Macierz mikronapędów do chronicznych pomiarów in vivo: montaż tetrod

W niniejszym protokole opisujemy wykonanie i implementację wiązek Tetros składających się z czterech elektrod do chronicznych rejestracji in vivo u budzących się gryzoni. W celu rozpoczęcia produkcji Tetros, pasmowe druty mikroelektrodowe składa się dwukrotnie, tworząc wiązkę z czterech równoległych drutów. Następnie druty te są skręcane i utrwalane za pomocą opalarki.

Każdy gotowy tero jest umieszczany w pudełku do przechowywania. W miarę wytwarzania kolejnych teros, każdy z nich jest wsuwany w dedykowany kanał, wchodząc przez otwór w siłowniku liniowym i wychodząc u podstawy macierzy mikronapędów. Każdy z czterech przewodów tero jest podłączony do osobnych pinów na płytce złącza wyjściowego przymocowanej do górnej części macierzy mikronapędów.

Impedancja każdego kanału tero jest obniżana za pomocą procesu galwanizacji złotem. Po zainstalowaniu i pozłaceniu wszystkich terów, dwa przewody uziemiające są przytwierdzone do odpowiednich pinów na płytce złącza, a do ramy macierzy mikronapędów mocowany jest stożek ochronny, który uprzednio został uziemiony. W ten sposób otrzymujemy funkcjonalne macierze mikronapędów Tero gotowe do implantacji. Cześć, jestem Dave Nian z laboratorium Nat Wilson w Instytucie Uczenia się i Pamięci w Pickout.

Dzisiaj w MIT przedstawimy procedurę wytwarzania terosów, ich ładowania oraz końcowych etapów rekonstrukcji mikroprzewodu. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania skoordynowanej aktywności neuronalnej pomiędzy dużymi populacjami a pojedynczymi neuronami w preparacie budzącego się i wykazującego zachowania zwierzęcia. Zapraszamy do rozpoczęcia.

Aby zbudować tero dla naszego standardowego układu mikroprzewodów, zaczynamy od 50 centymetrowego odcinka izolowanego drutu mikrometrycznego o grubości 12 micron. Złóż drut na pół i przesuń palcami wzdłuż obu nici, aby przylegały do siebie. Upewnij się, że obie nici drutu mają dobry kontakt na całej swojej długości.

Ponownie złóż parę, trzymając oba końce razem. Upewnij się, że pętla utworzona na jednym końcu nie jest skręcona. Odetnij cztery przewody na końcu bez pętli tak, aby cztery końcówki były wyrównane.

W następnym kroku będą potrzebne zmodyfikowany zacisk krokodylkowy, zmotoryzowane urządzenie obrotowe oraz poprzeczka umieszczona nad urządzeniem obrotowym. Zacisk krokodylkowy modyfikuje się poprzez przyklejenie plastikowego pręta do jego podstawy. Gdy końcówki są odsłonięte, należy złączyć cztery przewody za pomocą zmodyfikowanego zacisku krokodylkowego.

Zawiesić pętlę z drutu na poziomym pręcie. Umieścić klips krokodylk w stoliku zmotoryzowanym. Wykonać 80 skrętów drutu zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie 40 skrętów przeciwnie do ruchu wskazówek zegara w ciągu około trzech minut.

Parametry te można modyfikować w zależności od potrzeb. Po zakończeniu skręcania, zlutuj druty, ogrzewając je opalarką pod trzema różnymi kątami, stosując średni lub niski przepływ powietrza dla każdego kąta; rozpocznij ogrzewanie jeden do dwóch centymetrów poniżej miejsca, w którym wiązka drutów rozdziela się. Następnie przesuwaj opalarkę w górę i w dół w odległości dwóch centymetrów od drutów przez około pięć sekund.

Należy zachować ostrożność, ponieważ wysokie temperatury całkowicie stopią izolację, co doprowadzi do zwarć. Po stopieniu przewodów, usuń tero z urządzenia do skręcania, delikatnie podnosząc klips krokodylkowy, aby zmniejszyć napięcie tero, a następnie przetnij tero w pobliżu klipsa. Z drugiej strony przetnij pętlę w taki sposób, aby pozostały cztery nieoznaczone pasma drutu o równej długości. Następnie rozdziel poszczególne pasma u góry, delikatnie wyginając druty pęsetą z miękkimi końcówkami.

Tero jest teraz gotowy do załadowania do macierzy mikronapędów. Przygotuj od 21 do 25 dodatkowych dróg Tet i przechowuj je w pudełku wolnym od kurzu do momentu rozpoczęcia procesu ładowania tero. Będziesz potrzebować kompletnej macierzy mikronapędów, jeśli jeszcze jej nie zbudowałeś.

Należy odnieść się do wideo dotyczącego macierzy napędów mikroelektrod do chronicznych pomiarów in vivo w celu wykonania macierzy napędów mikroelektrod zgodnie z naszym planem projektowym. Tero zostanie przymocowane jednym końcem do sprzętu łączącego i zostanie przeprowadzone przez rurkę nośną z poly mid w mikro-napędzie w taki sposób, aby końcówki elektrod wystawały poniżej podstawy macierzy napędów mikroelektrod. Teraz zaprezentujemy proces ładowania dla jednego tero.

Przed rozpoczęciem należy zbudować uchwyt do sondy, który z jednej strony można przymocować do płytki złączy, a z drugiej zaciisnąć w kąpieli lodowej. W tym przykładzie uchwytem jest konektor milax przyklejony do jednego końca rękojeści noża X exacto. Trzymając tetrodę pęsetą z miękką końcówką i korzystając ze stereomikroskopu, wsuń końcówkę tetrody do rurki nośnej z poly mid jednej z mikrosond. Wsuń tetrodę do rurki, aż poszczególne przewody elektrod znajdą się blisko płytki złączy na górze macierzy sond. Należy uważać, aby nie zagiąć przewodów, ponieważ spowoduje to wprowadzenie tetrody do mózgu pod kątem zamiast prostopadle, co osłabi integralność tetrody.

Teraz ostrożnie wprowadź drugi koniec czterech przewodów do odpowiednich otworów w płytce interfejsu elektrod, używając pęsety z miękkimi końcówkami. Ponownie unikaj załamań lub zginania przewodów. Po umieszczeniu wszystkich czterech przewodów, wciśnij złote piny w otwory za pomocą szczypiec z przyciętymi szczękami.

Po wciśnięciu pinów w otwory zostaną one odizolowane od izolacji przewodu, tworząc połączenie elektryczne do późniejszego wykorzystania. Należy monitorować przypisanie napędów mikro do pozycji pinów na płytce interfejsu elektrod. Kontynuuj ładowanie, aż do uzyskania łącznie 18 tetrod.

Trzy pozostałe mikronapędy w macierzy zostaną wykorzystane do umieszczenia elektrod odniesienia. Każda elektroda odniesienia wykonana jest z tero, który wykorzystuje tylko jeden z czterech niewiązanych yns. Aby przymocować elektrody odniesienia, należy postępować zgodnie z procedurą ładowania, jednak przymocować należy tylko jedną z czterech elektrod do odpowiedniego pinu elektrody odniesienia na płytce złączy.

W przypadku planowania rejestracji z wielu obszarów warto wcześniej zaplanować połączenia między tetrodami a płytką złącza. Na przykład, zgrupuj tetrody skierowane do jednego regionu anatomicznego na płytce interfejsu elektrod. Pozwoli to zminimalizować ryzyko regulacji niewłaściwej tetrody podczas eksperymentów.

Po zakończeniu ładowania tero, przygotuj dwa przewody uziemiające: jeden dla zwierzęcia i jeden dla stożka ochronnego. Odetnij odizolowany stalowy drut o długości sześciu cali i za pomocą metalowej pęsety usuń trzy milimetry izolacji z każdego końca drutu. Następnie odetnij odizolowany stalowy drut o długości czterech cali.

Usuń trzy milimetry izolacji z jednego końca i jeden centymetr z drugiego końca. Przesuń sześciocalowy przewód uziemiający przez otwór z boku macierzy mikronapędów w górę, w stronę płytki interfejsu. Połącz odsłonięty przewód z płytką interfejsu elektrod za pomocą złotego pinu w wyznaczonym otworze uziemiającym.

Przewód ten zostanie podłączony do czaszki zwierzęcia. Poprowadź czterocalowy przewód uziemiający równolegle do wcześniej zainstalowanego przewodu uziemiającego. Podłącz odsłonięty koniec o długości 3 mm do płyty interfejsu elektrod, używając złotego pinu w innym wyznaczonym otworze uziemiającym.

Ten drut zostanie później podłączony do ochronnego stożka, który będzie pełnił rolę małej klatki Faradaya w celu zredukowania zakłóceń. Po zakończeniu podłączania przewodów możemy przejść do doprecyzowania naszych teros. Celem tego procesu jest przycięcie wszystkich teros tak, aby były nieco dłuższe niż głębokość docelowej struktury mózgu w naszym przykładzie.

Mikronapędy są zaprojektowane dla maksymalnego zakresu ruchu od pięciu do sześciu milimetrów, co wystarcza do dotarcia do wielu obszarów neokory oraz grzbietowej części hipokampa dorosłego szczura. Najpierw opuść wszystkie mikronapędy tak, aby tetrody były maksymalnie i jednocześnie odsłonięte. Przytnij wszystkie tetrody do długości o około pięć milimetrów większej niż pożądana długość końcowa, używając pary ostrych, precyzyjnych nożyczek do końcowego cięcia.

Przygotuj parę ząbkowanych nożyczek w kąpieli lodowej; przymocuj jeden uchwyt pod lekkim kątem w dół, z ząbkami skierowanymi do góry, pozostawiając drugi uchwyt swobodnie zwisający. Następnie całkowicie wycofaj wszystkie elektrody Tet do kaniul prowadzących, przekręcając mikronapędy w górę. Używając stereomikroskopu, w pełni wysuń jedną elektrodę Tet z kaniuli.

Używając linijki, ustaw nożyczki ząbkowane w pożądanej odległości od prowadnicy kaniuli. Powoli i delikatnie przetnij tero jednym płynnym ruchem. Po przecięciu tero wysuń mikro-napęd w górę o trzy do czterech milimetrów.

Powtórz ten proces dla każdego tero, aż wszystkie zostaną przecięte. W tym momencie można przystąpić do pozłacania. Pozłacanie.

Warstwa ochronna jest kluczowa dla zapewnienia stabilnych pomiarów w długim okresie. Zapobiega ona korozji i poprawia biokompatybilność. Ustaw miernik impedancji w trybie zewnętrznym w generatorze prądu oraz w trybie kontroli DC z wyjściem audio.

Dotknij dwoma końcówkami generatora prądu sześciu możliwych par kanałów w każdym tero i wykorzystaj sygnał dźwiękowy, aby sprawdzić, czy między parami występują zwarcia. Zwarcie między parami kanałów brzmi w ten sposób. Jeśli występuje zwarcie, przetnij ponownie tero nożyczkami ząbkowanymi i powtórz test.

Jeśli problem będzie nadal występował, należy zutylizować drogę Tet i wymienić ją na nową. Przesuń wszystkie mikroprzenośniki w dół, wysuwając wszystkie drogi Tet tak daleko, jak to możliwe. Zmodyfikuj konfigurację aparatury do sprawdzania impedancji elektrod.

Następnie zanurz końcówki wszystkich terod w kąpieli standardowego roztworu do pozłacan Respiratory. Kąpiel złota jest połączona elektrycznie z ujemnym przewodem miernika impedancji. Sprawdź impedancję elektrody, dotykając dodatnim przewodem miernika impedancji odpowiedniego pinu na płytce złączy.

Zmierzyć i zapisać impedancję każdego przewodu w matrycy mikronapędów. Typowe wartości na generatorze prądu wynoszą od jednego do trzech megaomów. Ustawić natężenie prądu w zakresie od jednego do trzech mikroamperów.

Następnie bezpiecznie podłącz dodatni przewód miernika impedancji do pinu na płytce złączy. Na mierniku impedancji.

Szybko przełączaj z trybu normalnego na tryb obejścia i z powrotem, pozostając w trybie obejścia. Prąd przepłynie przez ścieżkę Tet i roztwór złota, a na końcówce elektrody zostanie osadzone złoto. Impedancja po każdej serii platerowania powinna być niższa niż przed nią.

Powtórz obecny impuls. Jeśli impedancja nie spadła poniżej 1 MΩ. Konserwatywny zakres dopuszczalnych impedancji wynosi od 250 kΩ do 350 kΩ.

Jeśli impedancja spadnie poniżej 200 kΩ, może to wskazywać na zwarcie. Jeśli po wielokrotnych impulsach impedancja nie spadnie w wystarczającym stopniu, końcówka elektrody może być zablokowana. Należy ponownie przyciąć tero, sprawdzić czy nie ma zwarć i powtórzyć proces pozłacania.

Jeśli ponowne nacinanie nie pomaga, należy wymienić tero i rozpocząć procedurę od nowa. Po osadzeniu wszystkich teros, zanurz je w etanolu i pozostaw do wyschnięcia na trzy do pięciu minut. Sprawdź obecność zwarć w obrębie teros, używając generatora prądu, przy końcówkach teros wystawionych na działanie powietrza.

Jeśli między dwiema lub więcej elektrodami tero występuje połączenie stałoprądowe (DC), należy ponownie wyciąć tero i ponownie je pozłocić. Po zakończeniu pozłacania wszystkich tero należy przenieść je do napędu. Jako ostatni krok, na górnej części każdego mikronapędu, nanieś kroplę średniolepkiego kleju cyjanoakrylowego na miejsce styku każdego tero z odpowiadającą mu rurką polimerową.

Zabezpieczy to tero w jego mikro-napędzie. Celem osłony ochronnej jest odizolowanie mikro-napędów oraz odsłoniętego przewodu tero od czynników zewnętrznych. Zapewnia ona również wsparcie podczas manipulacji w trakcie eksperymentu i redukuje szumy elektryczne.

Używamy plastikowego stożka wydrukowanego w technologii 3D. Można jednak wykonać stożek z innych materiałów, na przykład z wygiętego kawałka puszki po napoju. Można również wziąć plastikowy stożek i przymocować taśmę aluminiową do jego powierzchni wewnętrznej lub zewnętrznej.

Najpierw wkręć i częściowo obróć 3 śruby o rozmiarze 1 72 i długości trzech szesnastych cala w bokach stożka, gdy układ napędowy jest zawieszony. Nałóż stożek na napęd. Upewnij się, że oba przewody uziemiające wystają z dołu układu napędowego.

Owiń odsłoniętą część czterocalowego przewodu uziemiającego kilka razy wokół jednej z śrub 1 72 i mocno dokręć śrubę. Mocno przymocuj stożek do podstawy napędu, dokręcając pozostałe dwie śruby stożka. Produkcja macierzy mikronapędów jest teraz zakończona. Twoja macierz mikronapędów jest załadowana 18 terosami w trzech referencjach.

Jest on zamknięty w ochronnym stożku i kapturku w celu zapewnienia trwałości. Gotowy napęd waży zazwyczaj średnio od 20 do 25 gramów.

Gotowy układ elektrod zostaje wszczepiony zgodnie ze standardową procedurą chirurgiczną. Jak widać, układ jest połączony z układem przedwzmacniacza oraz wiązką przewodów, które przesyłają sygnał do sprzętu i oprogramowania do akwizycji danych. Przedstawiliśmy właśnie sposób wykonania terody oraz kompletną procedurę konstrukcji mikro-układu elektrod.

W tym filmie pokazaliśmy, jak wytwarzać terosy oraz jak je ładować i warunkować do rejestracji in vivo. Dodatkowo przedstawiliśmy sposób dodania stożka do matrycy mikrosterownika, aby zapewnić jej trwałość w czasie. Konstrukcja matrycy mikrosterownika składa się z wielu etapów, dlatego prosimy o cierpliwość, ostrożne obchodzenie się z elektrodami i upewnienie się, że wszystkie kroki pośrednie zostały prawidłowo wykonane.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.