>Odczynnik</td><td>Roche Group</td><td>11836145001</td><td></td></tr><tr><td>Probetka do mikrocentryfugi</td><td>Narzędzie</td><td>E&amp;amp;K Scientific</td><td>380150-X</td><td></td></tr><tr><td>Albumina 5%</td><td>Odczynnik</td><td>ZLB Behring</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Płyn Ringera z mleczanami</td><td>Odczynnik</td><td>Hospira Inc.</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Xylocaine-MPF</td><td>Inne</td><td>AstraZeneca</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1mL</td><td>Narzędzie</td><td>BD Biosciences</td><td>309602</td><td></td></tr></tbody></table>

ludzki bioanaliza in vivo do tkankowo swoistego pomiaru mediatorów nocyceptywnych i zapalnych

Human In-Vivo Bioassay for the Tissue-Specific Measurement of Nociceptive and Inflammatory Mediators

Niniejszy bioassay in vivo u ludzi może być wykorzystany do badań z udziałem ochotników oraz pacjentów. Próbki pobiera się z odpowiednich miejsc tkankowych, np. ze skóry, za pomocą aseptycznie wprowadzonych cewników do mikrodializy (Dermal Dialysis, Erlangen, Niemcy). W niniejszym przykładzie przedstawiono pobieranie płynu śródmiąższowego z eksperymentalnie wywołanego stanu zapalnego skóry u ochotników. Pobieranie próbek można łączyć z innymi testami eksperymentalnymi. Przykładowo, jednoczesna ocena lokalnie uwalnianych substancji biochemicznych oraz subiektywnej wrażliwości na bodźce bólowe w skórze z eksperymentalnym stanem zapalnym pozwala na ustalenie kluczowego związku biochemiczno-behawioralnego w celu identyfikacji biomarkerów bólu i stanu zapalnego. Przedstawiony assay w żywym organizmie człowieka umożliwia uzyskanie wglądu w mechanizmy procesów specyficznych dla danej tkanki, które leżą u podstaw bólu i/lub stanu zapalnego. Metoda ta jest również odpowiednia do badania skuteczności istniejących lub nowych interwencji – takich jak nowe kandydaty na leki – ukierunkowanych na leczenie stanów bolesnych i/lub zapalnych.

Niniejszy artykuł zawiera szczegółowy opis zastosowania technik mikrodializy do pobierania płynu śródmiąższowego z eksperymentalnych zmian zapalnych skóry u badanych osób. Próbki płynu śródmiąższowego są zazwyczaj przetwarzane przy użyciu multipleksowych immunoanaliz z użyciem tablic koralików (multiplex bead array immunoassays), co pozwala na oznaczanie do 100 analitów w próbkach o objętości tak małej jak 50 mikrolitrów.

Przedstawiono technikę pobierania in-vivo próbek płynu śródmiąższowego z odpowiednich miejsc w tkankach (w tym przypadku z eksperymentalnie wywołanego stanu zapalnego skóry) w celu pomiaru substancji biochemicznych pośredniczących w bólu i zapaleniu.

Ludzki bioanaliza in vivo do tkankowo swoistego pomiaru mediatorów nocyceptywnych i zapalnych

Niniejszy test biologiczny in vivo u ludzi może być wykorzystany do badania ochotników oraz pacjentów. Próbki pobiera się z odpowiednich miejsc w tkankach, takich jak skóra, za pomocą...

Film rozpoczyna się 24 godziny po indukowaniu eksperymentalnego oparzenia słonecznego na udzie pacjenta przy użyciu skalibrowanego źródła światła UV. Po zastosowaniu znieczulenia miejscowego cewnik do mikrodializy jest wprowadzany pomiędzy nacięcia a tkankę podskórną, a następnie przeciągany przez skórę. Do proksymalnego końca cewnika podłączona jest strzykawka perfuzyjna, a uruchomienie pompy perfuzyjnej wywoła przepływ i umożliwi pobór mikrolyzatu.Po pobraniu próbki można przechowywać w temperaturze -80 °C do momentu przeprowadzenia analizy mediatorów nocyceptywnych i zapalnych. Cześć, jestem Martin Angst z Katedry Znieczuleń Uniwersytetu Stanforda. A ja jestem Martha Tingle, starsza pielęgniarka badawcza i kierownik Human Pain Laboratory, założonego przez dr. Angsta w 1995 roku tutaj, na Uniwersytecie Stanforda.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę umieszczania cewników do mikrodializy w eksperymentalnie wywołanym stanie zapalnym skóry u uczestników badań z ludzi w celu poboru płynu śródmiąższowego. Technikę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania tkankowo swoistego uwalniania substancji biochemicznych, które mają kluczowe znaczenie dla mediacji bólu i stanu zapalnego. Zacznijm

human-vivo-bioassay-for-tissue-specific-measurement-nociceptive

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Badanie biologiczne in vivo na ludziach w celu tkankowego pomiaru nocyceptywnych i zapalnych mediatorów

Technika pozyskiwania i pomiaru mediatorów biochemicznych w ranie chirurgicznej w określonych punktach czasowych.

Pozyskiwanie i pomiar mediatorów nocyceptywnych i zapalnych w ranach pooperacyjnych

Przedstawiono algorytmy oceniające progi bólu cieplnego i mechanicznego w eksperymentalnie wywołanym stanie zapalnym skóry u badanych ludzi. Dwa paradygmaty testowania bólu niezależnie badają przetwarzanie nocyceptywne przez dwie główne populacje obwodowych włókien nerwowych przekazujących ból, tj. nieumielinowane włókna C oraz małe umielinowane włókna A-delta.

Wyznaczanie progu bólu termicznego i mechanicznego w zapaleniu skóry u ludzi

Ten film demonstruje ilościowe określanie mediatorów stanu zapalnego podczas infekcji poprzez inkubację ludzkich komórek odpornościowych pochodzących z tkanki płucnej z Haemophilus influenzae. Cytometria przepływowa służy do pomiaru fluorescencji cytokin w znakowanych limfocytach, korelującej z produkcją cytokin prozapalnych w odpowiedzi na infekcję bakteryjną.

Kwantyfikacja mediatorów stanu zapalnego w zakażonych komórkach pochodzących z tkanek ludzkich

W celu zbadania zmian nocyceptywnych wewnątrznaskórkowych włókien nerwowych (IENF) w bolesnych neuropatiach (PN), opracowaliśmy protokoły, które mogłyby bezpośrednio badać trójwymiarowe zmiany morfologiczne obserwowane w nocyceptywnych IENFach.  Trójwymiarowa analiza IENF ma potencjał do oceny zmian morfologicznych IENF w PN.

Trójwymiarowe obrazowanie nocyceptywnych śródnaskórkowych włókien nerwowych w biopsjach ludzkiej skóry

Opisujemy nieinwazyjną metodę obrazowania do rozróżniania etapów zapalnych. Ogólnoustrojowe dostarczanie luminolu ujawnia obszary ostrego stanu zapalnego zależne od aktywności MPO w neutrofilach. Natomiast wstrzyknięcie lucygeniny pozwala na wizualizację przewlekłego stanu zapalnego zależnego od aktywności Phox w makrofagach.

In vivo (in vivo) Metoda obrazowania w celu rozróżnienia ostrego i przewlekłego stanu zapalnego

Opisujemy protokół do badania rozwoju hiperalgezji i tolerancji wywołanej opioidami u myszy. Opierając się na pomiarze termicznych i mechanicznych reakcji nocyceptywnych zwierząt nieleczonych morfiną i leczonych morfiną, pozwala na ilościowe określenie wzrostu wrażliwości na ból (hiperalgezja) i spadku analgezji (tolerancji) związanego z przewlekłym podawaniem opiatów.

Ocena hiperalgezji wywołanej morfiną i tolerancji przeciwbólowej u myszy przy użyciu termicznych i mechanicznych modalności nocyceptywnych

Ten artykuł wyjaśnia zastosowanie obrazowania fluorescencyjnego za pomocą aktywowanej sondy do obrazowania optycznego do wizualizacji in vivo aktywności kluczowych metaloproteinaz macierzy w dwóch różnych eksperymentalnych modelach zapalenia.

Nieinwazyjne obrazowanie optyczne fluorescencji in vivo zapalnej aktywności MMP przy użyciu aktywowalnego środka do obrazowania fluorescencyjnego

Zmiany morfologiczne występują w komórkach fibroblastów reagujących immunologicznie po aktywacji i sprzyjają zmianom w rekrutacji komórek. Wykorzystanie obrazowania 2-fotonowego w połączeniu z genetycznie modyfikowanym białkiem 1 specyficznym dla fibroblastów (FSP1)-cre; Linia myszy tdTomato floxed-stop-floxed (TB / TB) i zielony fluorescencyjnie oznaczony lipopolisacharyd-FITC, możemy zilustrować wysoce specyficzny wychwyt lipopolisacharydu w fibroblastach skóry i zmiany morfologiczne in vivo.

Dwukolorowe obrazowanie 2-fotonowe in vivo genetycznie znakowanych komórek reporterowych w skórze

Opisano standardowy protokół do badania aktywności przeciwnowotworowej i związanej z nią toksyczności IL-1α w syngenicznym mysim modelu HNSCC.

Ocena aktywności przeciwnowotworowej in vivo nanocząstek bezwodnika IL-1α

Uznane metody immunochemiczne do pomiaru przekaźników peptydowych in vivo polegają na mikrodializie lub masowym pobieraniu płynów w celu uzyskania próbki do analizy offline. Cierpią one jednak z powodu ograniczeń czasoprzestrzennych. Niniejszy protokół opisuje wytwarzanie i zastosowanie pojemnościowego bioczujnika immunosondy, który pokonuje ograniczenia istniejących technik.

Czasowo-rozdzielczy pomiar dynamiki neuropeptydów in vivo za pomocą pojemnościowej immunosondy w sercu świni

Protokół opisuje, jak mierzyć hiperalgezję kolana u myszy. Pokazujemy przykłady ostrego bólu kolana na mysich oraz modeli choroby zwyrodnieniowej stawów (OA).

Ocena hiperalgezji kolana u myszy za pomocą pomiaru ciśnienia

Poznaj technikę mikrodializy do pobierania płynu międzykomórkowego z zapalonej skóry ludzkiej. Ta metoda umożliwia pomiar mediatorów nocyceptywnych i zapalnych w badaniach nad bólem.

Ludzki bioanaliza in vivo do tkankowo swoistego pomiaru mediatorów nocyceptywnych i zapalnych

Przeglądaj więcej filmów