Name: Macierz mikronapędów do przewlekłego nagrywania in vivo: montaż tetrody (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-04-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 19 s
Description: Poznaj technikę wytwarzania tetrod i montażu macierzy mikronapędów do przewlekłych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów. Ta metoda umożliwia precyzyjne nagrywanie aktywności neuronalnej in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Junowi Yamamoto za zaprojektowanie i skonstruowanie automatycznego, zmotoryzowanego urządzenia do skręcania tetrod, przedstawionego w materiale wideo. Ponadto dziękujemy wszystkim byłym i obecnym członkom laboratorium Wilsona za ich wkład w rozwój technologii mikro-napędów i tetrod w tym laboratorium.

1. Wykonanie tetrod
<ol>
<li>Rozpocznij konstrukcję jednej tetrody, pobierając drut niklowo-chromowy o średnicy rdzenia 12,5 mikrona, izolowany polimidem, o długości 50 cm. Zegnij drut na pół. Przesuń palcami wzdłuż pary drutów, aby przylegały do siebie. Upewnij się, że para drutów ma dobry kontakt na całej swojej długości.</li>
<li>Zegnij parę ponownie, trzymając oba końce razem. Upewnij się, że pętla utworzona na jednym końcu nie jest skręcona. Odetnij cztery druty na końcu bez pętli w taki sposób, aby cztery końcówki były wyrównane.</li>
<li>W następnym kroku będą potrzebne zmodyfikowany chwytak typu „krokodylek”, zmotoryzowane urządzenie obrotowe oraz pozioma belka nad urządzeniem obrotowym. Chwytak typu „krokodylek” zostaje zmodyfikowany poprzez przyklejenie plastikowego pręta do jego podstawy. W miejscu, gdzie końcówki drutów są odsłonięte, zaciśnij cztery druty razem za pomocą zmodyfikowanego chwytaka. Zawieś pętlę drutów na poziomej belce. Umieść chwytak w zmotoryzowanym stole.</li>
<li>Wykonaj 80 skrętów zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie 40 skrętów przeciwnie do ruchu wskazówek zegara w wiązce drutów w czasie około trzech minut. Parametry te można zmieniać w zależności od potrzeb.</li>
<li>Po zakończeniu skręcania tetrody stop druty ze sobą, ogrzewając je z trzech różnych kątów za pomocą opalarki (420° C lub 790° F), stosując średnio-niski przepływ powietrza. Dla każdego kąta zacznij 1-2 cm poniżej miejsca, w którym wiązka drutów się rozdziela, prowadząc opalarkę w dół i w górę w odległości 2 cm od drutów przez około 5 sekund. Zachowaj ostrożność, ponieważ wysokie temperatury całkowicie stopią izolację i doprowadzą do zwarć.</li>
<li>Teraz, gdy druty zostały ze sobą stopione, wyjmij tetrodę z urządzenia do skręcania, delikatnie podnosząc chwytak, aby zmniejszyć napięcie tetrody, i przetnij tetrodę w pobliżu chwytaka. Na drugim końcu przetnij pętlę tak, aby pozostały cztery niespojone pasma drutu o tej samej długości.</li>
<li>Następnie rozdziel poszczególne pasma na górze, delikatnie wyginając druty pęsetą z miękkimi końcówkami.</li>
<li>Tetroda jest teraz gotowa do umieszczenia w matrycy mikro-napędów. Wykonaj od 21 do 25 kolejnych tetrod i przechowuj je w pojemniku wolnym od kurzu do czasu rozpoczęcia procesu ładowania tetrod.</li>
</ol>
2. Umieszczanie tetrod i przewodów uziemiających w matrycy mikrowyciskacza
<ol>
<li>Aby kontynuować, niezbędny jest kompletny zestaw mikro-napędów. Jeśli jeszcze go nie zbudowano, należy zapoznać się z filmem „Micro-drive array for chronic in-vivo recording: drive fabrication”. W naszym planie konstrukcyjnym tetroda zostanie przymocowana jednym końcem do sprzętu łączącego i zostanie przeprowadzona przez polimidową rurkę nośną w mikro-napędzie w taki sposób, aby końcówki elektrod wystawały poniżej podstawy zestawu mikro-napędów.</li>
<li>Przed rozpoczęciem należy przygotować uchwyt napędu, który jednym końcem można przymocować do płytki łączącej, a drugim zacisnąć w imadle Panavise. W tym przykładzie uchwyt napędu stanowi złącze Mill-Max przyklejone do jednego końca rękojeści noża X-ACTO (Rysunek 1c).</li>
<li>Trzymając tetrodę pęsetą z miękkimi końcówkami i korzystając ze stereoskopu, należy wsunąć końcówkę tetrody do polimidowej rurki nośnej w jednym z mikro-napędów. Wsuwaj tetrodę do rurki, aż poszczególne przewody elektrod znajdą się blisko płytki łączącej na górze zestawu napędów. Należy uważać, aby nie zagiąć ani nie skręcić przewodów, ponieważ spowoduje to wejście tetrody do mózgu pod kątem, a nie prostopadle, oraz osłabi integralność tetrody.</li>
<li>Przy pomocy pęsety z miękkimi końcówkami delikatnie wprowadź drugi koniec czterech przewodów do odpowiadających im otworów w płytce interfejsu elektrod. Ponownie należy unikać zagięć lub skręcania przewodów. Po umieszczeniu wszystkich czterech przewodów, wciśnij złote piny w otwory za pomocą szczypiec z obciętą dolną szczęką. Wciśnięcie pinów w otwory spowoduje zdjęcie izolacji z przewodów i utworzenie połączenia elektrycznego.</li>
<li>W celu późniejszego odniesienia należy prowadzić ewidencję mapowania mikro-napędów i pozycji pinów na płytce interfejsu elektrod.</li>
<li>Kontynuuj ładowanie łącznie 18 tetrod. Trzy pozostałe mikro-napędy w zestawie posłużą do umieszczenia elektrod referencyjnych. Każda elektroda referencyjna jest wykonana z tetrody, w której wykorzystuje się tylko jeden z czterech niepołączonych końców przewodów. Aby przymocować elektrody referencyjne, postępuj zgodnie z procedurą ładowania, ale przymocuj tylko jedną z czterech elektrod do odpowiedniego pinu elektrody referencyjnej na płytce łączącej.</li>
<li>W przypadku planowania rejestracji z wielu miejsc warto wcześniej zaplanować połączenia tetrod z płytką łączącą. Pozwoli to zminimalizować ryzyko regulacji niewłaściwej tetrody podczas eksperymentów.</li>
<li>Po zakończeniu ładowania tetrod należy przygotować dwa przewody uziemiające: jeden dla zwierzęcia i jeden dla stożka ochronnego. Odetnij kawałek izolowanego stalowego drutu o długości 6' (średnica: 0.005') i za pomocą metalowej pęsety usuń 3 mm izolacji z każdego końcówki drutu. Następnie odetnij izolowany stalowy drut o długości 4' (średnica: 0.005'). Usuń 3 mm izolacji z jednego końca i 1 cm z drugiego końca.</li>
<li>Przeciągnij 6-stopowy przewód uziemiający przez otwór z boku zestawu mikro-napędów w górę, w stronę płytki interfejsu. Połącz odsłonięty drut z płytką interfejsu elektrod za pomocą złotego pinu w wyznaczonym otworze uziemiającym. Ten przewód zostanie połączony z czaszką zwierzęcia.</li>
<li>Przeciągnij 4-stopowy przewód uziemiający równolegle do wcześniej zainstalowanego przewodu uziemiającego. Połącz koniec z odizolowanym fragmentem 3 mm z płytką interfejsu elektrod, używając złotego pinu w innym wyznaczonym otworze uziemiającym. Przewód ten zostanie później podłączony do stożka ochronnego, który będzie pełnił funkcję niewielkiej klatki Faradaya w celu redukcji zakłóceń. Połączenia przewodów zostały zakończone i można przejść do doprecyzowania tetrod.</li>
</ol>
3. Ustawianie długości tetrod
<ol>
<li>Celem tego procesu jest przycięcie wszystkich tetrod tak, aby były nieco dłuższe niż głębokość docelowej struktury mózgu. W naszym przykładzie mikronapędy są zaprojektowane dla maksymalnego zakresu ruchu 5-6 mm, co jest wystarczające do dotarcia do wielu obszarów neocortex oraz grzbietowego hipokampa dorosłego szczura. Najpierw opuść wszystkie mikronapędy, aby tetrody były maksymalnie odsłonięte. Następnie, używając pary ostrych, precyzyjnych nożyczek, przytnij jednocześnie wszystkie tetrody do długości o około 5 mm większej niż pożądana długość końcowa.</li>
<li>Do końcowego cięcia przygotuj parę ząbkowanych nożyczek zamocowanych w imadle Panavise. Zaciśnij jeden uchwyt pod lekkim kątem w dół, tak aby ząbki były skierowane do góry, pozostawiając drugi uchwyt swobodnie zwisający.</li>
<li>Teraz całkowicie wycofaj wszystkie tetrody do kaniul prowadzących, przekręcając mikronapędy w górę.</li>
<li>Używając stereomikroskopu, całkowicie wysuń jedną tetrodę z kaniuli. Za pomocą linijki ustaw ząbkowane nożyczki w pożądanej odległości od kaniuli prowadzącej. Powolnym i delikatnym, płynnym ruchem przetnij tetrodę. Po przecięciu danej tetrody wycofaj mikronapęd w górę o 3-4 mm. Powtórz ten proces dla każdej tetrody, aż wszystkie zostaną przycięte. W tym momencie można przystąpić do pozłacania.</li>
</ol>
4. Pozłacanie tetrod i kontrola jakości
Pozłacanie drutów nichromowych tetrody jest kluczowe dla uzyskania stabilnych zapisów w długim terminie. Zapobiega ono korozji i poprawia biozgodność.
<ol>
<li>Ustaw miernik impedancji w trybie zewnętrznym (external mode), a generator prądu w trybie sprawdzania DC (DC check mode) z wyjściem audio (Rysunek 1d). Dotknij końcówkami przewodów generatora prądu sześciu możliwych par kanałów w obrębie każdej tetrody i wykorzystaj sygnał audio do sprawdzenia, czy występują zwarcia między parami. Jeśli występuje zwarcie, ponownie utnij końcówkę tetrody nożyczkami ząbkowanymi i powtórz test. Jeśli problem nadal występuje, odrzuć tetrodę i zastąp ją nową.</li>
<li>Gdy w żadnej z tetrod nie wystąpią zwarcia, przesuń wszystkie mikronapędy w dół, wysuwając wszystkie tetrody tak daleko, jak to możliwe.</li>
<li>Zmodyfikuj konfigurację sprzętu w celu sprawdzenia impedancji elektrod (Rysunek 1e). Następnie zanurz końcówki wszystkich tetrod w kąpieli ze standardowym roztworem do pozłacania. Kąpiel złota jest połączona elektrycznie z dodatnim przewodem miernika impedancji. Sprawdź impedancję elektrody, dotykając ujemnym przewodem miernika impedancji odpowiedniego pinu na płytce złącza.</li>
<li>Zmień i zapisz impedancję każdego przewodu w macierzy mikronapędów. Normalne wartości mieszczą się w zakresie 1-3 MOhm.</li>
<li>W generatorze prądu ustaw natężenie prądu w zakresie 1-3 μA. Następnie bezpiecznie przymocuj ujemny przewód miernika impedancji do pinu na płytce złącza. Przestaw sprzęt w konfigurację do galwanizacji (Rysunek 1f). W mierniku impedancji szybko przełącz tryb z normalnego (normal mode) na tryb pominięcia (bypass mode) i z powrotem. W trybie bypass prąd przepłynie przez tetrodę i roztwór złota, a na końcówce elektrody zostanie osadzone złoto. Impedancja po każdym cyklu pozłacania powinna być niższa niż wcześniej. Powtórz impuls prądowy, jeśli impedancja nie spadła poniżej 1 MOhm. Konserwatywny zakres dopuszczalnych impedancji wynosi od 250 kOhm do 350 kOhm. Jeśli impedancja spadnie poniżej 200 kOhm, może to wskazywać na zwarcie.</li>
<li>Jeśli po wielokrotnych impulsach impedancja nie spadnie wystarczająco, końcówka elektrody może być zablokowana. Ponownie utnij końcówkę tetrody, sprawdź czy nie ma zwarć i powtórz proces pozłacania. Jeśli ponowne cięcie nie pomoże, wymień tetrodę i zacznij od początku.</li>
<li>Po pozłaceniu wszystkich tetrod krótko zanurz ich końcówki w etanolu i pozostaw do wyschnięcia na 3 do 5 minut.</li>
<li>Sprawdź obecność zwarć w tetrodach za pomocą generatora prądu, gdy końcówki tetrod są wystawione na działanie powietrza. Jeśli między dwiema lub więcej elektrodami tetrody istnieje połączenie DC, ponownie utnij końcówkę tetrody i ponownie ją pozłoć.</li>
<li>Po zakończeniu pozłacania wszystkich tetrod nanieś kroplę średniolepkiego kleju cyjanoakrylowego na styk między każdą tetrodą a jej rurką polimidową. Zabezpieczy to tetrodę w mikronapędzie i utrzyma jej długość.</li>
<li>W ostatnim kroku wprowadź wszystkie tetrody do napędów, dokręcając wszystkie śruby do góry.</li>
</ol>5. Mocowanie stożka ochronnego
Celem ochronnego stożka jest zabezpieczenie mikroelektrod oraz odsłoniętego drutu tetrody przed wpływem środowiska. Zapewnia on również podparcie podczas manipulacji w trakcie eksperymentu i redukuje szumy elektryczne. Stosujemy plastikowy stożek wydrukowany w technologii 3D (Patrz część I: wykonanie elektrod). Możliwe jest jednak wykonanie stożka z innych materiałów, na przykład z wygiętego kawałka puszki po napoju.
<ol>
<li>Weź plastikowy stożek i przymocuj taśmę z folii aluminiowej do jego wewnętrznej lub zewnętrznej powierzchni.</li>
<li>Następnie wywierć mały otwór (o średnicy 1,5 mm) w stożku i luźno zamocuj śrubę z podkładką i nakrętką wewnątrz stożka. Będzie ona służyć jako przejście elektryczne dla przewodu uziemiającego. Zalecamy użycie zestawu śruby i podkładki w rozmiarze 0-80.</li>
<li>Najpierw wkręć i częściowo zakręć trzy śruby o rozmiarze 1-72 (o długości 3/16 cala) w boki stożka. Przy zawieszonej macierzy elektrod wsuń stożek na napęd. Upewnij się, że oba przewody uziemiające wystają z dołu macierzy elektrod. Owiń odsłoniętą część 4-stopowego przewodu uziemiającego kilka razy wokół jednej ze śrub 1-72 i mocno dokręć śrubę. Przymocuj stożek do podstawy napędu, dokręcając pozostałe dwie śruby stożka.</li>
<li>Na koniec weź odizolowany koniec (1 cm) krótkiego przewodu uziemiającego i owiń go wokół śruby, pomiędzy taśmą z folii a podkładką. Zabezpiecz uziemienie, dokręcając śrubę. W ten sposób otrzymaliśmy macierz mikroelektrod, która jest już gotowa do implantacji chirurgicznej.</li>
</ol>6. Reprezentatywne wyniki
<ol>
 <li>Produkcja macierzy mikronapędów została zakończona. Twoja macierz mikronapędów jest wyposażona w 18 tetrod i 3 kanały referencyjne. Dla zapewnienia trwałości została ona zamknięta w ochronnym stożku i nasadce. Gotowa macierz mikronapędów wraz z ochronnym stożkiem waży średnio od 20g do 25g.</li>
 <li>Gotową macierz napędów implantuje się zgodnie ze standardową procedurą chirurgiczną. Jak widać, napęd jest połączony z układem przedwzmacniacza i wiązką przewodów, które przesyłają sygnał do sprzętu i oprogramowania do akwizycji danych.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1098/CompositeFigure1_highqualityn.jpg" alt="Proces przygotowania układu do galwanizacji; schematy A-F przedstawiające połączenia elektrod, przepływ roztworu, analizę." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure 1"> Rysunek 1: A) Schemat konfiguracji skręcania tetrody. Pozioma belka zawiesza niespojone przewody elektrod tetrody nad automatycznym urządzeniem do skręcania tetrod. B) Układ do pomiaru impedancji tetrody i powlekania elektrod. Podczas sprawdzania zwarć obwód jest inny: czarny przewód jest przyłączony do innego kanału elektrod na płytce złączy. C) Zbliżenie na wykonany na zamówienie uchwyt do matrycy mikronapędu. Cylindryczny pręt to rękojeść noża X-Acto. Złącze to 26-pinowy, dwurzędowy konektor Mill-max. Oba elementy są ze sobą spojone akrylem stomatologicznym. D) Konfiguracja do sprawdzania zwarć. Kanał X i Kanał Y to dwa dowolne, różne kanały z czterech kanałów tetrody. E) Konfiguracja do pomiaru impedancji elektrod. Źródło prądu jest wyłączone ('off'). Omomierz jest ustawiony na 'on' i 'test'. F) Konfiguracja do pozłacania końcówek elektrod. Źródło prądu jest ustawione na 'on', audio na 'on', tryb na 'unipolar', DC Test na 'on', a prąd ustawiono na 2 microamps.

<ol><li>Gray, C. M., Maldonado, P. E., Wilson, M., McNaughton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrodes+markedly+improve+the+reliability+and+yield+of+multiple+single-unit+isolation+from+multi-unit+recordings+in+cat+striate+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tetrodes markedly improve the reliability and yield of multiple single-unit isolation from multi-unit recordings in cat striate cortex.</a> J. Neurosci. Methods. 63 (1-2), 43-54 (1995).</li>
</ol>

Niniejszy protokół stanowi drugą część dwuodcinkowego opracowania: „Micro-drive array for chronic in-vivo recording”. Połączenie macierzy mikro-napędów z tetrodami jest potężnym narzędziem do jednoczesnej rejestracji aktywności wielu neuronów w preparacie zwierzęcia budzącego się i wykazującego określoną aktywność behawioralną. Mamy nadzieję, że dostarczone informacje okażą się wystarczające, aby umożliwić Państwu rozpoczęcie lub udoskonalenie rejestracji elektrofizjologicznych we własnym laboratorium.
<p class="jov...

<table><tbody><tr><td>Panavise</td><td>Narzędzie</td><td>Panavise</td><td>Model 301</td><td>Służy do mocowania macierzy mikronapędu lub nożyczek z ząbkowanym ostrzem</td></tr><tr><td>Zmodyfikowane szczypce Xcelite 378M</td><td>Narzędzie</td><td>Newark Inc</td><td>96F8903</td><td>Do wkładania pinów płytki łącznika. Aby je przygotować, należy usunąć 2mm z jednego z końców szczypiec.</td></tr><tr><td>Klej wolnotwardniejący</td><td>Materiał</td><td>Great Planes (Champaign, IL)</td><td>GPMR6015</td><td>Do przyklejenia tetrody do mikronapędu</td></tr><tr><td>Roztwór do pozłacania</td><td>Materiał</td><td>Neuralynx Inc.</td><td>Sifco Selectron Gold NC</td><td>Zawiera cząsteczki złota do galwanizacji</td></tr><tr><td>Generator prądu</td><td>Narzędzie</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>A365D-B</td><td>Znany jako izolator stymulatora. Służy do nakładania złota metodą galwaniczną na końcówki elektrod.</td></tr><tr><td>Miernik impedancji</td><td>Narzędzie</td><td>BAK Electronics</td><td>IMP-1 / 6662 / 2788</td><td>Do sprawdzania impedancji elektrod</td></tr><tr><td>Opalarka</td><td>Narzędzie</td><td>Steinel (Niemcy)</td><td>HG 3002 LCD</td><td>Do stapiania elektrod w celu utworzenia tetrody</td></tr><tr><td>Pinceta Accu-Tek z końcówkami Carbofib</td><td>Narzędzie</td><td>Aven</td><td>18768 (Pattern 304)</td><td>Do manipulowania tetrodami</td></tr><tr><td>Zacisk typu krokodylk</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>18050-35</td><td>Znany jako Bulldog serrefine. Służy do spinania tetrod podczas skręcania</td></tr><tr><td>Mikronóż do mikrodissekcji</td><td>Narzędzie</td><td>Biomedical Research Instruments</td><td>25-1000</td><td>Do ogólnego przycinania drutów tetrody/elektrody</td></tr><tr><td>Nożyczki Iris Toughcut z ząbkowanym ostrzem</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>14058-09</td><td>Do końcowego przycinania tetrod</td></tr><tr><td>Stalowy drut powlekany teflonem</td><td>Materiał</td><td>A-M Systems</td><td>790500</td><td>Przewód uziemiający</td></tr><tr><td>Drut nichromowy 12,5 micron</td><td>Materiał</td><td>Kanthal Palm Coast</td><td>Rediohm-800 1/4 HARD PAC COATING</td><td>Mikrodrut powlekany poliimidem do produkcji tetrod.</td></tr><tr><td>Skrętkownica do tetrod</td><td>Narzędzie</td><td>Neuralynx Inc.</td><td>Tetrode Assembly Station</td><td>Zwiększa szybkość i powtarzalność procesu wytwarzania tetrod.</td></tr><tr><td>Farba srebrna</td><td>Materiał</td><td>GC International</td><td>22-023</td><td>Do łączenia drutów mikroelektrod tetrody z pinami łącznika (patrz sekcja Dyskusja)</td></tr><tr><td>Rękojeść noża X-Acto</td><td>Materiał</td><td>MSC Direct</td><td>X3001</td><td>Do konstrukcji uchwytu mikronapędu.</td></tr><tr><td>Złącze 26-pinowe, 2-rzędowe</td><td>Materiał</td><td>Mill-Max</td><td>852-10-026-30-001000</td><td>Do konstrukcji uchwytu mikronapędu.</td></tr></tbody></table>

macierz mikronapędów do chronicznych pomiarów in vivo: montaż tetrod

Micro-drive Array for Chronic in vivo Recording: Tetrode Assembly

Tetroda, będąca wiązką czterech elektrod, okazała się cennym narzędziem do jednoczesnej rejestracji aktywności wielu neuronów in vivo. Różnica w amplitudzie sygnatur potencjałów czynnościowych w poszczególnych kanałach tetrody pozwala na wyodrębnienie aktywności pojedynczych jednostek z sygnałów wielojednostkowych. Możliwość precyzyjnej kontroli stereotaktycznego położenia i głębokości wprowadzenia tetrody jest kluczowa dla badania skoordynowanej aktywności neuronalnej w różnych obszarach mózgu. Dzięki zastosowaniu macierzy mikronapędów możliwe jest osiągnięcie precyzyjnego rozmieszczenia i stabilnej kontroli wielu tetrod w okresie od kilku dni do kilku tygodni. W niniejszym protokole demonstrujemy, jak wykonać i przygotować tetrody przy użyciu podstawowych narzędzi i materiałów, zainstalować tetrody w macierzy mikronapędów do chronicznej rejestracji in vivo u szczura, wykonać połączenia przewodów uziemiających z macierzą mikronapędów oraz zamocować stożek ochronny na macierzy mikronapędów w celu zabezpieczenia tetrod przed kontaktem fizycznym z otoczeniem.

W niniejszym protokole demonstrujemy sposób wykonania i kondycjonowania tetrod do zastosowania w macierzy mikro-napędów, która została zaprojektowana do chronicznych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów. Dodatkowo przedstawiamy końcowe etapy konstrukcji macierzy mikro-napędów, obejmujące instalację przewodów uziemiających oraz stożka ochronnego.

Macierz mikronapędów do chronicznych pomiarów in vivo: montaż tetrod

Tetroda, czyli wiązka czterech elektrod, okazała się być wartościowym narzędziem do jednoczesnej rejestracji aktywności wielu neuronów in vivo. Różnicowy...

W niniejszym protokole opisujemy wykonanie i implantację wiązek Tetros składających się z czterech elektrod do przewlekłych pomiarów in vivo u budzących się gryzoni, rozpoczynając od procesu wytwarzania tetrod. Pasmo przewodów mikroelektrodowych jest dwukrotnie składane, aby utworzyć wiązkę czterech równoległych przewodów. Następnie przewody te są ze sobą skręcane i utrwalane za pomocą opalarki.Każdy gotowy tero jest umieszczany w pudełku do przechowywania. W miarę wytwarzania kolejnych teros, każdy z nich jest wprowadzany do dedykowanego kanału, wchodząc przez otwór w siłowniku liniowym i wychodząc u podstawy macierzy mikronapędów. Każdy z czterech przewodów tero jest podłączany do oddzielnych pinów na płytce złączowej wyjściowej przymocowanej do górnej części macierzy mikronapędów.Impedancja każdego kanału tero jest obniżana przy użyciu procesu złocenia galwanicznego. Po zainstalowaniu i pozłaceniu wszystkich tero, dwa przewody uziemiające są mocowane do odpowiednich pinów na płytce złącza, a do ramy macierzy mikroelektrod mocowany jest stożek ochronny w celu zabezpieczenia układu po uziemieniu stożka, tworząc w pełni funkcjonalne macierze mikroelektrod Tero gotowe do implantacji. Cześć, jestem Dave Nian z laboratorium Nat Wilson w Instytucie Uczenia się i Pamięci Pickout.Dzisiaj w MIT zaprezentujemy procedurę wytwarzania terosów, ich ładowania oraz końcowych etapów rekonstrukcji mikroprzewodu. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania skoordynowanej aktywności neuronalnej pomiędzy dużymi populacjami a neuronami w preparacie zwierzęcia budzącego się i wykazującego zachowania. Zatem zacznijmy.Aby zbudować tero dla naszego standardowego układu mikro-napędów, rozpoczynamy od 50 centymetrów izolowanego drutu mikro-miedzianego o grubości 12 mikronów. Złóż drut na pół, a następnie przesuń palcami wzdłuż obu pasm, aby je do siebie docisnąć. Upewnij się, że oba druty mają dobry kontakt na całej swojej długości.Ponownie złóż parę, trzymając oba końce razem. Upewnij się, że pętla utworzona na jednym końcu nie jest załamana. Odetnij cztery druty na końcówce bez pętli w taki sposób, aby cztery końcówki były wyrównane.W następnym kroku będą potrzebne zmodyfikowany zacisk typu „krokodylk”, zmotoryzowane urządzenie obrotowe oraz poprzeczny drążek nad urządzeniem obrotowym. Zacisk typu „krokodylk” modyfikuje się poprzez przyklejenie plastikowego pręta do jego podstawy. Gdy końcówki są odsłonięte, należy z clampować cztery przewody za pomocą zmodyfikowanego zacisku typu „krokodylk”.Zawieś pętlę z drutu na poziomym pręcie. Umieść klips krokodylkowy w zmotoryzowanym stole. Wykonaj 80 skrętów zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie 40 skrętów przeciwnie do ruchu wskazówek zegara w wiązce drutów w czasie około trzech minut.Parametry te można zmieniać zgodnie z własnymi potrzebami. Po zakończeniu skręcania tero, zespawaj druty ze sobą, podgrzewając je opalarką z trzech różnych kątów, stosując średni lub niski przepływ powietrza dla każdego z kątów; zacznij jeden do dwóch centymetrów poniżej miejsca, w którym wiązka drutów się rozdziela. Następnie prowadź opalarkę w dół i w górę w odległości dwóch centymetrów od drutów przez około pięć sekund.Należy zachować ostrożność, ponieważ wysokie temperatury spowodują całkowite stopienie izolacji i doprowadzą do zwarć. Po stopieniu się drutów, usuń tero z urządzenia do skręcania, delikatnie podnosząc zacisk krokodylkowy, aby zmniejszyć naprężenie tero, a następnie przetnij tero w pobliżu zacisku. Z drugiej strony przetnij pętlę tak, aby otrzymać cztery nieoznakowane pasma drutu o jednakowej długości. Następnie rozdziel poszczególne pasma u góry, delikatnie odginając druty pęsetą z miękkimi końcówkami.Tero jest teraz gotowy do załadowania do macierzy mikronapędów. Przygotuj od 21 do 25 dodatkowych dróg Tet i przechowuj je w wolnym od kurzu pudełku do momentu rozpoczęcia procesu ładowania tero. Jeśli jeszcze go nie zbudowałeś, będziesz potrzebować kompletnej macierzy mikronapędów.W naszym planie projektowym należy odnieść się do wideo dotyczącego macierzy napędów mikroelektrod do chronicznych pomiarów in vivo w celu wykonania macierzy mikro-napędów. Tero zostanie przymocowany jednym końcem do sprzętu złączy i zostanie przeprowadzony przez rurkę nośną z polimidu w mikro-napędzie w taki sposób, aby końcówki elektrod wystawały poniżej podstawy macierzy mikro-napędów. Przedemonstrujemy teraz ten proces ładowania dla jednego tero.Przed rozpoczęciem należy zbudować uchwyt napędowy, który z jednej strony można przymocować do płytki złączy, a z drugiej zacisnąć w kąpieli lodowej. W tym przykładzie uchwyt napędowy stanowi złącze milax przyklejone do jednego końca rękojeści noża X exacto. Trzymając tero pęsetą z miękkimi końcówkami i korzystając ze stereoskopu, wsuń końcówkę tero do rurki nośnej poly mid jednego z mikro napędów. Wsuwaj Tet road do rurki, aż poszczególne przewody elektrod znajdą się blisko płytki złączy na górze macierzy napędowej; należy przy tym uważać, aby nie zgiąć przewodów, ponieważ spowoduje to wprowadzenie tetro do mózgu pod kątem, a nie prostopadle, co osłabi integralność tero.Teraz ostrożnie wprowadź drugi koniec czterech przewodów do odpowiednich otworów w płytce interfejsu elektrod, używając pęsety z miękkimi końcówkami. Ponownie unikaj załamywania lub zginania przewodów. Po umieszczeniu wszystkich czterech przewodów, dociśnij złote piny do otworów za pomocą szczypiec z przyciętą dolną szczęką.Po wsunięciu pinów do otworu, izolacja przewodu zostanie usunięta, co stworzy połączenie elektryczne do późniejszego wykorzystania. Należy monitorować mapowanie między mikronapędami a pozycją pinów na płytce interfejsu elektrod. Kontynuuj ładowanie, aż do uzyskania łącznie 18 tetrod.Trzy pozostałe mikropopychacze w matrycy zostaną wykorzystane do umieszczenia elektrod odniesienia. Każda elektroda odniesienia składa się z tero, który wykorzystuje tylko jeden z czterech niewiązanych yns. Aby zamocować elektrody odniesienia, należy postępować zgodnie z procedurą ładowania, jednak do odpowiedniego pinu elektrody odniesienia na płytce złączy należy przymocować tylko jedną z czterech elektrod.Jeśli planują Państwo rejestracje z wielu obszarów, warto wcześniej zaplanować połączenia między tetrodami a płytką złącza. Na przykład można zgrupować na płytce interfejsu elektrod tetrody skierowane do jednego regionu anatomicznego. Powinno to zminimalizować ryzyko regulacji niewłaściwej tetrody podczas przeprowadzania eksperymentów.Po zakończeniu ładowania tero, przygotuj dwa przewody uziemiające: jeden dla zwierzęcia i jeden dla stożka ochronnego. Odetnij kawałek izolowanego stalowego drutu o długości six inch i za pomocą metalowej pęsety usuń trzy millimeters izolacji z każdego końca drutu. Następnie odetnij kawałek izolowanego stalowego drutu o długości four inch.Usuń trzy milimetry izolacji z jednego końca i jeden centymetr z drugiego końca. Przeciągnij sześciocalowy przewód uziemiający przez otwór z boku macierzy mikroprzewodów w górę, w stronę płyty interfejsu. Połącz odsłonięty przewód z płytą interfejsu elektrod za pomocą złotego pinu w wyznaczonym otworze uziemiającym.Ten przewód zostanie podłączony do czaszki zwierzęcia. Poprowadź czterocalowy przewód uziemiający równolegle do wcześniej zainstalowanego przewodu uziemiającego. Podłącz odsłonięty koniec o długości 3 mm do płytki interfejsu elektrod, używając złotego pinu w innym wyznaczonym otworze uziemiającym.Ten przewód zostanie później podłączony do ochronnego stożka, który będzie pełnił funkcję małej klatki Faradaya, aby zredukować zakłócenia. Zakończyliśmy już podłączanie przewodów i możemy przejść do dopracowania naszych teros. Naszym celem w tym procesie jest przycięcie wszystkich teros tak, aby były nieco dłuższe niż głębokość docelowej struktury mózgu w naszym przykładzie.Mikrod라이wy zostały zaprojektowane dla maksymalnego zasięgu od pięciu do sześciu milimetrów, co jest wystarczające, aby dotrzeć do wielu obszarów neocortex oraz grzbietowej części hipokampa dorosłego szczura. Najpierw należy opuścić wszystkie mikrodraywy tak, aby tetrody były jednocześnie maksymalnie odsłonięte. Następnie należy przyciąć wszystkie tetrody do długości o około pięć milimetrów większej niż pożądana długość końcowa, używając do ostatniego cięcia pary ostrych, precyzyjnych nożyczek.Przygotować parę ząbkowanych nożyczek w naczyniu z lodem, zacisnąć jeden uchwyt pod lekkim kątem w dół, z ząbkami skierowanymi do góry, pozostawiając drugi uchwyt swobodnie zwisający. Następnie całkowicie wycofać wszystkie elektrody Tet do ich kaniul prowadzących, obracając mikronapędami w górę. Używając stereoskopu, w pełni wysunąć jedną elektrodę z kaniuli.Za pomocą linijki ustaw nożyczki z ząbkami w pożądanej odległości od prowadnicy kaniuli. Powoli i delikatnie przetnij tero jednym płynnym ruchem. Po przecięciu tero wycofaj mikronapęd do góry o trzy do czterech milimetrów.Powtórz ten proces dla każdego tero, aż wszystkie zostaną przecięte. W tym momencie można przystąpić do pozłacania. Pozłacanie.Powłoka z rutenu jest kluczowa dla stabilnych pomiarów w długim terminie. Zapobiega ona korozji i poprawia biokompatybilność. Skonfiguruj miernik impedancji w trybie zewnętrznym w generatorze prądu oraz w trybie kontroli DC z wyjściem audio.Przyłożyć dwa przewody generatora prądu do sześciu możliwych par kanałów w każdym tero i wykorzystać sygnał dźwiękowy do ustalenia, czy między parami występują zwarcia. Zwarcie między parami kanałów brzmi w ten sposób. W przypadku stwierdzenia zwarcia, należy ponownie przeciąć tero nożyczkami ząbkowanymi i powtórzyć test.Jeśli problem nie ustąpi, należy zutylizować drogę Tet i ją wymienić. Przesuń wszystkie mikronapędy w dół, wysuwając wszystkie drogi Tet tak daleko, jak to możliwe. Zmodyfikuj konfigurację aparatury w celu sprawdzenia impedancji elektrod.Teraz zanurz końcówki wszystkich terod w kąpieli standardowego roztworu do pozłacania. Kąpiel złota jest połączona elektrycznie z ujemnym przewodem miernika impedancji. Sprawdź impedancję elektrody, dotykając dodatnim przewodem miernika impedancji odpowiedniego pinu na płytce złączy.Zmierz i zapisz impedancję każdego przewodu w matrycy mikronapędów. Normalne wartości w generatorze prądu mieszczą się w zakresie od 1 do 3 megaomów. Ustaw natężenie prądu w przedziale od 1 do 3 µA.Następnie bezpiecznie podłącz dodatni przewód miernika impedancji do pinu na płytce złącza. Na mierniku impedancji.Szybko przełączaj z trybu normalnego na tryb pomijania (bypass), a następnie z powrotem, pozostając w trybie pomijania. Prąd przepłynie przez ścieżkę Tet i roztwór złota, a na końcówce elektrody zostanie osadzone złoto. Impedancja po każdej serii platerowania powinna być niższa niż przed nią.Powtórz bieżący impuls. Jeśli impedancja nie spadła poniżej 1 MΩ. Konserwatywny zakres dopuszczalnych impedancji wynosi od 250 kΩ do 350 kΩ.Jeśli impedancja spadnie poniżej 200 kilo ohms, może to wskazywać na zwarcie. Jeśli po wielokrotnych impulsach impedancja nie spadnie w wystarczającym stopniu, końcówka elektrody może być zablokowana. Należy ponownie przyciąć tero, sprawdzić pod kątem zwarć i powtórzyć proces pozłacania.Jeśli ponowne cięcie nie pomoże, należy wymienić tero i rozpocząć procedurę od nowa. Po osadzeniu wszystkich teros należy zanurzyć je w etanolu i pozostawić do odparowania przez trzy do pięciu minut. Za pomocą generatora prądu należy sprawdzić, czy w obrębie teros nie występują zwarcia, gdy końcówki teros są wystawione na działanie powietrza.Jeśli między dwiema lub więcej elektrodami tero występuje połączenie DC, należy ponownie wyciąć tero i ponownie pokryć je złotem. Po zakończeniu złocenia wszystkich tero, należy przenieść wszystkie tero do napędu. Jako ostatni krok, na górnej części każdego mikro-napędu, należy nanieść kroplę średniolepkiego kleju cyjanoakrylowego na miejsce styku każdego tero z odpowiadającą mu rurką polimerową.Zapewni to stabilne zamocowanie tero do micro drive. Celem osłony ochronnej jest zabezpieczenie micro drives oraz odsłoniętego przewodu tero przed wpływem środowiska. Zapewnia ona również wsparcie podczas manipulacji w trakcie eksperymentu i redukuje szumy elektryczne.Używamy wydrukowanego w technologii 3D plastikowego stożka. Można jednak wykonać stożek z innych materiałów, na przykład z wygiętego kawałka puszki po napoju. Można również wziąć plastikowy stożek i przymocować taśmę aluminiową do jego wewnętrznej lub zewnętrznej powierzchni.Najpierw wkręć i częściowo obróć 3 śruby rozmiaru 1 72 o długości trzech szesnastych cala w boki stożka, gdy zespół napędowy jest zawieszony. Nałóż stożek na napęd. Upewnij się, że oba przewody uziemiające wystają z dołu zespołu napędowego.Owiń odsłoniętą część czterocalowego przewodu uziemiającego kilka razy wokół jednej ze śrub 1 72 i mocno dokręć śrubę. Mocno przymocuj stożek do podstawy napędu, dokręcając pozostałe dwie śruby stożka. Produkcja mikrotablicy napędowej jest teraz zakończona. Twoja mikrotablica napędowa jest załadowana 18 terosami w trzech referencjach.Dla zapewnienia trwałości jest on zamknięty w ochronnym stożku i nakrętce. Gotowy napęd waży zazwyczaj średnio od 20 do 25 g.Gotowy zestaw elektrod jest implantowany zgodnie ze standardową procedurą chirurgiczną. Jak widać, zestaw jest połączony z układem przedwzmacniacza oraz wiązką przewodów, które przesyłają sygnał do sprzętu i oprogramowania do akwizycji danych. Przedstawiliśmy właśnie sposób wykonania teros oraz pełną procedurę konstrukcji mikroelektrodowego zestawu napędowego.W tym filmie pokazaliśmy, jak wykonać terosy oraz jak je ładować i przygotować do rejestracji in vivo. Dodatkowo zaprezentowaliśmy sposób zamocowania stożka do matrycy mikronapędu, aby zwiększyć jej trwałość w czasie. Konstrukcja matrycy mikronapędu składa się z wielu etapów, dlatego należy zachować cierpliwość, obchodzić się z elektrodami z delikatnością i upewnić się, że wszystkie kroki pośrednie zostały prawidłowo wykonane.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

micro-drive-array-for-chronic-in-vivo-recording-tetrode-assembly

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Mikro-napęd Array do Przewlekłych in vivo Nagrań: Zestaw Tetrodowy

W niniejszym protokole demonstrujemy sposób wykonania macierzy mikrodrajwerów do chronicznych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów.

Układ mikro-napędów do przewlekłych pomiarów in vivo: Konstrukcja napędu

Opisano projektowanie, wykonanie i montaż ultralekkiego zmotoryzowanego mikronapędu. Urządzenie stanowi kosztowo efektywne i łatwe w użyciu rozwiązanie do chronicznych rejestracji pojedynczych jednostek u małych zwierząt w warunkach behawioralnych.

Projekt i montaż ultralekkiego zmotoryzowanego mikronapędu do chronicznych rejestracji neuronalnych u małych zwierząt

Wideo demonstruje jednoczesny zapis elektrofizjologiczny z wielu obszarów mózgu u szczura przy użyciu zintegrowanego układu mikronapędów. Elektrody rejestrujące są umieszczone w opuszce węchowej, elektrody referencyjne w korze czołowej, a elektrody układu mikronapędów w hipokampie. Szczur może swobodnie żerować, a jednoczesny zapis ze wszystkich wszczepionych elektrod jest rejestrowany za pomocą matrycy.

Metoda Micro-drive Array do zapisu elektrofizjologicznego z wielu obszarów mózgu

Opisano projektowanie i montaż mikronapędów do elektrofizjologicznych zapisów in vivo sygnałów mózgowych od myszy. Dzięki przymocowaniu wiązek mikroelektrod do wytrzymałych nośników napędzanych, techniki te pozwalają na długotrwałe i stabilne zapisy neuronowe. Lekka konstrukcja pozwala na nieograniczoną wydajność behawioralną zwierzęcia po wszczepieniu napędu.

Budowa macierzy mikronapędów do przewlekłych nagrań neuronowych u myszy zachowujących się w stanie czuwania

Zrozumienie neuronalnych substratów zachowania wymaga nagrania zespołu obwodów mózgowych. Ze względu na swoją podatność genetyczną, mysz oferuje model do rozwarstwiania obwodów i mimikry choroby. W tym miejscu opisano metodę projektowania i wytwarzania zminiaturyzowanych sond, która jest odpowiednia do celowania w głęboką strukturę mózgu u myszy.

Projektowanie i produkcja ultralekkich, regulowanych sond wieloelektrodowych do zapisów elektrofizjologicznych u myszy

Prezentujemy konstrukcję hipernapędu do druku 3D z osiemnastoma niezależnie regulowanymi tetrodami. Hipernapęd ma za zadanie rejestrować aktywność mózgu swobodnie zachowujących się szczurów przez okres kilku tygodni.

Budowa ulepszonego hipernapędu wielotetrodowego do wielkoskalowej rejestracji neuronalnej u zachowujących się szczurów

Ten protokół opisuje budowę hybrydowego układu mikronapędów, który umożliwia wszczepienie dziewięciu niezależnie regulowanych tetrod i jednej regulowanej sondy opto-krzemowej w dwóch obszarach mózgu u swobodnie poruszających się myszy. Zademonstrowano również metodę bezpiecznego odzyskiwania i ponownego wykorzystania sondy optokrzemowej do wielu celów.

Hybrydowy system mikronapędowy z odzyskiwalną sondą optokrzemową i tetrodą do nagrywania w dwóch lokalizacjach o wysokiej gęstości w swobodnie poruszających się myszach

Prezentowana jest nowatorska technika bezprzewodowa do rejestrowania zewnątrzkomórkowych sygnałów nerwowych z mózgu swobodnie pływających złotych rybek. Urządzenie rejestrujące składa się z dwóch tetrod, mikronapędu, rejestratora danych neuronowych i wodoodpornej obudowy. Wszystkie części są wykonywane na zamówienie, z wyjątkiem rejestratora danych i jego złącza.

Bezprzewodowa elektrofizjologiczna rejestracja neuronów przez ruchome tetrody u swobodnie pływających ryb

Opisujemy tutaj metodę wytwarzania matryc mikroelektrod Ti3C2 MXene i wykorzystywania ich do rejestracji neuronowej in vivo.

Produkcja matryc mikroelektrod Ti3C2 MXene do rejestracji neuronowej in vivo

Tutaj opisujemy projekt mikronapędu, procedurę implantacji chirurgicznej i strategię rekonwalescencji po operacji, które pozwalają na przewlekłe zapisy pola i pojedyncze jednostki z wielu regionów mózgu jednocześnie u młodocianych i dorastających myszy w krytycznym oknie rozwojowym od 20 dnia po urodzeniu (p20) do 60 dnia po urodzeniu (p60) i później.

Lekki implant napędowy do przewlekłych zapisów tetrody u młodych myszy

Tutaj przedstawiamy lekki, opłacalny system implantacji sond dla przewlekłej elektrofizjologii u gryzoni, zoptymalizowany pod kątem łatwości użycia, odzyskiwania sondy, wszechstronności eksperymentalnej oraz zgodności z zachowaniem.

Implant DREAM: lekki, modułowy i opłacalny system implantów do przewlekłej elektrofizjologii u myszy zamocowanych na głowie i swobodnie zachowujących się

Poznaj technikę wytwarzania tetrod i montażu macierzy mikronapędów do przewlekłych rejestracji elektrofizjologicznych u szczurów. Ta metoda umożliwia precyzyjne nagrywanie aktywności neuronalnej in vivo.

Macierz mikronapędów do chronicznych pomiarów in vivo: montaż tetrod

Przeglądaj więcej filmów