Name: Rozwarstwienie Saccharomyces cerevisiae asci (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 57 s
Description: Naucz się technik mikromanipulacji komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae w celu analizy genetycznej mejozy i selekcji diploidalnych zygota. Metoda ta umożliwia precyzyjne rozdzielanie askusów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prace w laboratorium autora są finansowane przez Canadian Institutes of Health Research, Canada Foundation for Innovation, Natural Sciences and Engineering Research Council oraz Concordia University.

Konstrukcja szczepów diploidalnych 
Protokół otrzymywania diploidów poprzez krzyżowanie
<ol>
	<li>Początkowe szczepy należy wysiać na podłożu YPD lub, jeśli jest to konieczne, na podłożu selektywnym w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Dwa szczepy haploidalne powinny być przeciwstawnych typów macierzyńskich (tj. MATa i MATα).</li>
	<li>Za pomocą sterylnej pętli do szczepienia należy pobrać niewielką część kolonii z jednego z dwóch szczepów haploidalnych. Na nowej płytce YPD należy wykonać jeden prosty posiew w linii przez całą płytkę. Kierunek posiewu należy zaznaczyć strzałką na spodzie płytki.</li>
	<li>Procedurę tę należy powtórzyć dla drugiego szczepu na tej samej płytce YPD. Tym razem kolonię należy wysiać prostopadle do pierwszej linii, tak aby drugi posiew przecinał pierwszy. Należy zaznaczyć kierunek drugiego posiewu i określić obszar, w którym drugi posiew przecina pierwszy. W tym obszarze powstaną diploidy.</li>
	<li>Płytkę YPD należy inkubować przez noc w temperaturze 30°C.</li>
	<li>Z płytki YPD należy wykonać posiewy replikacyjne na podłoża selektywne, które umożliwiają selektywny wzrost nowo powstałych diploid.</li>
	<li>Należy pobrać pojedynczą kolonię, jeśli to możliwe, lub niewielką część smugi diploidalnej i wysiać na to samo podłoże selektywne w celu uzyskania pojedynczych kolonii.</li>
</ol>
Sporulacja i trawienie worków 
Protokół
<ol>
	<li>Wybierz pojedyncze kolonie z powyższej płytki i wykonaj niewielkie (1 cm x 1 cm) pasy na płytkach do sporulacji (SPO), a następnie inkubuj w temperaturze 30°C przez 3-7 dni w celu indukowania sporulacji.</li>
	<li>Sporulację można sprawdzić, obserwując komórki z każdego pasa pod mikroskopem świetlnym. Umieść komórki na szkiełku przedmiotowym w 5-10 μl wody, przykryj kroplę szkiełkiem nakrywkowym i poszukaj obecności woreczników. Jeśli woreczniki nie są łatwo widoczne, przenieś próbki z powrotem do inkubatora.</li>
	<li>W przypadku stwierdzenia efektywnej sporulacji w jednym z pasów, przygotuj sterylną probówkę stożkową 15 mL zawierającą 100 μL soku do tetrad.</li>
	<li>Pobierz komórki z tego pasa sporulacyjnego za pomocą sterylnej pętli szczepiącej 3 mm (komórki powinny pokrywać ¼ pętli) i umieść je w soku do tetrad. Delikatnie zakręć pętlą, aby komórki oddzieliły się od niej i wymieszały z roztworem.</li>
	<li>Pozostaw w soku do tetrad (zawierającym zymolazę) na 4-10 min (w zależności od stężenia i aktywności zymolazy oraz od konkretnego szczepu). Pozwala to na trawienie ściany komórkowej otaczającej ascospory.</li>
	<li>Zaznacz górną i dolną granicę obszaru inokulacji na płytce YPD.</li>
	<li>Opcjonalnie. Reakcję można zatrzymać, dodając 1 mL lodowatej sterylnej dH2O. Pozostaw komórki na 5 min do osadzenia. Odlej 1 mL nadsączu, a następnie lekko wymieszaj ręcznie i przechowuj w lodzie.</li>
	<li>Pobierz 5 μL strawionych komórek z kroku 5 i delikatnie nanieś krople w linii w obszarze inokulacji na wcześniej zaznaczonej płytce YPD.</li>
	<li>Używając sterylnej pętli szczepiącej 3 mm, bardzo delikatnie rozmaż krople 1-3 razy w linii, ledwo dotykając agaru.</li>
	<li>Pozostaw ciecz do wchłonięcia w agar (jeśli pominięto krok 7, to w tym momencie trawienie zewnętrznej ściany komórkowej zostanie ograniczone lub całkowicie zatrzymane). Przejdź do mikroskopu sekcyjnego.</li>
</ol>
Disekcja worków sukcesyjnych 
Protokół
Należy zauważyć, że poniższy protokół został opracowany dla mikromanipulatora Singer MSM System 200. Protokół ten można stosować z niewielkimi modyfikacjami w przypadku korzystania z manualnego mikromanipulatora, takiego jak mikromanipulator Zeiss MR.
<ol>
	<li>Ustaw ostrość na obszarze płytki, gdzie połowę pola widzenia zajmują komórki, a druga połowa jest pusta. Powoli przesuń igłę w głąb pola widzenia, tak aby dotknęła pustego obszaru. Zapewni to, że igła nie zawiera komórek z poprzedniego użycia. Kontakt igły z agarem jest widoczny jako ciemne, czarne koło, które powoli staje się ostre.</li>
	<li>Przejdź do macierzy w pozycji A1 i zrób oznaczenie, ponownie przebijając agar. Pomoże to określić orientację płytki, jeśli zostanie ona zdjęta z mikroskopu przed zakończeniem pracy.</li>
	<li>Przełącz się w tryb wyszukiwania. Zlokalizuj worek (ascus). Wybieraj preferencyjnie worki znajdujące się w obszarach, gdzie komórki są dobrze rozproszone. Unikaj obszarów z skupiskami komórek. Cztery ascosporu z jednego worka powinny być nadal ze sobą połączone. Dwie ascosporu mogą być nieco większe od dwóch pozostałych. Unikaj wyboru worków, w których jedna ascospora jest luźna i niepołączona z pozostałymi.</li>
	<li>Pobierz worek za pomocą igły. Powoli zbliż igłę do płytki. Gdy pojawi się cień mikroiigły, wyrównaj go z workiem do pobrania. Ponownie zbliż igłę, aż pojawi się czarny obrys koła (koniec igły). Dotknij tetrady tym kołem, a następnie szybko odsuń igłę. Upewnij się, że wszystkie cztery ascosporu z jednego worka przylgnęły do igły i że na mikroiigle nie zebrały się żadne dodatkowe komórki, które nie są częścią tego worka.</li>
	<li>Odsuń mikroiigłę daleko od płytki i przejdź do macierzy (dla pierwszego worka przejdź do pozycji A1). Odnotuj każdą pozycję, na którą przeniesiono worek. Umieść worek, dotykając płytki mikroiigłą i odsuwając ją, aż wszystkie cztery ascosporu oddzielą się od mikroiigły. Na tym etapie często przydatne jest delikatne opukiwanie ramienia igły lub platformy trzymającej płytkę YPD.</li>
	<li>Powtórz kroki 3-5 i umieszczaj worki w kolejnych pozycjach macierzy, aż do pobrania pożądanej liczby worków.</li>
	<li>Wróć do każdego worka i rozdziel cztery komórki, delikatnie rozsuwając je igłą, opukując platformę lub stosując obie te metody. Pobieraj komórki, zostawiając jedną w nowej pozycji w macierzy, aż każda ascospora z każdego worka zostanie rozdzielona w rzędach po cztery.</li>
	<li>Umieść płytkę YPD w inkubatorze w temperaturze 30°C na kilka dni, aby zaobserwować wzór wzrostu.</li>
	<li>Jeśli jest to konieczne, wykonaj posiew replikacyjny rozdzielonych komórek na podłoże selektywne.</li>
</ol>
Relokacja zygot 
Protokół
<ol>
	<li>Wysiać dwa szczepy haploidalne o przeciwnych typach macierzystych na odpowiednim podłożu w celu uzyskania pojedynczych kolonii.</li>
	<li>Skrzyżować oba szczepy zgodnie z powyższym opisem i pozostawić do wzrostu na 4 do 6 godzin (lub na noc, jeśli jest to konieczne).</li>
	<li>Sprawdzić obecność zygot pod mikroskopem świetlnym. Zygoty będą wyglądać jak komórki w kształcie hantla, z pączkiem lub bez niego.</li>
	<li>Pobrać komórki za pomocą pętli szczepiącej o średnicy 3mm (komórki powinny pokrywać ¼ pętli) i delikatnie przenieść do 100μL sterylnej dH2O.</li>
	<li>Zaznaczyć górną i dolną krawędź obszaru szczepienia na płytce YPD.</li>
	<li>Pobrać 5μL i delikatnie nanosić krople w linii w obszarze szczepienia na wcześniej zaznaczonej płytce YPD.</li>
	<li>Użyć pętli szczepiącej o średnicy 3mm, aby bardzo delikatnie rozprowadzić krople w linii, ledwie dotykając agaru.</li>
	<li>Pozostawić ciecz do wchłonięcia w agar. Przejść do mikroskopu sekcyjnego.</li>
	<li>Ustawić ostrość na obszarze płytki, gdzie połowa pola widzenia jest zajęta przez komórki, a druga połowa jest pusta. Powoli ustawić ostrość igły tak, aby dotykała pustego obszaru pola. Zapewni to, że igła nie zawiera komórek z poprzedniego użycia. Kontakt igły z agarem jest widoczny jako ciemny czarny krąg, który powoli staje się ostry.</li>
	<li>Przejść do macierzy w pozycji A1 i zrobić zaznaczenie, ponownie przebijając agar. Pomoże to określić orientację płytki, jeśli zostanie ona zdjęta z mikroskopu przed zakończeniem pracy.</li>
	<li>Przełączyć na tryb wyszukiwania. Zlokalizować zygotę.</li>
	<li>Pobrać zygotę za pomocą igły.</li>
	<li>Umieścić zygoty pojedynczo na macierzy.</li>
	<li>Pozostawić zygoty do wzrostu przez kilka dni.</li>
	<li>Przeprowadzić przesiew (replica plating) zygot na odpowiednie podłoże selekcyjne.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki
<img alt="Schemat przesiewania genetycznego drożdży; proces selekcji diploidów na pożywce YPD i pożywkach selektywnych." src="/files/ftp_upload/1146/1146fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rycina 1: Krzyżowanie dwóch haploidalnych szczepów o przeciwstawnych typach zapłodnienia prowadzi do powstania szczepu diploidalnego.
<img alt="Wzory wzrostu bakterii na płytce z agarem, wyniki eksperymentu przedstawiające analizę tworzenia kolonii." src="/files/ftp_upload/1146/1146fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rysunek 2: (A) Płytka YPD z wynikami krzyżowania szczepu temperaturowrażliwego (z aukstrofią leu2 ) i szczepu typu dzikiego (LEU2). Przetrawione komórki zostały wysiane w obszarze inokulum po lewej stronie, gdzie widoczny jest gęsty wzrost między dwiema czarnymi liniami. Wypreparowane aski rosną w równych odstępach w matrycy po prawej stronie. (B) Płytka z (A) została przeniesiona na płytkę SD z brakiem leucyny (drop-out). Zwróć uwagę na wzrost w stosunku 2:2 dla markera LEU2 , co wskazuje na wypreparowanie zwalidowanego ascospory. (C) Płytka z (A) została przeniesiona na płytkę YPD i inkubowana w 37°C. Zwróć uwagę na wzrost w stosunku 2:2, który dodatkowo potwierdza, że wypreparowano ascosporę.

<ol><li>Sherman, F., Hicks, J. Micromanipulation and Dissection of Asci. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSherman%2C+F+%22Guide+to+Yeast+Genetics+and+Molecular+Biology%22">Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology</a>. Guthrie, C., Fink, G. R. , Academic Press. San Diego. 21-37 (1991).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Disekcja drożdży jest użytecznym narzędziem do selekcji nowych szczepów z pożądanymi markerami. Przy określaniu teoretycznego wzorca wzrostu czterech ascospor ważne jest przeanalizowanie genotypu komórki wegetatywnej. W przypadku obecności plazmidu należy wiedzieć, czy jest on pojedynczy, czy występuje w niskiej lub wysokiej liczbie kopii, ponieważ wpływa to na to, która z ascospor otrzyma plazmid, a tym samym rzutuje na przewidywania i wnioski dotyczące manipulowanych szczepów.
Niektóre szcze...

<table><tbody><tr><td>Singer MSM System 200</td><td>Mikroskop</td><td>Singer Instruments</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>D-sorbitol</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>SOR508</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>TRS001</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>Odczynnik</td><td>Seikagaku Corporation</td><td>120493</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401</td><td></td></tr><tr><td>Pepton</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>PEP 403</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU501</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa azotowa dla drożdży (Yeast nitrogen base)</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>YNB406</td><td></td></tr><tr><td>Bio-tryptona</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>SOD002</td><td></td></tr><tr><td>Octan potasu</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>POA 301</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>AGR003</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan adeniny</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>ADS201</td><td></td></tr><tr><td>L-uracyl</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>URA 241</td><td></td></tr><tr><td>L-tryptofan</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP 100</td><td></td></tr><tr><td>L-histydyna</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>HIS 200</td><td></td></tr><tr><td>L-arginina</td><td>Odczynnik</td><td>Amresco</td><td>0877-100G</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>MET 222</td><td></td></tr><tr><td>L-tyrozyna</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>TYR 333</td><td></td></tr><tr><td>L-izoleucyna</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>ISO 910</td><td></td></tr><tr><td>L-walina</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>VAL 201</td><td></td></tr><tr><td>L-lizyna</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>LYS 101</td><td></td></tr><tr><td>L-fenyloalanina</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>PHA 302</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-glutaminowy</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>GLU 202</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>THR002</td><td></td></tr><tr><td>L-leucyna</td><td>Odczynnik</td><td>BioShop Canada</td><td>LEU 222</td><td></td></tr></tbody></table>

wypreparowanie woreczków saccharomyces cerevisiae

Dissection of Saccharomyces Cerevisiae Asci

Drożdże są niezwykle podatnym na badania systemem modelowym, wykorzystywanym do analizy wielu różnych procesów komórkowych. Powszechny szczep laboratoryjnySaccharomyces cerevisiaewystępuje w stanie haploidalnym lub diploidalnym. Możliwość łączenia alleli z dwóch haploidów oraz wprowadzania modyfikacji do genomu wymaga produkcji i sekcji worków. Produkcja worków z komórek haploidalnych rozpoczyna się od krzyżowania dwóch haploidalnych szczepów drożdży o zgodnych typach kopulacyjnych w celu uzyskania szczepu diploidalnego. Można to osiągnąć na kilka sposobów, zarówno na podłożu stałym, jak i w cieczy. Korzystne jest selekcjonowanie diploidów na podłożu, które selektywnie promuje ich wzrost w porównaniu do któregokolwiek ze szczepów haploidalnych. Następnie diploidom pozwala się na sporulację na podłożu ubogim w składniki odżywcze w celu utworzenia worków, czyli skupisk czterech haploidalnych komórek potomnych powstałych w wyniku reprodukcji meiotycznej diploida. Mieszaninę komórek wegetatywnych i worków traktuje się enzymem zymolazą, aby strawić błonę otaczającą askospory w workach. Wykorzystując mikromanipulację z użyciem mikroigły pod mikroskopem sekcyjnym, można pobrać pojedyncze worki, a następnie rozdzielić i przenieść cztery askospory. Zwysekcjonowane worki hoduje się przez kilka dni i testuje pod kątem interesujących markerów lub alleli poprzez metodę replica plating na odpowiednich podłożach selekcyjnych.

Mikromanipulacja komórkami drożdży jest niezbędna do analizy genetycznej mejozy lub do selekcji zygot diploidalnych. Mikromanipulacje te przeprowadza się przy użyciu mikroigły mikroskopu sekcyjnego. Mikroigła służy do przenoszenia komórek i jest sterowana przez mikromanipulator, który może być dostępny w różnych stopniach automatyzacji.

Wypreparowanie woreczków Saccharomyces Cerevisiae

Drożdże są niezwykle podatnym na manipulacje systemem modelowym, wykorzystywanym do badania wielu różnych procesów komórkowych. Powszechny szczep laboratoryjny Saccharomyces cerevisiae ...

Procedura ta rozpoczyna się od krzyżowania dwóch genetycznie różnych komórek drożdży haploidalnych. Diploidy są wyselekcjonowane poprzez posiewy replikacyjne na podłożu, które umożliwia wzrost wyłącznie diploidom. Następnie diploidy przenosi się na płytki do sporulacji w celu utworzenia worków.Woreczki są dyssekowane, a uzyskane haploidy umieszczane w określonych miejscach na płytce. Gdy powstałe haploidy urosną do postaci widocznej kolonii, płytka jest replikowana na wybrane podłoże w celu zidentyfikowania genotypu poszczególnych komórek. Cześć, nazywam się Adrian Morris.Jestem Audrey Mahe. Pochodzimy z laboratorium dr. Michaela Satchera z Uniwersytetu Concordia w Montrealu. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę sekcji drożdży, które są zazwyczaj określane jako ra.Stosuj tę procedurę w naszym laboratorium w celu instruowania szczepów haplo D o nowych genotypach oraz badania efektów łączenia dwóch mutacji. Zacznijmy zatem. Aby stworzyć szczep diploidalny, krzyżuje się dwa szczepy haplo o przeciwstawnych typach strzelkowania. Szczepy haplo są najpierw wysiewane na odpowiednie podłoże, w naszym przypadku YPD, aby uzyskać pojedyncze kolonie; za pomocą sterylnej pętli szczepiającej pobierz niewielką część kolonii jednego z dwóch szczepów haplo na nową płytkę YPD i wykonaj posiew.Po wykonaniu linii prostej na płytce, zaznacz kierunek posiewu strzałką na spodzie płytki. Następnie pobierz niewielką część kolonii drugiego szczepu haplo z tej samej płytki YPD. Wykonaj posiew kolonii prostopadle do pierwszego szczepu, przecinając pierwszą linię drugim znakiem wskazującym kierunek drugiego posiewu.Należy zwrócić uwagę na obszar, w którym druga kreska przecina pierwszą. To właśnie w tym miejscu powstaną diploidy.Inkubować płytkę YPD w temperaturze 30 stopni Celsjusza przez noc. Po nocnej inkubacji przenieść metodą replica z płytki YPD na podłoże selekcyjne, które umożliwi selektywny wzrost nowo powstałych diploidów. Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza.Po wyrośnięciu diploidów na płytce, w możliwości wyizoluj pojedynczą kolonię lub niewielką część smug diploidów i wykonaj posiew smugowy na tym samym podłożu selektywnym w celu uzyskania pojedynczych kolonii. Po otrzymaniu szczepu diploidalnego, wyizoluj pojedyncze kolonie i wykonaj małe plamki na płytkach do sporulacji. Inkubuj w temperaturze 30 °C przez trzy do siedmiu dni do momentu sporulacji.Aby sprawdzić sporulację, należy obejrzeć komórki z każdej plamki pod mikroskopem świetlnym. Umieść komórki na szkiełku przedmiotowym w 5 do 10 µL wody.Połóż szkiełko nakrywkowe na kropli i sprawdź, czy obecne są worki. Jeśli ich nie ma lub są trudne do znalezienia, przenieś płytkę do inkubatora. W przypadku wystąpienia skutecznej sporulacji w jednej z plamek, przygotuj sterylną probówkę stożkową o pojemności 15 ml z 100 µl pożywki tetra juice.Pobierz komórki z tego obszaru sporulacji za pomocą sterylnej pętli szczepiącej o średnicy 3 mm i umieść je w soku do tetrad. Delikatnie zakręć pętlą, aby komórki oddzieliły się od niej i wymieszały z roztworem. Pozostaw komórki w soku do tetrad na okres od 4 do 10 minut.Pozwala to na trawienie ściany komórkowej otaczającej zarodniki ASCO. Aby przygotować płytkę do wycinania worków, należy zaznaczyć górną i dolną granicę obszaru inokulacji na płytce YPD. Po dostatecznym strawieniu komórek, należy pobrać 5 µL strawionych komórek i za pomocą sterylnej pętli do szczepienia o średnicy 3 mm delikatnie nanieść krople w linii w zaznaczonym obszarze inokulacji na płytce YPD.Bardzo delikatnie rozprowadź krople od jednej do trzech razy wzdłuż, ledwo dotykając świdra. Pozostaw ciecz do wchłonięcia przez świder. Teraz można rozpocząć sekcję woreczników.Aby rozpocząć sekcję worków, należy umieścić płytkę sekcyjną pod mikroskopem do mikromanipulacji singer MSM system 200. Ustawić ostrość na obszarze płytki, w którym połowę pola widzenia zajmują komórki, a druga połowa jest pusta. Powoli ustawić ostrość na igle w taki sposób, aby dotykała ona pustego obszaru pola widzenia.Kontakt igły z agarem jest widoczny jako ciemnoczarne koło, które powoli staje się wyraźne. Po zetknięciu igły z agarem, należy ją lekko wycofać i sprawdzić, czy w miejscu styku nie osadziły się żadne komórki. Pozwala to upewnić się, że igła nie zawiera komórek z poprzedniego użycia.Przejdź do macierzy w pozycji A1 i zaznacz ją, przebijając świdrem. Ponownie, ma to pomóc w określeniu orientacji płytki. Należy ją zdjąć po zakończeniu sekcji.Przełącz do trybu wyszukiwania. Zlokalizuj worek. Cztery zarodniki z jednego WORKA powinny być nadal ze sobą połączone.Dwie z zarodników w worku mogą być nieco większe od pozostałych dwóch. Należy unikać pobierania worków, w których jeden zarodnik jest luźny i niepołączony z pozostałymi zarodnikami w worku. Aby pobrać worek, powoli zbliż igłę do płytki.Gdy pojawi się cień mikroiigły, ustaw go w linii z askusem, który ma zostać pobrany. Przesuwaj igłę, aż pojawi się czarny obrys koła. Dotknij tetradą tego koła, a następnie szybko odsuń igłę.Upewnij się, że wszystkie cztery askospory z askusa przywarły do igły i że mikroirigłą nie pobrano żadnych dodatkowych komórek spoza tego askusa. Po pobraniu askusa za pomocą mikroirigły, odsuń ją daleko od płytki i przejdź do matrycy. W przypadku pierwszego askusa przejdź do pozycji a1.Umieść ascusi, dotykając płytki mikroiigłą i odsuwając ją, aż wszystkie cztery przetrwalniki oddzielą się od mikroiigły; na tym etapie często pomocne jest delikatne opukanie ramienia igły lub platformy utrzymującej płytkę YPD.Kontynuuj lokalizowanie, pobieranie i umieszczanie worków w kolejnych pozycjach na matrycy, aż do uzyskania pożądanej liczby worków. Odnotowuj każdą pozycję, w której przeniesiono worki. Po pobraniu odpowiedniej liczby worków, wróć do każdego z nich i rozdziel cztery komórki, delikatnie rozdzielając je igłą, lekko stukając w platformę lub stosując obie te metody jednocześnie.Pobrać komórki, zostawiając jedną na miejscu. Przenieść pozostałe. Przenieść E do nowej pozycji w matrycy i powtarzać czynność, aż każda zostanie przeniesiona.APO w każdym worku zostaje rozdzielone na rzędy po cztery. Jedna dyssekcja worków została zakończona. Umieść płytkę z podłożem YPD w inkubatorze w temperaturze 30 °C na kilka dni, aby zaobserwować wzór wzrostu.Gdy wypreparowane worki przetrwalnikowe urosną, należy przenieść je metodą replica plating na podłoże selektywne. W razie potrzeby jest to płytka, na którą wykonano replica plating, a zarówno oryginalna płytka z dyssekcją, jak i płytka selektywna inkubowały się przez noc. Wyniki widoczne na płytce selektywnej muszą zostać ocenione, a odpowiednia komórka haploidalna zidentyfikowana i wybrana.W przypadkach, gdy diploidy nie można zidentyfikować na płytkach selekcyjnych, należy ręcznie wyselekcjonować sparowane haploidy, zwane zygotami, które są łatwo rozpoznawalne we wczesnym stadium po procesie kojarzenia. Procedura przygotowania komórek haploidalnych oraz kojarzenia jest identyczna z opisaną wcześniej, z wyjątkiem tego, że obszar, w którym powinna znajdować się diploida, bada się po krótszym czasie inkubacji w temperaturze 30 °C. Ustaliliśmy, że czas od czterech do sześciu godzin jest dobrym punktem wyjścia, jednak ostateczny czas inkubacji powinien zostać określony empirycznie.Należy sprawdzić obecność zygot pod mikroskopem świetlnym; zygoty będą widoczne jako komórki w kształcie hantla, z pączkiem lub bez niego. Komórki należy pobrać za pomocą pętli szczepiącej o średnicy 3 mm i delikatnie umieścić w 100 µL sterylnej wody. Po przeniesieniu komórek na wcześniej oznakowaną płytkę YPD, należy użyć pętli szczepiącej o średnicy 3 mm, aby bardzo delikatnie rozprzestrzenić krople w linii, ledwie dotykając agaru. Należy odczekać, aż ciecz zostanie wchłonięta przez agar.Przejdź do mikroskopu stereoskopowego. Ustaw ostrość na obszar płytki, w którym połowę pola widzenia zajmują komórki, a druga połowa jest pusta. Powoli ustaw ostrość igły tak, aby dotykała ona pustego obszaru pola widzenia.Jak pokazano wcześniej. Należy upewnić się, że igła nie zawiera komórek z poprzedniego użycia. Przejdź do macierzy w pozycji A1 i wykonaj oznaczenie, przebijając świder.Ponownie, aby pomóc w określeniu orientacji płytki. Przełącz na tryb wyszukiwania i zlokalizuj zygotę. Pobierz zygotę za pomocą igły.Umieść zygoty pojedynczo na matrycy. Pozostaw zygoty do wzrostu na kilka dni. Przenieś komórki diploidalne metodą patchingu na płytki do sporulacji i postępuj zgodnie z opisem w części trzeciej.Krzyżowanie dwóch szczepów haploidalnych o przeciwnych typach macierzyńskich prowadzi do powstania szczepu diploidalnego. Niniejsza płytka YPD przedstawia wyniki krzyżowania szczepu wrażliwego na temperaturę z atrofią lu two ox oraz szczepu typu dzikiego. Szczepy trawione zostały wysiane w regionie inokulum po lewej stronie, gdzie widoczny jest gęsty wzrost pomiędzy dwiema czarnymi liniami.Przecięte aski rosną w równych odstępach w matrycy po prawej stronie. Po przeniesieniu zawartości tej płytki YPD na płytkę SD z brakiem leucyny, obserwujemy wzrost w stosunku dwa do dwóch dla markera LU dwa, co wskazuje na prawidłowe wypreparowanie zarodnika aska. Oryginalna płytka YPD została również przeniesiona na inną płytkę YPD i inkubowana w wyższej temperaturze 37 °C, gdzie wzrost w stosunku dwa do dwóch dodatkowo potwierdza, że wypreparowano zarodnik aska.Właśnie pokazaliśmy, jak stworzyć dwie hybrydy komórkowe i wyselekcjonować diploidy, opierając się na dwóch różnych metodach: jednej wykorzystującej markery troficzne i drugiej opartej na morfologii komórek. Stosując tę procedurę, bardzo ważne jest, aby wyselekcjonować nowo utworzone hybrydy komórkowe w drodze tetradysekcji, w której markery troficzne są reprezentowane zgodnie z przewidywaniami.Ważne jest również, aby pamiętać o tym, by nie doprowadzić do nadmiernego ani niewystarczającego trawienia. Tetra spory w workach nie utrzymały się w tetradach, co zdarza się przy nadmiernym trawieniu, natomiast w przypadku niewystarczającego trawienia tetrady są trudne do rozdzielenia. To wszystko.Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.

dissection-of-saccharomyces-cerevisiae-asci

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Sekcja asków Saccharomyces Cerevisiae

Opisujemy to test na przyczepność drożdży i inwazji agar jako miara zróżnicowania inwazyjne i pseudohyphal. Ten prosty test może być wykorzystane do oceny inwazyjnym fenotypem różnych mutantów, jak również wpływu na środowisko pamięci i szlaków sygnałowych różnicowania drożdży.

Test dla Przyczepność i Invasion Agar w S. cerevisiae

Do badania procesów rozwojowych z askospory w Gibberella zeae, procedury zbierania w sterylnych warunkach jest filmowany w celu wygenerowania najwyższy poziom informacji dla opisu protokołu. Powinno to ułatwić powtarzalność eksperymentu, kluczowym aspektem, gdy pełne testy ekspresji genomu profil są realizowane.

Gibberella zeae Produkcja Ascospore i Kolekcja dla Eksperymenty mikromacierzy.

Metoda zatapiania kolonii drożdży umożliwiająca wykonywanie przekrojów do mikroskopii świetlnej i elektronowej. Protokół ten pozwala na określenie rozmieszczenia komórek zsporulowanych i komórek pseudohifowych w obrębie kolonii, stanowiąc nowe narzędzie do zrozumienia organizacji typów komórek w obrębie społeczności grzybowej.

Metoda zatapiania kolonii drożdży

W niniejszym protokole ekspresja genów w drożdżach (Saccharomyces cerevisiae) ulega zmianie po narażeniu na stres oksydacyjny wywołany dodaniem nadtlenku wodoru (H2O2), który jest środkiem utleniającym.

Analiza mikromacierzy dla Saccharomyces cerevisiae

Krzyżowania seksualne i izolacja potomstwa rekombinowanego są ważnymi narzędziami badawczymi w przypadku grzyba nitkowatego Fusarium graminearum. Przedstawiono techniki niezbędne do pomyślnego przeprowadzenia tych procesów.

Rozwój płciowy i wyrzut ascospor u Fusarium graminearum

Przedstawiamy protokół zamrażania i kriosekcji społeczności drożdży w celu obserwacji wewnętrznych wzorców komórek fluorescencyjnych.  Metoda opiera się na wiązaniu metanolu i osadzaniu OCT w celu zachowania przestrzennego rozmieszczenia komórek bez inaktywacji białek fluorescencyjnych w społeczności.

Kriosekcja zbiorowisk drożdży w celu zbadania wzorców fluorescencji

Przedstawiono metodę rozprzestrzeniania się chromosomów powierzchniowych z pączkujących drożdży. Metoda ta wywodzi się z metody opisanej wcześniej przez Loidla i Kleina. Ponadto demonstrujemy procedurę barwienia immunologicznego chromosomów rozsianych.

Rozprzestrzenianie się powierzchniowe i barwienie immunologiczne chromosomów drożdży

Tutaj prezentujemy szczegółowe protokoły przetwarzania dla obrazowania delikatnych próbek tkanek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). Opisano trzy różne metody przetwarzania, a mianowicie suszenie chemiczne heksametylu disilazana (HMDS), proste suszenie powietrzem i suszenie w punkcie krytycznym dla przygotowania sztywnych skorupek jaj, zarodków we wczesnych stadiach rozwojowych i kultur grzybów.

Przetwarzanie zarodków, skorupek jaj i kultur grzybów do skaningowej mikroskopii elektronowej

Prezentujemy protokół przygotowania lameli zamrożonych próbek biologicznych metodą kriogenicznej mikroobróbki wiązki jonów do wysokorozdzielczych badań strukturalnych makrocząsteczek in situ za pomocą krioelektronowej tomografii. Przedstawiony protokół zawiera wytyczne do przygotowania wysokiej jakości blaszek o wysokiej odtwarzalności do charakterystyki strukturalnej makrocząsteczek wewnątrz Saccharomyces cerevisiae.

Przygotowanie i mikroobróbka Cryo-FIB Saccharomyces cerevisiae do krioelektronowej tomografii

To badanie opisuje, jak rozciąć worek endolimfatyczny z wewnętrznego ucha myszy w różnym wieku. Wynik podobnej sekcji pokazano w mysim modelu powiększenia worka endolimfatycznego Slc26a4-zero. Transgeniczna mysz z fluorescencyjnym reporterem wyrażonym w woreczku endolimficznym jest prezentowana jako model do łatwej wizualizacji worka endolimfatycznego i narzędzie edukacyjne.

Wypreparowanie worka endolimfatycznego od myszy

Ten protokół jest skuteczną, szybką metodą hodowli drożdży i pleśni Aspergillus fumigatus z dużych zestawów próbek gleby w ciągu zaledwie 7 dni. Metody te można łatwo modyfikować w celu dostosowania do różnych pożywek inkubacyjnych i temperatur w zależności od potrzeb eksperymentów.

Izolacja drożdży i pleśni nadających się do hodowli z gleb w celu zbadania struktury populacji grzybów

Naucz się technik mikromanipulacji komórek drożdży Saccharomyces cerevisiae w celu analizy genetycznej mejozy i selekcji diploidalnych zygota. Metoda ta umożliwia precyzyjne rozdzielanie askusów.

Wypreparowanie woreczków Saccharomyces Cerevisiae

Przeglądaj więcej filmów