Name: Drosophila Immunohistochemia larw NMJ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj technikę immunohistochemii na larwach Drosophila w celu wizualizacji białek synaptycznych w zwoju nerwowo-mięśniowym. Ta metoda pozwala badać genetyczną regulację rozwoju synaps in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przed rozpoczęciem
<ol>
<li>Przygotować następujące roztwory: PBT (0,1% Triton X100 w 1X PBS), PBTB (0,2% BSA w PBT) oraz PBTN (2% NGS w PBTB).</li>
<li>Przeprowadzić sekcję larw Drosophila. Prosimy zapoznać się z materiałem Drosophila Larval NMJ Dissection (Sekcja NMJ larw Drosophila).</li>
</ol>
Immunohistochemia
<ol>
<li>Przenieś larwy do probówki 1,5 ml zawierającej PBT. Przemyj larwy dwukrotnie w PBT przez 15 minut. Uwaga: aby przemyć próbki, umieść probówkę 1,5 ml na mieszalniku nutacyjnym. Usuń płyn za pomocą pipety i zastąp go świeżym roztworem.</li>
<li>Usuń PBT. Przemyj dwukrotnie w PBTB przez 30 minut.</li>
<li>Usuń PBTB. Przemyj dwukrotnie w PBTN przez 15 minut.</li>
<li>Inkubuj w przeciwciałach pierwszorzędowych rozcieńczonych w PBTN w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w 4º C przez noc.</li>
<li>Opłucz dwukrotnie PBTB. Uwaga: aby opłukać, dodaj roztwór i szybko go usuń.</li>
<li>Przemyj dwukrotnie w PBTB przez 15 minut.</li>
<li>Przemyj w PBTN przez 30 minut.</li>
<li>Inkubuj w przeciwciałach wtórnych (oraz w koniugacie przeciwciał pierwszorzędowych, jeśli jest używany) rozcieńczonych w PBTN.</li>
<li>Przykryj folią aluminiową i inkubuj przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Opłucz dwukrotnie PBTB.</li>
<li>Przemyj dwukrotnie PBTB przez 15 minut.</li>
<li>Przejdź do montowania preparatów.</li>
</ol>
Montaż
Uwaga: W przypadku natychmiastowego obrazowania próbek należy zastosować montowanie w glicerolu. W przypadku przechowywania próbek przed obrazowaniem (powyżej jednego tygodnia) lub konieczności wielokrotnego obrazowania należy zastosować medium Prolong Gold. Aby go użyć, umieść butelkę z medium Prolong w kąpieli wodnej o temperaturze 65ºC na 2-3 minuty. Pobierz aletkot Prolong Gold i przechowuj ją na bloku grzewczym w temperaturze 45-50º C.
<ol>
<li>Przelej barwione preparaty w PBT do szkiełka zegarkowego.</li>
<li>Nanieś niewielką ilość glicerolu na czyste szkiełko przedmiotowe do obróbki.</li>
<li>Przenieś zwierzęta na szkiełko do obróbki, wyjmując je z szkiełka zegarkowego za róg za pomocą pęsety. Upewnij się, że są one skierowane kutykulą do dołu.</li>
<li>Usuń głowę i ogon za pomocą nowej żyletki na szkiełku do obróbki. W tym celu dobrze sprawdza się nóż typu Exacto z ostrzem nr 16.</li>
<li>Na innym szkiełku (szkiełku do montażu) umieść małą kroplę glicerolu/ProLong i rozprowadź ją czystą pęsetą.</li>
<li>Przenieś rozsekcjonowane zwierzęta na szkiełko do montażu za ich krawędź, uważając, aby ich nie odwrócić. Staraj się montować je w rzędach w tej samej orientacji. Na jednym szkiełku zamontuj od 6 do 8 zwierząt.</li>
<li>Nałóż szkiełko nakrywkę, przykładając jej krawędź do glicerolu/ProLong i powoli ją puszczając.</li>
<li>Zapieczętuj szkiełko lakierem do paznokci. Uwaga [Nie wykonuj zdjęć, dopóki lakier nie wyschnie. Zazwyczaj trwa to dziesięć minut. W przypadku próbek montowanych w ProLong Gold pozostaw szkiełka do wyschnięcia na co najmniej trzy godziny przed zapieczętowaniem lub obrazowaniem].</li>
</ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

Immunohistochemia (IHC) jest kluczowa w badaniu biologii NMJ, ponieważ umożliwia wizualizację złącza nerwowo-mięśniowego. Osiąga się to poprzez zastosowanie przeciwciał rozpoznających błonę neuronalną (np. HRP), presynapsę (np. CSP, SYT) i/lub postsynapsę (np. DLG). Można również barwić cząsteczki sygnałowe, białka strukturalne lub nowe białka będące przedmiotem zainteresowania. Następnie można wprowadzić mutacje w genach lub zmienić ich ekspresję, a IHC pozwala wykryć zaburzenia struktury synaptycznej i/lub sygnalizacji...

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło nutacyjne Adams&amp;#8482;</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Nóż precyzyjny nr 1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza nr 16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik antyfadingowy ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemia nmj larw drosophila

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

TheDrosophilazłącze neuromięśniowe (NMJ) jest uznanym systemem modelowym wykorzystywanym do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej. Powszechne zastosowanieDrosophilaukład ruchowy jest ceniony ze względu na jego wysoką dostępność. Można go analizować z rozdzielczością pojedynczych komórek. W każdym hemisegmencie znajduje się 30 mięśni, których rozmieszczenie w obwodowej ścianie ciała jest znane. Łącznie 31 neuronów ruchowych łączy się z tymi mięśniami w sposób wykazujący wysoką wierność. Wykorzystując biologię molekularną i genetykę, można tworzyć zwierzęta transgeniczne lub mutanty. Następnie można badać wpływ rozwoju na morfologię i funkcję NMJ. Immunohistochemię można wykorzystać do wyraźnego obrazowania komponentów NMJ. W niniejszym artykule demonstrujemy, jak wykorzystać barwienie przeciwciałami do wizualizacjiDrosophilalarwalne NMJ.

Niniejszy protokół demonstruje sposób wykonania immunohistochemii na wypreparowanych larwach Drosophila.

Immunohistochemia NMJ larw Drosophila

Złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) muchowca *Drosophila* jest uznanym systemem modelowym wykorzystywanym do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej. Powszechne zastosowanie...

Niniejszy protokół opisuje sposób przeprowadzania barwienia immunohistochemicznego w preparatach z wypreparowanych larw gsof w celu wizualizacji białek zaangażowanych w rozwój synaps. Przez całą procedurę, zarówno podczas inkubacji z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi, jak i w krokach płukania, stosowana jest probówka o pojemności 1,7 ml. Następnie larwy przenosi się na szkiełko do obróbki, gdzie są przycinane nożykiem Exacto; w celu obserwy preparaty przenosi się do kropli odczynnika zapobiegającego blaknięciu.Na szkiełku przedmiotowym zaklejamy ostatecznie szkiełko nakrywkowe za pomocą laku do paznokci. Cześć, nazywam się Jonathan Brent i pochodzę z laboratorium Briana McCade'a w Katedrze Fizjologii i Biofizyki Komórkowej na College of Physicians and Surgeons Uniwersytetu Columbia. Stosujemy tę procedurę do badania regulacji genetycznej tworzenia się synaps w złączu nerwowo-mięśniowym oraz rozwijającym się węźle.Zacznijmy zatem. Przed przeprowadzeniem immunohistochemii larw gsof n MJ należy najpierw prawidłowo przeprowadzić ich sekcję. Aby zapoznać się z tą procedurą, obejrzyj towarzyszący artykuł wideo zatytułowany Drosophila Larva N MJ Dissection.Aby rozpocząć procedurę, należy przygotować trzy świeże roztwory. Po pierwsze, przygotuj roztwór PBT, dodając detergent do świeżo przygotowanego PBS. Po drugie, pobierz alikwot albuminy surowicy bydlęcej i dodaj go do roztworu PBT.Aby przygotować roztwór PBTB, należy pobrać normalne surowicę kozią i dodać ją do roztworu PB TB w celu otrzymania roztworu PBTN. Po przygotowaniu tych roztworów, należy przenieść larwy do probówki 1,5 ml zawierającej 1 ml PBT. Jest to pierwszy etap płukania.Każde przemywanie polega na wymianie roztworu, w którym zanurzone są larwy, a następnie inkubacji larw na powoli obracającym się mieszadle typu mutator. Nie należy przenosić larw z probówki do probówki, ponieważ spowoduje to ich uszkodzenie. To pierwsze przemywanie trwa 15 minut w temperaturze pokojowej.Po 15 minutach mieszania wymienić PBT na świeży PBT za pomocą pipety i płukać larwy przez kolejne 15 minut. Podczas wymiany roztworów płuczących należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić larw. Po zakończeniu płukania w PBT, płukać larwy w PBTB przez 30 minut.Powtórz to płukanie w świeżym roztworze przez kolejne 30 minut. Po tym etapie płukanie w PBTB jest zakończone. Przepłucz dwukrotnie w PBTN, po 15 minut na każde płukanie.Podczas drugiego etapu płukania przeciwciało pierwszorzędowe można rozcieńczyć w PBTN do pożądanego stężenia roboczego. Po płukaniu należy inkubować larwy w tej mieszaninie przeciwciał przez jedną godzinę przy delikatnym mieszaniu w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu inkubacji należy odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i szybko kilkukrotnie przepłukać larwy za pomocą PBTB, aby usunąć pozostałości przeciwciał.Aby przygotować larwy do kolejnej inkubacji z przeciwciałami, należy przemyć je raz w PBTB przez 15 minut, a następnie dwukrotnie w PBTN przez 30 minut. Przeciwciała wtórne należy rozcieńczyć w PBTN do pożądanego stężenia roboczego, a następnie inkubować larwy w tej mieszaninie przez półtorej godziny. W temperaturze pokojowej należy upewnić się, że larwy są przykryte, aby zapobiec ekspozycji na światło i zminimalizować odbarwianie floor four.Po półtorej godziny należy usunąć roztwór przeciwciał wtórnych i kilkukrotnie wypłukać larwy w PBTB. Następnie larwy należy dwukrotnie przemyć w PBTV przez 15 minut. Wszystkie pozostałe etapy mycia i przechowywania larw powinny odbywać się przy minimalnej ekspozycji na światło, dlatego należy pamiętać o ich zasłonięciu.Przenieś larwy z probówki 1,5 ml do PBT na szklanym szkiełku procesowym. Larwy są teraz gotowe do montowania; aby zamontować zabarwione larwy w roztworze gold prolonged, umieść je w kąpieli wodnej w temperaturze 65 °C przez dwie do trzech minut. Następnie weź Eloqua i umieść go na bloku grzejnym ustawionym na 50 °C.Nanieś nieco PB TB na szkiełko preparacyjne. Przenieś larwy do PB tb. Obróć larwy tak, aby znajdowały się kutykulą do dołu, używając nożyka exacto z ostrzem nr 16, a następnie odetnij głowy i ogony larw.Na tym etapie można również użyć żyletki. Następnie przygotuj szkiełko przedmiotowe, nakładając na czyste szkiełko 40 µL Prolong Gold z podgrzanej porcji i rozprowadzając preparat za pomocą czystej pęsety. Używając pęsety.Ostrożnie przenieś od sześciu do ośmiu przygotowanych larw z szkiełka do obróbki na szkiełko do montażu. Staraj się zachować ich pierwotną orientację i układać je stroną kutykuli do dołu w celu zamocowania larw. Nałóż szkiełko nakrywkowe na rozciągnięty roztwór.Ustaw go na jednej krawędzi w obwodzie wydłużonego obszaru cieczy i ostrożnie nałóż szkiełko nakrywkowe, aby przykryć próbki. Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywkowego na szkiełku przedmiotowym dowolnym kolorem gęstego, taniego lakieru do paznokci. Pozostaw szkiełko do wyschnięcia na co najmniej trzy godziny.Jeśli preparaty zostaną zobrazowane tylko raz i bezpośrednio po przygotowaniu, przedłużony czas inkubacji z roztworem złota można zastąpić zastosowaniem glicerolu. W takim przypadku czas schnięcia lakieru do paznokci i glicerolu wynosi jedynie około 10 minut, w przeciwieństwie do trzech godzin w przypadku jakiegokolwiek protokołu barwienia. Celem jest uzyskanie wysokiego sygnału specyficznego przy niskim poziomie tła.Osiąga się to poprzez zastosowanie wysokiej jakości przeciwciał oraz dokładne przeprowadzenie etapów blokowania i przemywania. Obrazy te przedstawiają synapsy typu dzikiego, a także synapsy szczepu muchy wykazującego mutację receptora BMP typu drugiego, znaną jako mutant wishful thinking lub witch. Błonę neuronalną zabarwiono na niebiesko za pomocą przeciwciała przeciwko peroksydazie chrzanowej.Pęcherzyki synaptyczne zaznaczone na czerwono zostały zabarwione przeciwciałem antysynaptycznym. Postsynapsa zaznaczona na zielono została zabarwiona przeciwciałem przeciwko discs large. Wyniki te wykazały, że mutacja receptora BMP typu dwa wywołuje fenotyp niedorozwoju synaptycznego.Mutant ten odegrał kluczową rolę w wykazaniu, że BMP są sygnałami wstecznymi regulującymi liczbę butonów zakończeń synaptycznych. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić immunohistochemię w obrębie larwalnego złącza nerwowo-mięśniowego przełyku. Podczas wykonywania tej procedury.Ważne jest, aby przeprowadzić procedurę z zachowaniem odpowiedniego czasu, co zapewni maksymalną powtarzalność i niskie tło. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.

drosophila-larval-nmj-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Drosophila Immunohistochemia NMJ Larwalna

Niniejszy protokół demonstruje sposób przeprowadzania sekcji larw Drosophila w celu przygotowania ich do immunohistochemii i/lub obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego.

Disekcja NMJ larw Drosophila

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Neurony sensoryczne o arboryzacji dendrytycznej w obwodowym układzie nerwowym larw Drosophila stanowią użyteczne modele do wyjaśniania zarówno ogólnych, jak i specyficznych dla danej klasy neuronów mechanizmów różnicowania neuronów. Przedstawiamy praktyczny przewodnik po generowaniu i analizie mozaik genetycznych neuronów o arboryzacji dendrytycznej.

Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów sensorycznych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaik genetycznych

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Aby zrozumieć, w jaki sposób podczas rozwoju kształtowane są złożone formy komórek, takie jak dendryty neuronalne, kluczowa jest możliwość dokładnego badania organizacji mikrotubul. W niniejszej pracy opisujemy niezawodną metodę znakowania immunohistologicznego służącą do badania organizacji mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych o rozgałęzionym drzewku dendrytycznym, w tchawce, mięśniach oraz innych tkankach ściany ciała larwy Drosophila.

Immunohistochemiczne znakowanie mikrotubul w dendrytach neuronów sensorycznych, tchawkach i mięśniach ściany ciała larwy Drosophila

Połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ) jest używane jako model do badania morfologii i funkcji synaps. Ten film opisuje ważne cechy, które naukowcy określają ilościowo, aby scharakteryzować NMJ. Przykładowy protokół demonstruje oprogramowanie zdolne do automatycznego wykonywania kwantyfikacji.

Drosophila Kwantyfikacja połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ): metoda oceny morfologii i funkcji synaps

Ten protokół pokazuje, jak można użyć testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji in situ białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila. Dzięki tej technice wykazano, że duże dyski i Hu-li tai shao tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym, związek wcześniej zidentyfikowany poprzez koimmunoprecypitację.

Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Morfologia, rozmiar i lokalizacja organelli wewnątrzkomórkowych są ewolucyjnie zachowane i wydają się bezpośrednio wpływać na ich funkcję. Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych procesów stało się ważnym celem współczesnej biologii. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób badania te można ułatwić dzięki zastosowaniu technik ilościowych.

Dlaczego kwantyfikacja ma znaczenie: charakterystyka fenotypów w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila

Ten raport przedstawia nową procedurę przygotowania próbki do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila. Metoda ta jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu z metodą tradycyjną i jest szczególnie przydatna w analizie ultrastrukturalnej połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila.

Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Poznaj technikę immunohistochemii na larwach Drosophila w celu wizualizacji białek synaptycznych w zwoju nerwowo-mięśniowym. Ta metoda pozwala badać genetyczną regulację rozwoju synaps in vivo.

Immunohistochemia NMJ larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów