Name: Macierz mikronapędów do przewlekłego nagrywania in vivo: produkcja napędów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-20T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 3 s
Description: Poznaj montaż lekkiej macierzy mikronapędów z 21 niezależnie regulowanymi śrubami do przewlekłych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów. Ta metoda umożliwia precyzyjne pozycjonowanie elektrod podczas ruchu zwierzęcia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Linusowi D. Sunowi oraz Jeenah Jung, którzy zapoczątkowali w naszym laboratorium stosowanie zaprojektowanych komputerowo i wydrukowanych w technologii 3D prowadnic do rejestracji danych u myszy. Ponadto pragniemy podziękować wszystkim byłym i obecnym członkom laboratorium Wilsona za ich wkład w rozwój technologii mikro-prowadnic i tetrod w naszym laboratorium.

<ol>
<li>Przegląd matrycy mikrozapędów Kompletna matryca mikrozapędów składa się z kilku głównych komponentów (Rys. 1):<ol>
<li>Zaprojektowana komputerowo plastikowa podstawa, w której osadzonych jest 21 niezależnie ruchomych mikrozapędów. </li>
<li>Kaniula u dołu podstawy, w której zgromadzony jest zestaw stacjonarnych prowadnic dla tetrod.</li>
<li>21 mikrozapędów, z których każdy prowadzi jedną tetrodę i może być indywidualnie przesuwany za pomocą śruby.</li>
<li>Płyta interfejsu elektrod służąca do połączenia tetrod z przedwzmacniaczami.</li>
<li>Stożek ochronny (niewidoczny na Rys. 1) </li>
<li>W w pełni zmontowanej matrycy mikrozapędów plastikowa podstawa utrzymuje wszystkie mikrozapędy. Każdy mikrozapęd prowadzi pojedynczą tetrodę. Tetroda jest połączona elektrycznie z płytą interfejsu elektrod na górze matrycy i przechodzi przez stacjonarną prowadnicę, aby wyjść w stronę mózgu u dołu matrycy. Obracanie śruby każdego mikrozapędu powoduje wysunięcie lub cofnięcie tetrody.</li>
</ol></li>
 
<li>Projekt plastikowej podstawy Podstawę zespołu mikrozapędów projektujemy w oprogramowaniu CAD 3D (SolidWorks). Zaletą tego wewnętrznego procesu projektowania jest szybka realizacja i elastyczność. W laboratorium Wilsona zaprojektowaliśmy wiele wariantów tej części, dostosowanych do specyficznych wymagań każdego eksperymentu. Plik modelu 3D jest przesyłany do biura usług, gdzie jest on drukowany z żywicy ciekłej utwardzanej laserowo przy użyciu stereolitografii. Czas realizacji wynosi zaledwie 2 dni. Powstała część jest lekka, wielorazowa i może być obrabiana w celu wykonania gwintu. W niniejszym protokole użyjemy podstawy zapędowej zaprojektowanej dla jednego miejsca rejestracji, która pomieści 21 mikrozapędów. Projekt SolidWorks jest dostępny na żądanie.</li>
 
<li>Przygotowanie plastikowej podstawy Plastikowa podstawa jest obrabiana tak, aby pomieścić mikrozapędy oraz śruby do zamocowania płyty interfejsu elektrod i stożka ochronnego. Ponieważ nie jest możliwe niezawodne wydrukowanie gładkich otworów przelotowych w plastikowej podstawie, projektujemy otwory o zbyt małej średnicy, a następnie powiększamy je poprzez wiercenie. Przed wierceniem przy bardzo niskiej prędkości należy starannie wyrównać wiertło z osią istniejącego otworu. Do tego zadania dobrze nadaje się ręczna wiertarka z regulowaną prędkością i momentem obrotowym.<ol>
<li>Wywierć 21 otworów pilotażowych dla śrub mikrozapędów (zewnętrzny pierścień), używając wiertła #61.</li>
<li>Wywierć 21 otworów dla rurek wsporczych mikrozapędów (wewnętrzny pierścień), używając wiertła #65. </li>
<li>Wywierć otwory, które posłużą do zamocowania płyty interfejsu elektrod i stożka ochronnego, używając wiertła 1,55 mm. </li>
<li>Wciśnij na pasowanie tulejkę (cienkościenna rurka ze stali nierdzewnej 20 Ga o długości 5 mm) do każdego otworu w wewnętrznym pierścieniu, używając pęsety lub szczypiec, tak aby była ona zrównana z plastikową podstawą. Tulejki zapewniają płynny ruch rurek wsporczych mikrozapędów. Następnie wykonuje się gwinty we wszystkich otworach przeznaczonych na śruby. W drukowanych tworzywach sztucznych gwintowniki formujące tworzą trwalsze gwinty niż typowe gwintowniki tnące. Ten rodzaj gwintownika wymaga większych otworów pilotażowych. Używając ręcznego uchwytu do gwintowników:</li>
 
<li>Nawierć otwory dla śrub mikrozapędów, używając gwintownika dopasowanego do rozmiaru śruby (M1,2x0,25) oraz suchego smaru. Aby ułatwić wyrównanie gwintownika z otworem pilotażowym, wsuń kawałek rurki 23 Ga do sąsiedniej tulejki.</li>
<li>Projekt naszej plastikowej podstawy zawiera prowadnice startowe dla każdego otworu na śruby mikrozapędów, aby upewnić się, że początkowe gwinty nie zostaną uszkodzone podczas procesu gwintowania. Po wykonaniu wszystkich gwintów prowadnice te można łatwo odłamać za pomocą żyletki.</li>
<li>Nawierć otwory na śruby płyty interfejsu elektrod i stożka ochronnego, używając gwintownika 1-72. </li>
</ol></li>
 
<li>Wkładanie prowadnic elektrod <ol> 
<li>Aby przygotować kaniulę utrzymującą wszystkie stacjonarne prowadnice elektrod, odetnij kawałek rurki ze stali nierdzewnej 13 Ga o długości 1,5 cm i zmatowij powierzchnię szlifierką Dremel, aby zwiększyć przyczepność akrylu dentystycznego.</li>
<li>Wsuń tę kaniulę do otworu u dołu plastikowej podstawy, upewnij się, że jest ona współosiowa z osią pionową zapędu i zabezpiecz ją akrylem dentystycznym lub epoksydem. Pozostaw od 5 do 7 mm kaniuli wystającej na zewnątrz, aby ułatwić implantację chirurgiczną.</li>
<li>Odetnij żyletką 21 stacjonarnych prowadnic elektrod (elastyczna rurka polimidowa, średnica wewnętrzna: 0,0071", średnica zewnętrzna: 0,0116") do długości 6 cm. </li>
<li>Wsuwaj prowadnice po jednej do tulejek na górze podstawy zapędowej, aż przejdą całkowicie przez kaniulę kolektorską na dole. Wizualnie sprawdź, czy nie ma załamań lub nadmiernych zgięć i w razie potrzeby wymień rurki. Aby ułatwić wkładanie i wyrównanie równoległe prowadnic tetrod, można zacząć od wsunięcia całego pęczka 21 prowadnic do kaniuli kolektorskiej od dołu. Następnie, po jednej, wyciągaj prowadnicę z pęczka i wsuwaj ją od góry plastikowej podstawy przez otwór, który pozostawiła w pęczku. </li>
<li>Wsuń prowadnice w dół, aż będą wystawać tylko 1-2 mm ponad górną krawędź plastikowej podstawy. Nałóż niewielką ilość rzadkiego kleju cyjanoakrylowego na rurki w miejscu, gdzie opuszczają kaniulę kolektorską, uważając, aby klej nie wpłynął do wnętrza prowadnic.</li>
<li>Użyj nowej żyletki, aby odciąć nadmiar pęczka prowadnic u dołu kaniuli kolektorskiej.</li>
 </ol> </li>
<li>Wykonanie mikrozapędów Każdy mikrozapęd składa się z niestandardowej śruby i pustej rurki wsporczej (Rys. 2). Śruba i rurka wsporcza są połączone tak, że kołnierz śruby jest zatopiony w akrylu, co pozwala śrubie swobodnie się obracać (Rys. 2B). Śruba jest wkręcona w plastikową podstawę, a rurka wsporcza jest przesuwana w górę lub w dół podczas obracania śruby, co powoduje wysunięcie lub cofnięcie prowadzonej tetrody. Dla ułatwienia regulacji na zwierzęciu w trakcie zachowania, łeb śruby ma kształt półcylindra. Wykonaj niestandardowy śrubokręt do tej śruby: <ol>
<li>Odetnij 5 cm rurki ze stali nierdzewnej 15 Ga.</li>
<li>Weź jedną z niestandardowych śrub i zeszlifuj wystający kołnierz.</li>
<li>Wsuń śrubę do rurki, aż góra śruby zrówna się z końcem rurki. </li>
<li>Zgnieć rurkę wokół gwintów śruby wielokrotnie za pomocą szczypiec nastawnych, tak aby śruba nie mogła obracać się względem kaniuli. </li>
<li>Użyj uchwytu do gwintowników, aby trzymać ten niestandardowy śrubokręt. Do wykonania mikrozapędów używamy wydrukowanej w 3D plastikowej formy z małymi wgłębieniami (3 mm x 5 mm, głębokość 2 mm). Każde wgłębienie ma dwa otwory w dolnej powierzchni, w odstępie 2 mm, dla rurki wsporczej i śruby. Alternatywnie formy można wykonać z tworzywa technicznego, takiego jak Delrin, używając wiertarki stołowej do wykonania wgłębienia i otworów.</li>
 
<li>Przygotuj formę, czyszcząc otwór na kaniulę wsporczą za pomocą igły 23 Ga i wykonując gwint w otworze na śrubę, zgodnie z opisem dla plastikowej podstawy powyżej.</li>
<li>Wyłóż wnętrze wgłębienia smarem teflonowym lub cienką warstwą wazeliny, aby umożliwić wyjęcie utwardzonego akrylu dentystycznego z formy. </li>
<li>Nałóż smar teflonowy na śrubę i wsuń ją do formy za pomocą wykonanego śrubokręta, aż gwinty znajdą się tuż poniżej dna wgłębienia. </li>
<li>Zmatowij górne 2-3 mm rurki wsporczej o długości 14 mm (rurka ze stali nierdzewnej 23 Ga) za pomocą tarczy szlifierskiej, aby zwiększyć przyczepność akrylu dentystycznego. Wsuń ją do formy, aż góra kaniuli znajdzie się w połowie drogi między górą wgłębienia a górą śruby.</li>
<li>Wlej akryl dentystyczny do wgłębienia. Stosuj ruchy mieszające, aby upewnić się, że akryl dentystyczny wypełni wszystkie przestrzenie wokół śruby i rurki wsporczej. Usuń pęcherzyki powietrza za pomocą małej igły. </li>
<li>Odczekaj, aż akryl dentystyczny całkowicie utwardzi się (15-30 minut), a następnie wyjmij mikrozapęd z formy, obracając śrubę przeciwnie do ruchu wskazówek zegara. </li>
<li>Ważne jest przeprowadzenie kontroli jakości mikrozapędów. Sprawdź utwardzony akryl dentystyczny pod kątem pęknięć i/lub pęcherzyków powietrza, które zazwyczaj są spowodowane zbyt gęstym lub zbyt rzadkim akrylem. Upewnij się również, że śruba i rurka wsporcza są do siebie równoległe i że śruba obraca się płynnie. Śruby i rurki wsporcze mikrozapędów, które nie spełniają tych kryteriów, mogą zostać wyłamane z akrylu dentystycznego i poddane recyklingowi. </li>
<li>Powtarzaj kroki od 5.6 do 5.11, aż uzyskasz 21 mikrozapędów. </li>
</ol></li>
 
<li>Montaż końcowy matrycy mikrozapędów<ol> 
<li>Umieść każdy mikrozapęd w plastikowej podstawie zapędowej. Każda rurka wsporcza mikrozapędu powinna poruszać się płynnie zarówno wewnątrz swojej tulejki, jak i nad stacjonarną prowadnicą. Sprawdź, czy prowadnice nie wyginają się podczas opuszczania mikrozapędu. </li>
<li>Gdy mikrozapędy są całkowicie opuszczone, nałóż cienką warstwę akrylu dentystycznego do wnętrza podstawy zapędowej, aby przymocować prowadnice elektrod na miejscu. </li>
<li>Uwaga: nieopuszczenie mikrozapędów do samego końca przed dodaniem akrylu dentystycznego spowoduje wciągnięcie akrylu w górę tulejek i zablokowanie ruchu mikrozapędów. </li>
<li>Oznacz mikrozapędy numerami 1-21. </li>
<li>Odwróć matrycę zapędową do góry nogami i zrób zdjęcie pęczkowi prowadnic. Zdjęcie to posłuży do zmapowania położenia prowadnicy odpowiadającej każdemu mikrozapędowi. </li>
<li>Podnieś wszystkie mikrozapędy o kilka mm.</li>
<li>Wsuń polimidową rurkę nośną (0,005") do każdej prowadnicy od dołu podstawy zapędowej. Pozwól rurce nośnej wystawać 1-2 mm ponad w pełni opuszczony mikrozapęd i zaznacz na zdjęciu tożsamość odpowiadającego mu mikrozapędu.</li>
<li>Przyklej rurkę nośną do rurki wsporczej mikrozapędu, używając 5-minutowego epoksydu lub kleju cyjanoakrylowego. Pamiętaj, że zbyt rzadki klej lub epoksyd spłynie po kaniuli wsporczej i zablokuje swobodny ruch mikrozapędu lub, co gorsza, przytwierdzi go do kaniuli prowadzącej. Jeśli tak się stanie, dana jednostka mikrozapędu nie może być użyta. </li>
<li>Całkowicie opuść wszystkie mikrozapędy. Odetnij wszystkie rurki nośne równo u dołu kaniuli kolektorskiej za pomocą nowej żyletki.</li>
<li>Na koniec zamontuj płytę interfejsu elektrod Neuralynx do podstawy zapędowej za pomocą dwóch śrub (rozmiar: 1-72, długość: 3/16"). </li>
</ol></li>
</ol>
W tym momencie macierz napędów jest gotowa do załadowania tetrodami. Tematami kolejnego artykułu wideo będą wykonanie tetrod, sposób ich ładowania do mikro-napędów oraz przygotowanie macierzy napędów do implantacji chirurgicznej.
<img src="/files/ftp_upload/1094/Figure1.png" alt="Schemat neuronaukowy przedstawiający interfejs elektrod, mikronapędy, plastikową podstawę oraz układ kaniuli zbierającej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Model gotowego zestawu mikronapędów. Zestaw mikronapędów składa się z kilku głównych komponentów: plastikowej podstawy napędów; kaniuli zbierającej, przez którą tetrody wnikają do mózgu; 21 mikronapędów, z których każdy napędza pojedynczą tetrodę; oraz płytki interfejsu elektrod łączącej się z przedwzmacniaczami.
<img src="/files/ftp_upload/1094/Figure2.png" alt="Projekt specjalistycznej śruby do stanu równowagi statycznej; schemat techniczny z pomiarami i opisanymi komponentami." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 2"> Rycina 2. Specjalistyczne śruby do mikro-napędu. A. Rysunki techniczne projektu specjalistycznej śruby. Śruba posiada część gwintowaną (M1.2x0.25; średnica 1.2 mm, 0.25 mm / obrót), łeb w kształcie półcylindra dopasowany do naszego specjalistycznego śrubokręta oraz część gładką z kołnierzem (patrz szczegół). B. Model kompletnego mikro-napędu. Rurka wsporcza i specjalistyczna śruba są połączone cementem dentystycznym. Kołnierz na śrubie jest zatopiony w cemencie dentystycznym, co umożliwia swobodny obrót podczas przesuwania rurki wsporczej w górę lub w dół.
Pliki dodatkowe
Zaprojektowaliśmy wydrukowaną podstawę napędu, stożek ochronny oraz formę do konstrukcji mikro-napędów w oprogramowaniu SolidWorks 2008 3D CAD:
<ul style="list-style-type:none;">
<li>Pobierz plik:<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1094/DriveBase.SLDPRT"> DriveBase.sldprt</a>, który zawiera modele podstawy napędu, stożka ochronnego i nakrętki.</li>
<li>Pobierz plik:<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1094/MicroDriveMold.SLDPRT"> MicroDriveMold.sldprt</a>, który zawiera model formy mikro-napędu</li>
</ul>
Biuro usług druku 3D nie może przetwarzać natywnych plików Solidworks; zamiast tego wymaga plików projektowych w formacie CAD stereolitografii (STL). Dla osób, które nie mają dostępu do oprogramowania Solidworks, a chcą skorzystać z części drukowanych użytych w artykule wideo, udostępniamy również projekty w formacie STL:
<ul style="list-style-type:none;">
<li>Pobierz plik: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1094/DriveBase.STL"> DriveBase.stl</a>, który zawiera model podstawy napędu</li>
<li>Pobierz plik: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1094/MicroDriveMold.STL"> MicroDriveMold.stl</a>, który zawiera model formy mikronapędu</li>
<li>Pobierz plik: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1094/ProtectionCap.STL"> ProtectionCap.stl</a>, który zawiera model nakrętki stożka ochronnego</li>
<li>Pobierz plik: <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1094/ProtectionCone.STL"> ProtectionCone.stl</a>, który zawiera model stożka ochronnego</li>
</ul>
Poprawki do tych plików oraz dodatkowe modele są śledzone na <a href="https://github.com/wilsonlab/CAD-Files/tree/master/stl">githubie</a>.

<ol><li>Yamamoto, J., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+chronically+implantable+precision+motorized+microdrive+array+for+freely+behaving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Large-scale chronically implantable precision motorized microdrive array for freely behaving animals.</a> J. Neurophysiol. 100 (4), 2430-2440 (2008).</li>
</ol>

Niniejszy protokół opisuje ogólne cechy procesu budowy mikropopychacza (micro-drive). Został on z powodzeniem zmodyfikowany w celu stworzenia macierzy popychaczy z wieloma punktami rejestracji lub mniejszych macierzy do pomiarów u myszy. Oprócz rejestracji z hipokampa wielu badaczy wykorzystuje te urządzenia do celowania w struktury korowe i podkorowe. W celu rejestracji z głębszych struktur mózgu może być wymagane zastosowanie dłuższych śrub. Dzięki rozbudowanej modyfikacji podstawy popychacza, zamiast modeli obracanych...

<table><tbody><tr><td>Plastikowe elementy drukowane w 3D</td><td>Materiał</td><td>American Precision Prototyping (www.approto.com)</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>rurki ze stali nierdzewnej</td><td>Materiał</td><td>Small Parts (www.smallparts.com)</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Proszek do cementu dentystycznego</td><td>Materiał</td><td>A-M Systems (www.a-msystems.com)</td><td>525000</td></tr><tr><td>Rozpuszczalnik do cementu dentystycznego</td><td>Materiał</td><td>A-M Systems</td><td>526000</td></tr><tr><td>Płyta interfejsu elektrod</td><td>Materiał</td><td>Neuralynx (www.neuralynx.com)</td><td>EIB-81</td></tr><tr><td>śruby do mikro-napędu</td><td>Materiał</td><td>Advanced Machining and Tooling (www.amtmfg.com)</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&amp;rsquo;Smar do gwintowania Tap-Ease&amp;rsquo; </td><td>Narzędzie</td><td>AGS Company</td><td>TA-2</td></tr><tr><td>Rurki polimidowe </td><td>Materiał</td><td>IWG High Performance Conductors (www.iwghpc.com)</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Wiertarko-wkrętarka akumulatorowa </td><td>Narzędzie</td><td>DeWalt (www.dewalt.com)</td><td>DC750KA </td></tr><tr><td>Zestaw narzędzi rotacyjnych o regulowanej prędkości z elastycznym wałem </td><td>Narzędzie</td><td>Dremel (www.dremel.com)</td><td>3956-02</td></tr><tr><td>Żyletki </td><td>Narzędzie</td><td>VWR (www.vwr.com)</td><td>55411-050</td></tr><tr><td>Szkiełko zegarkowe </td><td>Narzędzie</td><td>VWR</td><td>66112-107</td></tr><tr><td>Gwintownik do śrub niestandardowych</td><td>Narzędzie</td><td>Balax</td><td>01302</td></tr><tr><td>Gwintowniki</td><td>Narzędzie</td><td>Small Parts</td><td>HSBT-0172, HSBT-0080 </td></tr><tr><td>Uchwyt precyzyjny</td><td>Narzędzie</td><td>Vargus</td><td>3SHC1--I </td></tr><tr><td>Wiertła</td><td>Narzędzie</td><td>Small Parts</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Imadło stołowe</td><td>Narzędzie</td><td>Panavise</td><td>301</td></tr><tr><td>Pinceta Dumont nr 2</td><td>Narzędzie</td><td>Stoelting (www.stoeltingco.com)</td><td>52100-27</td></tr><tr><td>Epoksyd 5-minutowy</td><td>Narzędzie</td><td>Allied Electronics (www.alliedelec.com)</td><td>&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pinceta Accu-Tek z końcówką z włókna węglowego</td><td>Narzędzie</td><td>Aven (www.aveninc.com)</td><td>18768 (Pattern 304)</td></tr><tr><td>Mikronożyczki do sekcji</td><td>Narzędzie</td><td>Biomedical Research Instruments (www.biomedinstr.com)</td><td>25-1000</td></tr><tr><td>Szczypce Xcelite 378M</td><td>Narzędzie</td><td>Newark</td><td>96F8903</td></tr><tr><td>mini uchwyt precyzyjny</td><td>Narzędzie</td><td>MSC Industrial Supply (www.mscdirect.com)</td><td>00920314 </td></tr></tbody></table>

układ mikro-napędów do przewlekłych pomiarów in vivo: konstrukcja napędu

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Drive Fabrication

Przewlekłe rejestrowanie dużych populacji neuronów jest cenną techniką badania funkcji obwodów neuronalnych u czuwających, wykazujących określoną aktywność behawioralną szczurów. Lekkie urządzenia rejestrujące, wyposażone w matryce tetrod o wysokiej gęstości, umożliwiają jednoczesne monitorowanie aktywności od kilkunastu do kilkuset pojedynczych neuronów. W niniejszym opracowaniu opisujemy protokół wykonania matrycy mikro-napędów zawierającej dwadzieścia jeden niezależnie ruchomych mikro-napędów. Urządzenie to było z sukcesem wykorzystywane w naszym laboratorium do rejestracji z neuronów hipokampa i kory mózgowej. Przedstawiamy sposób przygotowania zaprojektowanej na zamówienie, wydrukowanej w technologii 3D plastikowej podstawy, która będzie utrzymywać mikro-napędy. Demonstrujemy, jak skonstruować poszczególne mikro-napędy oraz jak złożyć kompletną matrycę mikro-napędów. Dalsze przygotowanie matrycy do implantacji chirurgicznej, takie jak wykonanie tetrod, ich wprowadzenie do matrycy oraz pozłacanie, zostało omówione w kolejnym artykule wideo.

W niniejszym protokole demonstrujemy sposób wykonania macierzy mikrodrajwerów do chronicznych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów.

Układ mikro-napędów do przewlekłych pomiarów in vivo: Konstrukcja napędu

Przewlekła rejestracja dużych populacji neuronów jest cenną techniką badania funkcji obwodów neuronalnych u czuwających, wykazujących określoną aktywność szczurów. ...

W niniejszym filmie omówiono montaż lekkiej macierzy mikronapędów składającej się z 21 niezależnie regulowanych mikronapędów śrubowych. Każdy mikronapęd kontroluje pozycję rejestracyjną pojedynczej elektrody. Mikronapędy są zamontowane w zaprojektowanej komputerowo plastikowej podstawie, która stabilizuje je względem czaszki poruszającego się zwierzęcia i gromadzi elektrody w gęsto upakowanym układzie, który może zostać wprowadzony przez niewielki otwór trepanacyjny do mózgu.Podstawa podtrzymuje również płytkę interfejsu elektrod do połączenia z instrumentami rejestrującymi, co umożliwia wygodne podłączanie i odłączanie zwierzęcia na początku i na końcu eksperymentu. Plastikowy stożek przymocowany do podstawy chroni mikronapędy i elektrody przed czynnikami zewnętrznymi w klatce szczura. Cześć, nazywam się Faia Postman i pracuję w laboratorium Matta Wilsona w Instytucie Uczenia się i Pamięci PIKA na Massachusetts Institute of Technology.Dzisiaj zaprezentujemy protokół wykonania macierzy mikroelektrod typu dive. W naszym laboratorium używamy tych macierzy do rejestracji aktywności z dużej populacji neuronów w mózgu szczurów, na przykład z kory mózgowej lub hipokampa. Najpierw pokażemy, w jaki sposób zaprojektowaliśmy naszą macierz mikroelektrod.Następnie udamy się do warsztatu, gdzie Steve i Stewart pokażą nam, jak przetwarzać surowce i jak składać je w pełni funkcjonalne urządzenie. Zatem zacznijmy. Plastikowa podstawa została zaprojektowana przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo i wykonana w niskokosztowym procesie druku 3D.Modelujemy również wszystkie pozostałe komponenty macierzy mikronapędów. Pozwala nam to na precyzyjną kontrolę rozmiaru i masy gotowego napędu. W górnej części plastikowej podstawy znajdują się dwa pierścienie otworów, w których zostaną umieszczone poszczególne mikronapędy.Model 3D jest wysyłany do biura usług, które wykonuje projekt z żywicy utwardzanej laserowo przy użyciu stereolitografii. Powinno to zająć tylko kilka dni, a otrzymana część jest lekka i wielokrotnego użytku. Po otrzymaniu części z biura usług należy ją przygotować do użycia.Przejdźmy zatem do warsztatu. Proces druku 3D nie pozwala na niezawodne drukowanie małych otworów, dlatego w naszych modelach specyfikujemy otwory o mniejszej średnicy. Następnie w warsztacie wiercimy i gwintujemy otwory do wymaganego rozmiaru.Do przygotowania plastikowej podstawy wykorzystuje się trzy wiertła o różnych rozmiarach: wiertło nr 61, wiertło nr 65 oraz wiertło o średnicy 1,55 mm w zewnętrznym pierścieniu podstawy. Należy użyć wiertarki ręcznej z wiertłem nr 61 przy bardzo niskich obrotach, aby przygotować otwory pilotujące, w które później zostaną wkręcone mikroskopijne śruby mocujące. Następnie należy przygotować otwory na rurki wsporcze mikronapędu w części wejściowej podstawy, rozwiercając je wiertłem nr 65.Używając większego wiertła o średnicy 1,55 millimeter, wywierć otwory, które posłużą do przymocowania podstawy do płytki interfejsu elektrody oraz stożka ochronnego. Aby zapewnić płynny ruch w mikro-napędzie, włóż tulejkę ze stali nierdzewnej do wewnętrznego pierścienia otworów. Każdą tulejkę należy wcisnąć za pomocą szczypiec, aż będzie zlicowana z górną krawędzią podstawy.Otwory pilotujące pod śruby należy teraz nagwintować. Należy użyć wkrętaka precyzyjnego (pin vice) do trzymania gwintownika i zastosować smar suchy przed gwintowaniem. Aby wyrównać gwintownik i zapewnić jego właściwe ustawienie, należy upewnić się, że jest on równolegle do rurki o rozmiarze 23 G, którą tymczasowo wstawia się do sąsiedniej tulei.Otwory utrzymujące płytkę interfejsu oraz stożek ochronny muszą zostać nagwintowane. Nagwintuj te otwory ręcznie w ten sam sposób. Konstrukcja oparta na tworzywie sztucznym posiada prowadnicę gwintownika dla każdego otworu pilotażowego pod śrubę, aby upewnić się, że początkowe gwinty nie zostaną uszkodzone podczas procesu gwintowania.Po nagwintowaniu wszystkich otworów pilotujących, zaczepy gwintownika można łatwo odłamać za pomocą żyletki. Elektrody są prowadzone do jednego miejsca na spodzie napędu za pomocą szeregu rurek prowadzących elektrody.Najpierw należy wykonać kaniulę zbiorczą, w której znajdą się wszystkie rurki prowadzące elektrody. Kaniula zbiorcza jest wykonana z odcinka rurki ze stali nierdzewnej o długości 1,5 cm. Kaniula zbiorcza zostanie zamocowana za pomocą cementu stomatologicznego.Aby zwiększyć adhezję, należy ostrożnie zmatowić rurkę za pomocą tarczy szlifierskiej Dremel, a następnie wsunąć tę kaniulę do dolnej części plastikowej podstawy. Należy ją ustawić tak, aby od pięciu do siedmiu milimetrów kaniuli pozostało poza układem mikronapędu. W celu ułatwienia implantacji chirurgicznej należy przymocować kaniulę zbierającą do dolnej części plastikowej podstawy.W przypadku akrylu dentystycznego należy odczekać co najmniej 15 minut do jego utwardzenia. Następnie przygotować rurki prowadzące, wycinając żyletką 21 odcinków poliamidu. Krok ten należy rozpocząć od wprowadzenia wszystkich 21 rurek prowadzących do kaniuli zbierającej znajdującej się w dolnej części podstawy napędu.Zapewni to, że wszystkie probówki będą ustawione równolegle względem siebie. Jeśli probówki w wiązce są zbyt luźno lub zbyt ciasno ułożone, można rozpocząć od mniejszej liczby probówek lub dodać dodatkowe, w zależności od potrzeb. Teraz należy kolejno wyjmować każdą probówkę prowadzącą i wprowadzać ją do jednej z tulei w górnej części napędu.Przeciągnij probówkę w dół przez szczelinę po lewej stronie, za wiązką probówek. Sprawdź, czy prowadnice nie są załamane lub zbyt mocno zgięte i w razie potrzeby wymień je. Dostosuj położenie każdej prowadnicy tak, aby wystawała od jednego do dwóch milimetrów ponad górną krawędź tulei.Teraz nanieś małą kroplę rzadkiego kleju sano acro lake na dno kaniuli zbiorczej. Należy zachować szczególną ostrożność, aby klej nie wpłynął do rurek prowadzących. Następnie, używając nowej żyletki, odetnij wiązkę nadmiarowych rurek na dnie kaniuli zbiorczej.Zweryfikuj pod stereoskopem, czy rurki są równo przycięte i zlicowane z kaniulą. Każda elektroda jest przesuwana za pomocą osobnego mikronapędu, dlatego należy wykonać 21 mikronapędów, a następnie wstawić je do plastikowej podstawy. Każdy mikronapęd składa się z niestandardowej śruby i pustej rurki wsporczej, które są ze sobą połączone.Za pomocą akrylu stomatologicznego elektroda zostanie przeprowadzona przez rurkę wsporczą. Śruba posiada część pozbawioną gwintu z niewielkim kołnierzem, który zostaje zatopiony w akrylu stomatologicznym, co pozwala śrubie na swobodne obracanie się w ten sposób. Wkręcanie śruby w plastikową podstawę powoduje wysuwanie lub cofanie elektrody.Łeb śruby ma kształt półcylindra. Zanim będziemy mogli wykonać mikronapędy, musimy przygotować śrubokręt do odkręcania naszych niestandardowych śrub. Nasz improwizowany śrubokręt wykonuje się poprzez wzięcie niestandardowej śruby i całkowite zeszlifowanie kołnierza otaczającego półcylindryczny łeb.Wsuń łeb śruby do rurki o średnicy 15 G i długości 5 cm, aż zostanie całkowicie w niej zamknięta. Następnie zgnieć rurkę wokół gwintów śruby, aby unieruchomić ją wewnątrz i zapobiec obrotom. Przymocuj miniimadło ręczne, aby służyło jako uchwyt i w ten sposób powstanie śrubokręt.Mikronapęd wykonuje się poprzez odlewanie akrylu dentystycznego wokół śruby i rurki wsporczej. Stosowane przez nas formy są wykonane z plastiku wydrukowanego w technologii 3D, podobnie jak plastikowa podstawa, i posiadają otwory w dnie, które utrzymują śrubę oraz trzpień wsporczy w odpowiednim wyrównaniu podczas wlewania akrylu do formy. Najpierw należy przygotować formę: udrożnić otwór rurki wsporczej za pomocą igły o rozmiarze 23 G, udrożnić otwór śruby i naciąć gwint za pomocą gwintownika.Jest to ta sama procedura, którą zastosowano przed chwilą w przypadku podstawy plastikowej. Teraz forma jest gotowa do wytwarzania mikroprzedstawników. Należy pokryć formę smarem na bazie teflonu, aby zapobiec przywieraniu akrylu dentystycznego do formy.Zeszlifuj górne dwa do trzech milimetrów stalowego wspornika o średnicy 23 gauge i długości 14 mm za pomocą tarczy szlifującej, aby zapewnić jego stabilne osadzenie w akrylu. Włóż wspornik do mniejszego otworu w formie w taki sposób, aby jego górna część wystawała ponad krawędź otworu. Na śrubę nanieś cienką warstwę smaru na bazie teflonu, a następnie wkręć ją w otwór z gwintem tak, aby gwinty znajdowały się tuż poniżej dna otworu.Teraz wymieszaj akryl stomatologiczny i wlej go do formy. Upewnij się, że wypełni on wszystkie zagłębienia i szczeliny. Igła może pomóc w usunięciu pęcherzyków powietrza po utwardzeniu akrylu.Mikronapęd można usunąć, wykręcając śrubę. Należy przeprowadzić rygorystyczną kontrolę jakości. W akrylu nie powinno być żadnych pęknięć ani pęcherzyków powietrza.Słupek i śruby powinny być równoległe i nieruchome w kierunku bocznym. Śruby powinny obracać się płynnie, ale bez luzu; wszelkie wadliwe mikronapędy należy odrzucić z części użytych ponownie. Powtarzaj ten proces, aż uzyskasz 21 sprawnych mikronapędów.Jeśli forma posiada wiele otworów, można przygotować mikroprzenośniki seryjnie, aby zaoszczędzić czas. Należy ostrożnie dopasować każdy mikroprzenośnik do pary otworów w plastikowej podstawie. Nasuń rurkę wspierającą mikroprzenośnik na prowadnicę z polimeru i wsuń ją w metalową tuleję, jednocześnie używając śrubokręta do wkręcania śruby mikroprzenośnika.Ten etap może być problematyczny. Należy obserwować środek podstawy, aby upewnić się, że rurka prowadząca nie zablokuje się na klamrze podczas opuszczania mikronapędu. Po umieszczeniu i całkowitym opuszczeniu wszystkich mikronapędów, do środka napędu wlewa się niewielką ilość akrylu, aby unieruchomić zespół rurek prowadzących.Pozostaw akryl do utwardzenia na 15 minut. Po wyschnięciu akrylu, aby cofnąć każdy mikronapęd o około trzy milimetry, stwórz schemat mikronapędów w rzucie z góry i nadaj każdemu mikronapędowi unikalną nazwę lub numer. Patrząc teraz przez stereomikroskop, odwróć napęd do góry dnem i zrób zdjęcie spodu kaniuli zbierającej oraz prowadnic.Wykonaj wydruk zdjęcia, który będzie służył jako punkt odniesienia w kolejnych krokach. Następnie, trzymając napęd do góry nogami, włóż wąską poliamidową rurkę nośną do każdej rurki prowadzącej, aż wysunie się ona górą mikro-napędu. Zaznacz na zdjęciu, która rurka prowadząca odpowiada któremu mikro-napędowi.Tulejka prowadząca będzie później chronić i wspierać delikatne przewody elektrod. Przechodzi ona przez mikronapęd. Wysuń każdą tulejkę prowadzącą tak, aby wystawała o jeden centymetr ponad górną krawędź rurki wsporczej mikronapędu, a następnie przyklej tulejkę prowadzącą do rurki wsporczej za pomocą pięciominutowego kleju epoksydowego lub gęstego kleju do lakierów sano acro.Należy zachować szczególną ostrożność podczas tego etapu. Jeśli klej ścieknie po wewnętrznej ściance rurki wsporczej, może on trwale połączyć rurkę wsporczą z nieruchomą rurką prowadzącą, co doprowadzi do uszkodzenia tego mikronapędu. Właśnie z tego powodu podnosimy mikronapędy przed włożeniem rurek nośnych.Po przyklejeniu wszystkich probówek nośnych ponownie całkowicie opuść mikronapędy i odetnij wszystkie probówki nośnie równo z dołem napędu, używając nowej żyletki. Następnie, za pomocą ostrych nożyczek, odetnij probówki nośne jeden do dwóch milimetrów powyżej górnej krawędzi mikronapędu. Na koniec umieść płytkę interfejsu elektrod na podstawie napędu i zamocuj ją za pomocą dwóch śrub.Na tym etapie macierz napędów jest gotowa do załadowania elektrod oraz rozpoczęcia eksperymentów. Zazwyczaj stosujemy czterokanałowe elektrody z mikrodrutów, nazywane tetrodami, jednak można użyć dowolnego rodzaju elektrod. Produkcja tetrod, sposób ich ładowania do mikronapędów oraz przygotowanie macierzy napędów do implantacji chirurgicznej zostały omówione w innych filmach JoVE.Niniejszy protokół można stosować bezpośrednio lub zmodyfikować go zgodnie z własnymi potrzebami. Na przykład niektórzy badacze będą wymagać dłuższych śrub, aby rejestrować sygnały z głębszych struktur mózgu. Inni mogą chcieć zaprojektować napęd celujący w więcej niż jedną lokalizację w mózgu.Konstrukcję tę można również zminiaturyzować do użytku u mniejszych zwierząt, takich jak myszy, wprowadzając niewielkie modyfikacje; można zastosować zmotoryzowane mikropopychacze, które umożliwiają zdalną regulację pozycji elektrod. Przedstawiliśmy właśnie sposób projektowania i wykonania macierzy mikropopychaczy, którą można zaimplantować na głowie szczura, co pozwala na rejestrację aktywności dużych populacji neuronów podczas rzeczywistego poruszania się zwierzęcia. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym nawierceniu otworów w plastikowej podstawie, aby śruby mikropopychaczy nie ześlizgiwały się.Przeprowadź rygorystyczną kontrolę jakości wykonanych mikronapędów. Upewnij się, że śruba i rurka wsporcza są równoległe oraz że śruba obraca się płynnie, bez luzów. Zachowaj ostrożność podczas nakładania kleju lub akrylu stomatologicznego, aby przypadkowo nie zapchać żadnej z rurek.Na koniec należy pamiętać, że aby ukończyć układ MyDrive i przed przystąpieniem do operacji, konieczne jest wykonanie tetros oraz wprowadzenie niskiej dawki do drive'u. Jest to opisane w innym artykule wideo JoVE. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

micro-drive-array-for-chronic-in-vivo-recording-drive-fabrication

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikro-dysk Array do Przewlekłych Nagrań in vivo: Produkcja Dysków

W niniejszym protokole demonstrujemy sposób wykonania i kondycjonowania tetrod do zastosowania w macierzy mikro-napędów, która została zaprojektowana do chronicznych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów. Dodatkowo przedstawiamy końcowe etapy konstrukcji macierzy mikro-napędów, obejmujące instalację przewodów uziemiających oraz stożka ochronnego.

Macierz mikronapędów do chronicznych pomiarów in vivo: montaż tetrod

Opisano projektowanie, wykonanie i montaż ultralekkiego zmotoryzowanego mikronapędu. Urządzenie stanowi kosztowo efektywne i łatwe w użyciu rozwiązanie do chronicznych rejestracji pojedynczych jednostek u małych zwierząt w warunkach behawioralnych.

Projekt i montaż ultralekkiego zmotoryzowanego mikronapędu do chronicznych rejestracji neuronalnych u małych zwierząt

Wideo demonstruje jednoczesny zapis elektrofizjologiczny z wielu obszarów mózgu u szczura przy użyciu zintegrowanego układu mikronapędów. Elektrody rejestrujące są umieszczone w opuszce węchowej, elektrody referencyjne w korze czołowej, a elektrody układu mikronapędów w hipokampie. Szczur może swobodnie żerować, a jednoczesny zapis ze wszystkich wszczepionych elektrod jest rejestrowany za pomocą matrycy.

Metoda Micro-drive Array do zapisu elektrofizjologicznego z wielu obszarów mózgu

Opisano projektowanie i montaż mikronapędów do elektrofizjologicznych zapisów in vivo sygnałów mózgowych od myszy. Dzięki przymocowaniu wiązek mikroelektrod do wytrzymałych nośników napędzanych, techniki te pozwalają na długotrwałe i stabilne zapisy neuronowe. Lekka konstrukcja pozwala na nieograniczoną wydajność behawioralną zwierzęcia po wszczepieniu napędu.

Budowa macierzy mikronapędów do przewlekłych nagrań neuronowych u myszy zachowujących się w stanie czuwania

Zrozumienie neuronalnych substratów zachowania wymaga nagrania zespołu obwodów mózgowych. Ze względu na swoją podatność genetyczną, mysz oferuje model do rozwarstwiania obwodów i mimikry choroby. W tym miejscu opisano metodę projektowania i wytwarzania zminiaturyzowanych sond, która jest odpowiednia do celowania w głęboką strukturę mózgu u myszy.

Projektowanie i produkcja ultralekkich, regulowanych sond wieloelektrodowych do zapisów elektrofizjologicznych u myszy

Opisana poniżej jest metoda implantacji wielu układów elektrod polimerowych w anatomicznie odległych obszarach mózgu w celu przewlekłego zapisu elektrofizjologicznego u swobodnie poruszających się szczurów. Przygotowanie i implantacja chirurgiczna są szczegółowo opisane, z naciskiem na zasady projektowania, które mają pomóc w adaptacji tych metod do stosowania u innych gatunków.

Przewlekła implantacja wielu elastycznych matryc elektrod polimerowych

Ten protokół opisuje budowę hybrydowego układu mikronapędów, który umożliwia wszczepienie dziewięciu niezależnie regulowanych tetrod i jednej regulowanej sondy opto-krzemowej w dwóch obszarach mózgu u swobodnie poruszających się myszy. Zademonstrowano również metodę bezpiecznego odzyskiwania i ponownego wykorzystania sondy optokrzemowej do wielu celów.

Hybrydowy system mikronapędowy z odzyskiwalną sondą optokrzemową i tetrodą do nagrywania w dwóch lokalizacjach o wysokiej gęstości w swobodnie poruszających się myszach

Opisujemy tutaj metodę wytwarzania matryc mikroelektrod Ti3C2 MXene i wykorzystywania ich do rejestracji neuronowej in vivo.

Produkcja matryc mikroelektrod Ti3C2 MXene do rejestracji neuronowej in vivo

Ten protokół opisuje procedurę konstruowania układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych zapisów elektrofizjologicznych in vivo u myszy (Mus musculus) i fretki (Mustela putorius furo) z wielu obszarów mózgu. Każdy krok, po zakupie surowych włókien węglowych do implantacji matrycy mikroelektrodowej, jest szczegółowo opisany, z naciskiem na budowę matrycy mikroelektrodowej.

Budowa i implementacja układów mikroelektrod z włókna węglowego do przewlekłych i ostrych nagrań in vivo

Tutaj opisujemy projekt mikronapędu, procedurę implantacji chirurgicznej i strategię rekonwalescencji po operacji, które pozwalają na przewlekłe zapisy pola i pojedyncze jednostki z wielu regionów mózgu jednocześnie u młodocianych i dorastających myszy w krytycznym oknie rozwojowym od 20 dnia po urodzeniu (p20) do 60 dnia po urodzeniu (p60) i później.

Lekki implant napędowy do przewlekłych zapisów tetrody u młodych myszy

Tutaj przedstawiamy lekki, opłacalny system implantacji sond dla przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni, zoptymalizowany pod kątem łatwości użycia, odzyskiwania sondy, wszechstronności eksperymentalnej oraz zgodności z zachowaniem.

Implant DREAM: lekki, modułowy i opłacalny system implantów do przewlekłej elektrofizjologii u myszy zamocowanych na głowie i swobodnie zachowujących się

Poznaj montaż lekkiej macierzy mikronapędów z 21 niezależnie regulowanymi śrubami do przewlekłych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów. Ta metoda umożliwia precyzyjne pozycjonowanie elektrod podczas ruchu zwierzęcia.

Układ mikro-napędów do przewlekłych pomiarów in vivo: Konstrukcja napędu

Przeglądaj więcej filmów