Układ mikro-napędów do przewlekłych pomiarów in vivo: Konstrukcja napędu

W niniejszym filmie omówiono montaż lekkiej macierzy mikronapędów składającej się z 21 niezależnie regulowanych mikronapędów śrubowych. Każdy mikronapęd kontroluje pozycję rejestracyjną pojedynczej elektrody. Mikronapędy są zamontowane w zaprojektowanej komputerowo plastikowej podstawie, która stabilizuje je względem czaszki poruszającego się zwierzęcia i gromadzi elektrody w gęsto upakowanym układzie, który może zostać wprowadzony przez niewielki otwór trepanacyjny do mózgu.

Podstawa podtrzymuje również płytkę interfejsu elektrod do połączenia z instrumentami rejestrującymi, co umożliwia wygodne podłączanie i odłączanie zwierzęcia na początku i na końcu eksperymentu. Plastikowy stożek przymocowany do podstawy chroni mikronapędy i elektrody przed czynnikami zewnętrznymi w klatce szczura. Cześć, nazywam się Faia Postman i pracuję w laboratorium Matta Wilsona w Instytucie Uczenia się i Pamięci PIKA na Massachusetts Institute of Technology.

Dzisiaj zaprezentujemy protokół wykonania macierzy mikroelektrod typu dive. W naszym laboratorium używamy tych macierzy do rejestracji aktywności z dużej populacji neuronów w mózgu szczurów, na przykład z kory mózgowej lub hipokampa. Najpierw pokażemy, w jaki sposób zaprojektowaliśmy naszą macierz mikroelektrod.

Następnie udamy się do warsztatu, gdzie Steve i Stewart pokażą nam, jak przetwarzać surowce i jak składać je w pełni funkcjonalne urządzenie. Zatem zacznijmy. Plastikowa podstawa została zaprojektowana przy użyciu oprogramowania do projektowania wspomaganego komputerowo i wykonana w niskokosztowym procesie druku 3D.

Modelujemy również wszystkie pozostałe komponenty macierzy mikronapędów. Pozwala nam to na precyzyjną kontrolę rozmiaru i masy gotowego napędu. W górnej części plastikowej podstawy znajdują się dwa pierścienie otworów, w których zostaną umieszczone poszczególne mikronapędy.

Model 3D jest wysyłany do biura usług, które wykonuje projekt z żywicy utwardzanej laserowo przy użyciu stereolitografii. Powinno to zająć tylko kilka dni, a otrzymana część jest lekka i wielokrotnego użytku. Po otrzymaniu części z biura usług należy ją przygotować do użycia.

Przejdźmy zatem do warsztatu. Proces druku 3D nie pozwala na niezawodne drukowanie małych otworów, dlatego w naszych modelach specyfikujemy otwory o mniejszej średnicy. Następnie w warsztacie wiercimy i gwintujemy otwory do wymaganego rozmiaru.

Do przygotowania plastikowej podstawy wykorzystuje się trzy wiertła o różnych rozmiarach: wiertło nr 61, wiertło nr 65 oraz wiertło o średnicy 1,55 mm w zewnętrznym pierścieniu podstawy. Należy użyć wiertarki ręcznej z wiertłem nr 61 przy bardzo niskich obrotach, aby przygotować otwory pilotujące, w które później zostaną wkręcone mikroskopijne śruby mocujące. Następnie należy przygotować otwory na rurki wsporcze mikronapędu w części wejściowej podstawy, rozwiercając je wiertłem nr 65.

Używając większego wiertła o średnicy 1,55 millimeter, wywierć otwory, które posłużą do przymocowania podstawy do płytki interfejsu elektrody oraz stożka ochronnego. Aby zapewnić płynny ruch w mikro-napędzie, włóż tulejkę ze stali nierdzewnej do wewnętrznego pierścienia otworów. Każdą tulejkę należy wcisnąć za pomocą szczypiec, aż będzie zlicowana z górną krawędzią podstawy.

Otwory pilotujące pod śruby należy teraz nagwintować. Należy użyć wkrętaka precyzyjnego (pin vice) do trzymania gwintownika i zastosować smar suchy przed gwintowaniem. Aby wyrównać gwintownik i zapewnić jego właściwe ustawienie, należy upewnić się, że jest on równolegle do rurki o rozmiarze 23 G, którą tymczasowo wstawia się do sąsiedniej tulei.

Otwory utrzymujące płytkę interfejsu oraz stożek ochronny muszą zostać nagwintowane. Nagwintuj te otwory ręcznie w ten sam sposób. Konstrukcja oparta na tworzywie sztucznym posiada prowadnicę gwintownika dla każdego otworu pilotażowego pod śrubę, aby upewnić się, że początkowe gwinty nie zostaną uszkodzone podczas procesu gwintowania.

Po nagwintowaniu wszystkich otworów pilotujących, zaczepy gwintownika można łatwo odłamać za pomocą żyletki. Elektrody są prowadzone do jednego miejsca na spodzie napędu za pomocą szeregu rurek prowadzących elektrody.

Najpierw należy wykonać kaniulę zbiorczą, w której znajdą się wszystkie rurki prowadzące elektrody. Kaniula zbiorcza jest wykonana z odcinka rurki ze stali nierdzewnej o długości 1,5 cm. Kaniula zbiorcza zostanie zamocowana za pomocą cementu stomatologicznego.

Aby zwiększyć adhezję, należy ostrożnie zmatowić rurkę za pomocą tarczy szlifierskiej Dremel, a następnie wsunąć tę kaniulę do dolnej części plastikowej podstawy. Należy ją ustawić tak, aby od pięciu do siedmiu milimetrów kaniuli pozostało poza układem mikronapędu. W celu ułatwienia implantacji chirurgicznej należy przymocować kaniulę zbierającą do dolnej części plastikowej podstawy.

W przypadku akrylu dentystycznego należy odczekać co najmniej 15 minut do jego utwardzenia. Następnie przygotować rurki prowadzące, wycinając żyletką 21 odcinków poliamidu. Krok ten należy rozpocząć od wprowadzenia wszystkich 21 rurek prowadzących do kaniuli zbierającej znajdującej się w dolnej części podstawy napędu.

Zapewni to, że wszystkie probówki będą ustawione równolegle względem siebie. Jeśli probówki w wiązce są zbyt luźno lub zbyt ciasno ułożone, można rozpocząć od mniejszej liczby probówek lub dodać dodatkowe, w zależności od potrzeb. Teraz należy kolejno wyjmować każdą probówkę prowadzącą i wprowadzać ją do jednej z tulei w górnej części napędu.

Przeciągnij probówkę w dół przez szczelinę po lewej stronie, za wiązką probówek. Sprawdź, czy prowadnice nie są załamane lub zbyt mocno zgięte i w razie potrzeby wymień je. Dostosuj położenie każdej prowadnicy tak, aby wystawała od jednego do dwóch milimetrów ponad górną krawędź tulei.

Teraz nanieś małą kroplę rzadkiego kleju sano acro lake na dno kaniuli zbiorczej. Należy zachować szczególną ostrożność, aby klej nie wpłynął do rurek prowadzących. Następnie, używając nowej żyletki, odetnij wiązkę nadmiarowych rurek na dnie kaniuli zbiorczej.

Zweryfikuj pod stereoskopem, czy rurki są równo przycięte i zlicowane z kaniulą. Każda elektroda jest przesuwana za pomocą osobnego mikronapędu, dlatego należy wykonać 21 mikronapędów, a następnie wstawić je do plastikowej podstawy. Każdy mikronapęd składa się z niestandardowej śruby i pustej rurki wsporczej, które są ze sobą połączone.

Za pomocą akrylu stomatologicznego elektroda zostanie przeprowadzona przez rurkę wsporczą. Śruba posiada część pozbawioną gwintu z niewielkim kołnierzem, który zostaje zatopiony w akrylu stomatologicznym, co pozwala śrubie na swobodne obracanie się w ten sposób. Wkręcanie śruby w plastikową podstawę powoduje wysuwanie lub cofanie elektrody.

Łeb śruby ma kształt półcylindra. Zanim będziemy mogli wykonać mikronapędy, musimy przygotować śrubokręt do odkręcania naszych niestandardowych śrub. Nasz improwizowany śrubokręt wykonuje się poprzez wzięcie niestandardowej śruby i całkowite zeszlifowanie kołnierza otaczającego półcylindryczny łeb.

Wsuń łeb śruby do rurki o średnicy 15 G i długości 5 cm, aż zostanie całkowicie w niej zamknięta. Następnie zgnieć rurkę wokół gwintów śruby, aby unieruchomić ją wewnątrz i zapobiec obrotom. Przymocuj miniimadło ręczne, aby służyło jako uchwyt i w ten sposób powstanie śrubokręt.

Mikronapęd wykonuje się poprzez odlewanie akrylu dentystycznego wokół śruby i rurki wsporczej. Stosowane przez nas formy są wykonane z plastiku wydrukowanego w technologii 3D, podobnie jak plastikowa podstawa, i posiadają otwory w dnie, które utrzymują śrubę oraz trzpień wsporczy w odpowiednim wyrównaniu podczas wlewania akrylu do formy. Najpierw należy przygotować formę: udrożnić otwór rurki wsporczej za pomocą igły o rozmiarze 23 G, udrożnić otwór śruby i naciąć gwint za pomocą gwintownika.

Jest to ta sama procedura, którą zastosowano przed chwilą w przypadku podstawy plastikowej. Teraz forma jest gotowa do wytwarzania mikroprzedstawników. Należy pokryć formę smarem na bazie teflonu, aby zapobiec przywieraniu akrylu dentystycznego do formy.

Zeszlifuj górne dwa do trzech milimetrów stalowego wspornika o średnicy 23 gauge i długości 14 mm za pomocą tarczy szlifującej, aby zapewnić jego stabilne osadzenie w akrylu. Włóż wspornik do mniejszego otworu w formie w taki sposób, aby jego górna część wystawała ponad krawędź otworu. Na śrubę nanieś cienką warstwę smaru na bazie teflonu, a następnie wkręć ją w otwór z gwintem tak, aby gwinty znajdowały się tuż poniżej dna otworu.

Teraz wymieszaj akryl stomatologiczny i wlej go do formy. Upewnij się, że wypełni on wszystkie zagłębienia i szczeliny. Igła może pomóc w usunięciu pęcherzyków powietrza po utwardzeniu akrylu.

Mikronapęd można usunąć, wykręcając śrubę. Należy przeprowadzić rygorystyczną kontrolę jakości. W akrylu nie powinno być żadnych pęknięć ani pęcherzyków powietrza.

Słupek i śruby powinny być równoległe i nieruchome w kierunku bocznym. Śruby powinny obracać się płynnie, ale bez luzu; wszelkie wadliwe mikronapędy należy odrzucić z części użytych ponownie. Powtarzaj ten proces, aż uzyskasz 21 sprawnych mikronapędów.

Jeśli forma posiada wiele otworów, można przygotować mikroprzenośniki seryjnie, aby zaoszczędzić czas. Należy ostrożnie dopasować każdy mikroprzenośnik do pary otworów w plastikowej podstawie. Nasuń rurkę wspierającą mikroprzenośnik na prowadnicę z polimeru i wsuń ją w metalową tuleję, jednocześnie używając śrubokręta do wkręcania śruby mikroprzenośnika.

Ten etap może być problematyczny. Należy obserwować środek podstawy, aby upewnić się, że rurka prowadząca nie zablokuje się na klamrze podczas opuszczania mikronapędu. Po umieszczeniu i całkowitym opuszczeniu wszystkich mikronapędów, do środka napędu wlewa się niewielką ilość akrylu, aby unieruchomić zespół rurek prowadzących.

Pozostaw akryl do utwardzenia na 15 minut. Po wyschnięciu akrylu, aby cofnąć każdy mikronapęd o około trzy milimetry, stwórz schemat mikronapędów w rzucie z góry i nadaj każdemu mikronapędowi unikalną nazwę lub numer. Patrząc teraz przez stereomikroskop, odwróć napęd do góry dnem i zrób zdjęcie spodu kaniuli zbierającej oraz prowadnic.

Wykonaj wydruk zdjęcia, który będzie służył jako punkt odniesienia w kolejnych krokach. Następnie, trzymając napęd do góry nogami, włóż wąską poliamidową rurkę nośną do każdej rurki prowadzącej, aż wysunie się ona górą mikro-napędu. Zaznacz na zdjęciu, która rurka prowadząca odpowiada któremu mikro-napędowi.

Tulejka prowadząca będzie później chronić i wspierać delikatne przewody elektrod. Przechodzi ona przez mikronapęd. Wysuń każdą tulejkę prowadzącą tak, aby wystawała o jeden centymetr ponad górną krawędź rurki wsporczej mikronapędu, a następnie przyklej tulejkę prowadzącą do rurki wsporczej za pomocą pięciominutowego kleju epoksydowego lub gęstego kleju do lakierów sano acro.

Należy zachować szczególną ostrożność podczas tego etapu. Jeśli klej ścieknie po wewnętrznej ściance rurki wsporczej, może on trwale połączyć rurkę wsporczą z nieruchomą rurką prowadzącą, co doprowadzi do uszkodzenia tego mikronapędu. Właśnie z tego powodu podnosimy mikronapędy przed włożeniem rurek nośnych.

Po przyklejeniu wszystkich probówek nośnych ponownie całkowicie opuść mikronapędy i odetnij wszystkie probówki nośnie równo z dołem napędu, używając nowej żyletki. Następnie, za pomocą ostrych nożyczek, odetnij probówki nośne jeden do dwóch milimetrów powyżej górnej krawędzi mikronapędu. Na koniec umieść płytkę interfejsu elektrod na podstawie napędu i zamocuj ją za pomocą dwóch śrub.

Na tym etapie macierz napędów jest gotowa do załadowania elektrod oraz rozpoczęcia eksperymentów. Zazwyczaj stosujemy czterokanałowe elektrody z mikrodrutów, nazywane tetrodami, jednak można użyć dowolnego rodzaju elektrod. Produkcja tetrod, sposób ich ładowania do mikronapędów oraz przygotowanie macierzy napędów do implantacji chirurgicznej zostały omówione w innych filmach JoVE.

Niniejszy protokół można stosować bezpośrednio lub zmodyfikować go zgodnie z własnymi potrzebami. Na przykład niektórzy badacze będą wymagać dłuższych śrub, aby rejestrować sygnały z głębszych struktur mózgu. Inni mogą chcieć zaprojektować napęd celujący w więcej niż jedną lokalizację w mózgu.

Konstrukcję tę można również zminiaturyzować do użytku u mniejszych zwierząt, takich jak myszy, wprowadzając niewielkie modyfikacje; można zastosować zmotoryzowane mikropopychacze, które umożliwiają zdalną regulację pozycji elektrod. Przedstawiliśmy właśnie sposób projektowania i wykonania macierzy mikropopychaczy, którą można zaimplantować na głowie szczura, co pozwala na rejestrację aktywności dużych populacji neuronów podczas rzeczywistego poruszania się zwierzęcia. Wykonując tę procedurę, należy pamiętać o dokładnym nawierceniu otworów w plastikowej podstawie, aby śruby mikropopychaczy nie ześlizgiwały się.

Przeprowadź rygorystyczną kontrolę jakości wykonanych mikronapędów. Upewnij się, że śruba i rurka wsporcza są równoległe oraz że śruba obraca się płynnie, bez luzów. Zachowaj ostrożność podczas nakładania kleju lub akrylu stomatologicznego, aby przypadkowo nie zapchać żadnej z rurek.

Na koniec należy pamiętać, że aby ukończyć układ MyDrive i przed przystąpieniem do operacji, konieczne jest wykonanie tetros oraz wprowadzenie niskiej dawki do drive'u. Jest to opisane w innym artykule wideo JoVE. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.