Procedura transplantacji nerki u myszy

Procedura przeszczepu nerki u myszy rozpoczyna się od pobrania narządu od dawcy, podczas którego lewa nerka zostaje usunięta z myszy dawcy i przechowywana w lodzie. Z myszy biorcy usuwa się prawą nerkę, aby zrobić miejsce dla nerki dawcy. Następnie nerka dawcy zostaje wyjęta z lodu i przeszczepiona do organizmu myszy biorcy.

Myszy pozostawia się na cztery dni w celu rekonwalescencji przed usunięciem pozostałej natywnej nerki. Po siedmiu dniach monitoruje się poziom kreatyniny za pomocą przenośnego analizatora klinicznego i-STAT, aby ocenić funkcję przeszczepu. Witam, nazywam się Sarah Heimer i pochodzę z laboratorium dr. Grega Hadleya oraz z Katedry Chirurgii Transplantacyjnej na Uniwersytecie stanowym Ohio.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę transplantacji nerki u myszy. Operację transplantacji nerki, którą Państwo zobaczą, przeprowadzi nasz ekspert rezydent w dziedzinie neurochirurgii, Jing Wing. Prosimy o wykorzystanie tej procedury w naszym laboratorium do badania zdarzeń immunologicznych związanych z odrzuceniem przeszczepu, a także strategii zapobiegania temu procesowi.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć pobieranie narządu od dawcy, wykonuje się ucisk palcami, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone. Pracując w polu jałowym i używając wysterylizowanych narzędzi, należy wykonać cięcie w linii środkowej znieczurzonej myszy od mostka do łonka i odsłonić lewą nerkę, przesuwając jelita bocznie na prawą stronę, aby przeprowadzić perfuzję nerki dawcy. Należy zawiązać szwy jedwabne 4-0 wokół aorty oraz żyły głównej dolnej poniżej i powyżej tętnicy i żyły nerkowej.

Powoli perfundowano in situ zimnym, heparynowanym roztworem Ringera z mleczanem poprzez aortę podnerkową. Izolowano lewą nerkę poprzez podwiązanie i przecięcie naczyń nadnerczowych, jądrzowych oraz kilku gałęzi lędźwiowych za pomocą jedwabnej nici 8-0. Następnie zmobilizowano miejsce połączenia aorty i żyły głównej dolnej z lewą tętnicą i żyłą nerkową, zawiązując cztery jedwabne nici 8-0 wokół aorty i żyły głównej dolnej poniżej i powyżej tętnicy oraz żyły nerkowej.

Aby zminimalizować krwawienie, w pierwszej kolejności podwiąż aortę poniżej naczyń nerkowych. Następnie wypreparuj lewy moczowód, uwalniając go od wnęki nerki aż do pęcherza moczowego. Odsłoń miejsce połączenia moczowodu z pęcherzem, stosując retrakcję kopuły pęcherza za pomocą haczyka.

Upewniając się, że nie uszkodzono prawego moczowodu, wycina się niewielki eliptyczny fragment pęcherza zawierający miejsce połączenia lewego moczowodu z pęcherzem. Fragment ten zostanie wykorzystany do rekonstrukcji układu moczowego poprzez anastomozę pęcherz-pęcherz. Następnie należy podwiązać aortę powyżej tętnicy i żyły nerkowej.

Powoli przepłukano raft in situ zimnym roztworem mleczanu Ringera z heparyną poprzez aortę podnerkową. Aortę przecięto ukośnie około dwóch milimetrów poniżej tętnicy nerkowej. Na koniec usunięto nerkę wraz z unaczynieniem i moczowodem przytwierdzonym do płata pęcherza w bloku.

Nerkę należy przechowywać w roztworze mleczanu Ringera w lodzie do momentu przeszczepienia jej biorcy; mysz dawcę należy uśmiercić poprzez zwichnięcie stawów szyjnych w znieczuleniu. Jak wykazano wcześniej, przed rozpoczęciem transplantacji u biorcy należy wykonać uszczypnięcie, aby upewnić się, że zwierzę jest w pełni znieczulone. Aby rozpocząć operację, należy wykonać cięcie w linii pośrodkowej, przykryć jelita mokrą gazą i ostrożnie odsunąć je na lewą stronę.

Aby pomyślnie przeprowadzić ten przeszczep nerki, należy wykonać anastomozę między mankietem aorty dawcy a aortą biorcy. Żyłę nerkową dawcy należy połączyć z żyłą główną dolną biorcy, a łatę pęcherza dawcy z ligaturą pęcherza biorcy. Prawą tętnicę i żyłę nerkową mocznika.

Po podwiązaniu gałęzi lędźwiowych usunąć nerkę. Ostrożnie wyizolować i zacisnąć kleszczykami przeklemowymi aortę podnerkową oraz żyłę główną dolną za pomocą dwóch czteromilimetrowych kleszczyków mikronaczyniowych. Przeciągnąć szew nylonowy 10-0 przez pełną grubość aorty i odciągnąć, aby wykonać eliptyczną aortotomię pojedynczym cięciem o długości około jednej piątej średnicy naczynia.

Następnie wykonaj podłużną wenotomię, przebijając żyłę główną dolną igłą 30G i odpowiednio rozszerzając otwór za pomocą mikronożyczek. Przepłucz aortę oraz żyłę główną dolną solą fizjologiczną z heparyną, aby usunąć krew lub skrzepy z wnętrza naczyń. Wyjmij nerkę donora z lodu i umieść ją w prawym boku myszy.

Umieść dwa szwy stabilizujące w proksymalnym i dystalnym wierzchołku aortotomii biorcy oraz na mankiecie aorty dawcy. Wykonaj anastomozę koniec-bok między mankietem aorty dawcy a ścianą przednią aortotomii biorcy, używając dwóch do trzech ciągłych szwów nylonowych 10-0 na zewnętrznej stronie aorty. Następnie obróć przeszczep nerki dawcy w stronę lewego boku biorcy.

Powtórz poprzednią procedurę pomiędzy mankietem aorty dawcy a tylną ścianą aorty biorcy. Ważne jest, aby anastomoza zarówno żyły, jak i tętnicy została zakończona w ciągu 20 minut. Podczas anastomozy przeszczep należy również kilkakrotnie przemyć zimową solą fizjologiczną.

Wykonaj anastomozę koniec-bok między żyłą nerkową dawcy a tylną ścianą żyły głównej dolnej biorcy, używając od czterech do pięciu szwów ciągłych z nylonu 10 wewnątrz żyły głównej dolnej. Zamknij przednią ścianę żyły głównej dolnej oraz żyłę nerkową dawcy za pomocą od czterech do pięciu szwów ciągłych na zewnątrz żyły głównej dolnej. Kolejnym krokiem jest otwarcie kopuły pęcherza moczowego biorcy.

Zatrzymaj krwawienie za pomocą kauteryzacji. Po zakończeniu preparacji wykonaj niewielkie nacięcie na kopule i załóż dwa szwy stabilizujące z nylonu 10-0, aby przeprowadzić anastomozę małego płata pęcherza dawcy z kopułą pęcherza biorcy; zaszyj każdą stronę anastomozy za pomocą od 8 do 10 szwów ciągłych. Na koniec zamknij jamę brzuszną w dwóch warstwach, stosując ciągłe szwy z jałowego, syntetycznego, wchłanialnego materiału Vicryl 4-0.

Opieka pooperacyjna rozpoczyna się od podania pojedynczej iniekcji domięśniowej penicyliny. Biorca przeszczepu otrzymuje również buprenorfinę w dawce 0,05 mg/kg domięśniowo w dniu zerowym i pierwszym po operacji w celu uśmierzenia bólu, a także ma zapewniony stały dostęp do wody zawierającej sulfametoksazol i trimetoprim. Przez pierwsze 24 godziny po operacji myszy są utrzymywane w inkubatorze z kontrolowaną temperaturą.

Szwy skórne usuwa się dwa tygodnie po operacji. Usunięcie pozostałej natywnej nerki jest niezbędne, aby możliwe było monitorowanie spadku funkcji przeszczepionej nerki poprzez pomiary poziomu kreatyniny w surowicy. Zabieg ten wykonuje się zazwyczaj od czterech do siedmiu dni po wstępnym przeszczepieniu nerki dawcy i obejmuje główne etapy stosowane podczas wycinania nerki z myszy dawcy.

Znieczulenie izofluranem jest stosowane w celu sedacji zwierzęcia gospodarza, aby umożliwić pobranie próbek krwi. Ilościowe oznaczanie poziomu kreatyniny w krwi pełnej pobranej z zatoki zaocznej służy jako wskaźnik do oceny funkcji przeszczepu i jest wykonywane przy użyciu przenośnego analizatora klinicznego i-STAT. Jednostki konwencjonalne są przeliczane na jednostki SI poprzez pomnożenie wartości w jednostkach konwencjonalnych przez 88,4.

Stężenie kreatyniny wyrażone jest w mikromolach na litr. Zwierzęta zazwyczaj dochodzą do siebie od dwóch do trzech godzin po operacji i wykazują typowe zachowanie myszy po usunięciu pozostałej natywnej nerki. Przeżywalność zwierzęcia zależy od funkcji przeszczepionej nerki, którą można oceniać poprzez codzienne badania ogólnego stanu zdrowia zwierzęcia oraz poziomu kreatyniny.

Pomiar krwi pełnej z wykorzystaniem przenośnego analizatora klinicznego i-STAT w celu uzyskania wartości referencyjnych. Normalny poziom kreatyniny u myszy bez przeszczepu wynosi około 20 micromolar. O dysfunkcji przeszczepu nerki mówi się w przypadku, gdy u myszy występują objawy choroby, a poziom kreatyniny jest podwyższony i oscyluje wokół 100 micromolar.

Przedstawiliśmy właśnie procedurę przeszczepu nerki u myszy. Choć zabieg ten jest wymagający pod względem technicznym, nasze laboratorium odnosi w jego przeprowadzaniu duże sukcesy. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.