Name: Drosophila Immunohistochemia larw NMJ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-03-28T00:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Poznaj technikę immunohistochemii na larwach Drosophila w celu wizualizacji białek synaptycznych w zwoju nerwowo-mięśniowym. Ta metoda pozwala badać genetyczną regulację rozwoju synaps in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Przed rozpoczęciem
<ol>
<li>Przygotować następujące roztwory: PBT (0,1% Triton X100 w 1X PBS), PBTB (0,2% BSA w PBT) oraz PBTN (2% NGS w PBTB).</li>
<li>Przeprowadzić sekcję larw Drosophila. Prosimy zapoznać się z materiałem Drosophila Larval NMJ Dissection (Sekcja NMJ larw Drosophila).</li>
</ol>
Immunohistochemia
<ol>
<li>Przenieś larwy do probówki 1,5 ml zawierającej PBT. Przemyj larwy dwukrotnie w PBT przez 15 minut. Uwaga: aby przemyć próbki, umieść probówkę 1,5 ml na mieszalniku nutacyjnym. Usuń płyn za pomocą pipety i zastąp go świeżym roztworem.</li>
<li>Usuń PBT. Przemyj dwukrotnie w PBTB przez 30 minut.</li>
<li>Usuń PBTB. Przemyj dwukrotnie w PBTN przez 15 minut.</li>
<li>Inkubuj w przeciwciałach pierwszorzędowych rozcieńczonych w PBTN w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę lub w 4º C przez noc.</li>
<li>Opłucz dwukrotnie PBTB. Uwaga: aby opłukać, dodaj roztwór i szybko go usuń.</li>
<li>Przemyj dwukrotnie w PBTB przez 15 minut.</li>
<li>Przemyj w PBTN przez 30 minut.</li>
<li>Inkubuj w przeciwciałach wtórnych (oraz w koniugacie przeciwciał pierwszorzędowych, jeśli jest używany) rozcieńczonych w PBTN.</li>
<li>Przykryj folią aluminiową i inkubuj przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
<li>Opłucz dwukrotnie PBTB.</li>
<li>Przemyj dwukrotnie PBTB przez 15 minut.</li>
<li>Przejdź do montowania preparatów.</li>
</ol>
Montaż
Uwaga: W przypadku natychmiastowego obrazowania próbek należy zastosować montowanie w glicerolu. W przypadku przechowywania próbek przed obrazowaniem (powyżej jednego tygodnia) lub konieczności wielokrotnego obrazowania należy zastosować medium Prolong Gold. Aby go użyć, umieść butelkę z medium Prolong w kąpieli wodnej o temperaturze 65ºC na 2-3 minuty. Pobierz aletkot Prolong Gold i przechowuj ją na bloku grzewczym w temperaturze 45-50º C.
<ol>
<li>Przelej barwione preparaty w PBT do szkiełka zegarkowego.</li>
<li>Nanieś niewielką ilość glicerolu na czyste szkiełko przedmiotowe do obróbki.</li>
<li>Przenieś zwierzęta na szkiełko do obróbki, wyjmując je z szkiełka zegarkowego za róg za pomocą pęsety. Upewnij się, że są one skierowane kutykulą do dołu.</li>
<li>Usuń głowę i ogon za pomocą nowej żyletki na szkiełku do obróbki. W tym celu dobrze sprawdza się nóż typu Exacto z ostrzem nr 16.</li>
<li>Na innym szkiełku (szkiełku do montażu) umieść małą kroplę glicerolu/ProLong i rozprowadź ją czystą pęsetą.</li>
<li>Przenieś rozsekcjonowane zwierzęta na szkiełko do montażu za ich krawędź, uważając, aby ich nie odwrócić. Staraj się montować je w rzędach w tej samej orientacji. Na jednym szkiełku zamontuj od 6 do 8 zwierząt.</li>
<li>Nałóż szkiełko nakrywkę, przykładając jej krawędź do glicerolu/ProLong i powoli ją puszczając.</li>
<li>Zapieczętuj szkiełko lakierem do paznokci. Uwaga [Nie wykonuj zdjęć, dopóki lakier nie wyschnie. Zazwyczaj trwa to dziesięć minut. W przypadku próbek montowanych w ProLong Gold pozostaw szkiełka do wyschnięcia na co najmniej trzy godziny przed zapieczętowaniem lub obrazowaniem].</li>
</ol>

<ol><li>Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+the+larval+neuromuscular+junction+in+Drosophila+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Properties of the larval neuromuscular junction in Drosophila Melanogaster.</a> J. Physiol. 262, 189-214 (1976).</li>
<li>Johansen, J., Halpern, M. E., Johansen, K. M., Keshishian, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotypic+morphology+of+glutamatergic+synapses+on+identified+muscle+cells+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Stereotypic morphology of glutamatergic synapses on identified muscle cells of Drosophila larvae.</a> J Neurosci. 9, 710-725 (1989).</li>
<li>Kesheshian, H., Broadie, K., Chiba, A., Bate, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+neuromuscular+junction%3A+a+model+system+for+studying+synaptic+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Drosophila neuromuscular junction: a model system for studying synaptic development and function.</a> Annu Rev Neurosci. 19, 545-575 (1996).</li>
<li>Collins, C. A., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+development%3A+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Synaptic development: insights from Drosophila.</a> Curr Opin Neurobiol. 17 (1), 35-42 (2007).</li>
</ol>

Immunohistochemia (IHC) jest kluczowa w badaniu biologii NMJ, ponieważ umożliwia wizualizację złącza nerwowo-mięśniowego. Osiąga się to poprzez zastosowanie przeciwciał rozpoznających błonę neuronalną (np. HRP), presynapsę (np. CSP, SYT) i/lub postsynapsę (np. DLG). Można również barwić cząsteczki sygnałowe, białka strukturalne lub nowe białka będące przedmiotem zainteresowania. Następnie można wprowadzić mutacje w genach lub zmienić ich ekspresję, a IHC pozwala wykryć zaburzenia struktury synaptycznej i/lub sygnalizacji...

<table><tbody><tr><td>Stereomikroskop &amp;#8220;Stemi&amp;#8221; 2000</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>495101-9804-000</td><td></td></tr><tr><td>Źródło światła KL 1500 LCD</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>000000-1063-181</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont SS</td><td>Fine Science Tools</td><td>11200-33</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Mieszadło nutacyjne Adams&amp;#8482;</td><td>BD Biosciences</td><td>421105</td><td></td></tr><tr><td>Nóż precyzyjny nr 1</td><td>X-Acto</td><td>3201</td><td></td></tr><tr><td>Ostrza nr 16</td><td>X-Acto</td><td>216</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik antyfadingowy ProLong Gold</td><td>Invitrogen</td><td>36930</td><td></td></tr></tbody></table>

immunohistochemia nmj larw drosophila

Drosophila Larval NMJ Immunohistochemistry

TheDrosophilazłącze neuromięśniowe (NMJ) jest uznanym systemem modelowym wykorzystywanym do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej. Powszechne zastosowanieDrosophilaukład ruchowy jest ceniony ze względu na jego wysoką dostępność. Można go analizować z rozdzielczością pojedynczych komórek. W każdym hemisegmencie znajduje się 30 mięśni, których rozmieszczenie w obwodowej ścianie ciała jest znane. Łącznie 31 neuronów ruchowych łączy się z tymi mięśniami w sposób wykazujący wysoką wierność. Wykorzystując biologię molekularną i genetykę, można tworzyć zwierzęta transgeniczne lub mutanty. Następnie można badać wpływ rozwoju na morfologię i funkcję NMJ. Immunohistochemię można wykorzystać do wyraźnego obrazowania komponentów NMJ. W niniejszym artykule demonstrujemy, jak wykorzystać barwienie przeciwciałami do wizualizacjiDrosophilalarwalne NMJ.

Niniejszy protokół demonstruje sposób wykonania immunohistochemii na wypreparowanych larwach Drosophila.

Immunohistochemia NMJ larw Drosophila

Złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) muchowca *Drosophila* jest uznanym systemem modelowym wykorzystywanym do badania rozwoju i plastyczności synaptycznej. Powszechne zastosowanie...

Niniejszy protokół opisuje sposób przeprowadzania barwienia immunohistochemicznego w preparatach z wypreparowanych larw gsof w celu wizualizacji białek zaangażowanych w rozwój synaps. Przez całą procedurę, zarówno podczas inkubacji z przeciwciałami pierwotnymi i wtórnymi, jak i w krokach płukania, stosowana jest probówka o pojemności 1,7 ml. Następnie larwy przenosi się na szkiełko do obróbki, gdzie są przycinane nożykiem Exacto; w celu obserwy preparaty przenosi się do kropli odczynnika zapobiegającego blaknięciu.Na szkiełku przedmiotowym zaklejamy ostatecznie szkiełko nakrywkowe za pomocą laku do paznokci. Cześć, nazywam się Jonathan Brent i pochodzę z laboratorium Briana McCade'a w Katedrze Fizjologii i Biofizyki Komórkowej na College of Physicians and Surgeons Uniwersytetu Columbia. Stosujemy tę procedurę do badania regulacji genetycznej tworzenia się synaps w złączu nerwowo-mięśniowym oraz rozwijającym się węźle.Zacznijmy zatem. Przed przeprowadzeniem immunohistochemii larw gsof n MJ należy najpierw prawidłowo przeprowadzić ich sekcję. Aby zapoznać się z tą procedurą, obejrzyj towarzyszący artykuł wideo zatytułowany Drosophila Larva N MJ Dissection.Aby rozpocząć procedurę, nal

drosophila-larval-nmj-immunohistochemistry

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Drosophila Immunohistochemia NMJ Larwalna

Niniejszy protokół demonstruje sposób przeprowadzania sekcji larw Drosophila w celu przygotowania ich do immunohistochemii i/lub obrazowania złącza nerwowo-mięśniowego.

Disekcja NMJ larw Drosophila

Niniejszy protokół opisuje niezawodną metodę znieczulania i obrazowania nienaruszonych larw Drosophila melanogaster. Wykorzystaliśmy lotny anestetyk desfluran, aby umożliwić powtarzalne obrazowanie z rozdzielczością podkomórkową oraz ponowną identyfikację struktur przez okres do kilku dni1.

Obrazowanie in vivo nienaruszonych larw Drosophila z rozdzielczością podkomórkową

Złącze neuromięśniowe (NMJ) Drosophila melanogaster stanowi istotny system modelowy do badania prawidłowej funkcji synaptycznej, jak i zaburzeń tej funkcji występujących w niektórych chorobach neurologicznych. Przedstawiamy protokół sekcji układu ruchowego larw Drosophila oraz immunobarwienia białek strefy aktywnej w obrębie NMJ.

Disekcja i obrazowanie stref aktywnych w połączeniu nerwowo-mięśniowym Drosophila

Neurony sensoryczne o arboryzacji dendrytycznej w obwodowym układzie nerwowym larw Drosophila stanowią użyteczne modele do wyjaśniania zarówno ogólnych, jak i specyficznych dla danej klasy neuronów mechanizmów różnicowania neuronów. Przedstawiamy praktyczny przewodnik po generowaniu i analizie mozaik genetycznych neuronów o arboryzacji dendrytycznej.

Analiza morfologiczna dendrytów i aksonów obwodowych neuronów sensorycznych larw Drosophila z wykorzystaniem mozaik genetycznych

Barwienie przeciwciałami poczwerek Drosophila może usprawnić analizy genetyczne rozwoju odwłoka osobników dorosłych. Przedstawiamy nasz protokół sekcji, utrwalania i barwienia przeciwciałami odwłoka poczwarek Drosophila w określonych stadiach rozwojowych.

Immunohistochemia odwłoka poczwarki Drosophila

Aby zrozumieć, w jaki sposób podczas rozwoju kształtowane są złożone formy komórek, takie jak dendryty neuronalne, kluczowa jest możliwość dokładnego badania organizacji mikrotubul. W niniejszej pracy opisujemy niezawodną metodę znakowania immunohistologicznego służącą do badania organizacji mikrotubul w dendrytach neuronów czuciowych o rozgałęzionym drzewku dendrytycznym, w tchawce, mięśniach oraz innych tkankach ściany ciała larwy Drosophila.

Immunohistochemiczne znakowanie mikrotubul w dendrytach neuronów sensorycznych, tchawkach i mięśniach ściany ciała larwy Drosophila

Połączenie nerwowo-mięśniowe Drosophila (NMJ) jest używane jako model do badania morfologii i funkcji synaps. Ten film opisuje ważne cechy, które naukowcy określają ilościowo, aby scharakteryzować NMJ. Przykładowy protokół demonstruje oprogramowanie zdolne do automatycznego wykonywania kwantyfikacji.

Drosophila Kwantyfikacja połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ): metoda oceny morfologii i funkcji synaps

Ten protokół pokazuje, jak można użyć testu ligacji zbliżeniowej do wykrywania interakcji in situ białko-białko w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila. Dzięki tej technice wykazano, że duże dyski i Hu-li tai shao tworzą kompleks w regionie postsynaptycznym, związek wcześniej zidentyfikowany poprzez koimmunoprecypitację.

Wykrywanie kompleksów białkowo-białkowych in situ w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila za pomocą testu ligacji zbliżeniowej

Morfologia, rozmiar i lokalizacja organelli wewnątrzkomórkowych są ewolucyjnie zachowane i wydają się bezpośrednio wpływać na ich funkcję. Zrozumienie mechanizmów molekularnych leżących u podstaw tych procesów stało się ważnym celem współczesnej biologii. Tutaj pokazujemy, w jaki sposób badania te można ułatwić dzięki zastosowaniu technik ilościowych.

Dlaczego kwantyfikacja ma znaczenie: charakterystyka fenotypów w połączeniu nerwowo-mięśniowym larw Drosophila

Ten raport przedstawia nową procedurę przygotowania próbki do wizualizacji połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila. Metoda ta jest bardziej skuteczna w zapobieganiu zwijaniu się próbek w porównaniu z metodą tradycyjną i jest szczególnie przydatna w analizie ultrastrukturalnej połączenia nerwowo-mięśniowego Drosophila.

Optymalizacja procesu przygotowania próbki do transmisyjnej mikroskopii elektronowej połączeń nerwowo-mięśniowych u larw Drosophila

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół wizualizacji sieci mikrotubul w połączeniach nerwowo-mięśniowych i komórkach mięśniowych. W połączeniu z potężnymi narzędziami genetycznymi Drosophila melanogaster, protokół ten znacznie ułatwia genetyczne badania przesiewowe i analizę dynamiki mikrotubul pod kątem roli białek regulatorowych sieci mikrotubul w układzie nerwowym.

Wykorzystanie połączenia nerwowo-mięśniowego larw Drosophila i komórek mięśniowych do wizualizacji sieci mikrotubul

Poznaj technikę immunohistochemii na larwach Drosophila w celu wizualizacji białek synaptycznych w zwoju nerwowo-mięśniowym. Ta metoda pozwala badać genetyczną regulację rozwoju synaps in vivo.

Immunohistochemia NMJ larw Drosophila

Przeglądaj więcej filmów