Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Larwy rozcinamy, chwytając ich końce tylny i przedni, a następnie rozsuwając pęsety w przeciwnych kierunkach. Nadmiar tkanki usuwamy za pomocą nożyczek ultraprecyzyjnych. W ten sposób odsłoniemy dwie półkule mózgu larwy oraz krążki wyobrażeniowe oczu.

Brzuszny sznur nerwowy i haki gębowe. Larwalny kompleks mózgu i oczu zostaje przeniesiony do komory hodowlanej. Oddzielamy płat mózgu od szypułki nerwu wzrokowego, aby zwizualizować migrację komórek glejowych wewnątrz tarczki imaginalnej oka typu dzikiego.

Aby zaobserwować zatrzymane komórki glejowe w szypule nerwu wzrokowego u mutanta, pozostawiamy płat mózgu przytwierdzony do szypuły. Jestem Patrick Cafferty z laboratorium Vanessy Als w Katedrze Zoologii na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Cześć, jestem Rin.

Dzisiaj przedstawimy procedurę wizualizacji migrujących komórek glejowych w rozwijającym się oku Drosophila. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania rozwoju komórek glejowych. Zapraszamy do rozpoczęcia.

Na tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu muchy są kojone w celu uzyskania larw wykazujących ekspresję GFP pod kontrolą promotora specyficznego dla gleju. Niniejszy eksperyment obejmuje wizualizację GFP z sekwencją lokalizacji jądrowej eksprymowanego w komórkach glejowych. Korzystając z promotora o odwróconej polarności, należy przygotować okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm z co najmniej jednodniowym wyprzedzeniem, mocząc je przez 10 minut w 1% roztworze poli-L-lizyny, a następnie pozostawiając do wyschnięcia na powietrzu przez noc w dniu poprzedzającym eksperyment.

W dniu przeprowadzenia eksperymentu oczyść komorę hodowlaną z magnesami w układzie łańcuchowym, mocząc jej elementy przez noc w 70% etanolu. Przygotuj pożywkę hodowlaną, stosując techniki aseptyczne. Do 10 mililitrów pożywki dla owadów Schneidera dodaj płodową surowicę bydlęcą, roztwór penicyliny i streptomycyny oraz insulinę.

Pozostaw czystą komorę hodowlaną z magnesami do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie usuń resztki etanolu, płucząc ją przygotowanym podłożem hodowlanym. Po zakończeniu tych przygotowań można przystąpić do sekcji kompleksu oko-mózg Drosophila. Aby rozpocząć tę procedurę, wybierz larwę trzeciego stadium w fazie wędrowania z brzegu fiolki z muchami i umieść ją w kropli schłodzonego podłoża hodowlanego na szalce Petriego pozostawionej na lodzie na kilka minut w celu schłodzenia.

Zaleca się spowolnienie perystaltycznych skurczów ciała larw w celu ułatwienia sekcji. Następnie umieść schłodzone larwy w kropli pożywki na płytce powlekanej agarosem pod mikroskopem sekcyjnym; za pomocą precyzyjnych pęset Dumont mocno chwyć larwę. Chwyć ją mniej więcej w jednej trzeciej odległości od końca tylnego, a następnie poczekaj, aż larwa wysunie haki gębowe z końca przedniego. Gdy haki gębowe będą w pełni wysunięte, chwyć je drugą pęsetą.

Aby przeprowadzić sekcję larw, powoli rozsuń dwie pary pęset w przeciwnych kierunkach. Kompleks około-mózgowym, wraz z gruczołami ślinowymi, ciałkami tłuszczowymi i tkanką imaginalną, oddzieli się od ciała larwy. Nie odciągaj haczyków gębowych zbyt gwałtownie, aby nie oderwały się od kompleksu iBrain.

Odciąć gruczoły ślinowe, ciała tłuszczowe i dyski imaginalne. Za pomocą ultraprecyzyjnych nożyczek chirurgicznych oddzielić dwie półkule mózgu oraz dyski oczne, pozostawiając je połączonymi z brzusznym sznurem nerwowym i haczykami gębowymi. Następnie umieścić szkiełko cover slip o średnicy 18 milimetrów na lamellce szklanej, tak aby jeden brzeg szkiełka wystawał poza krawędź lamellki. Aby ułatwić późniejsze podniesienie szkiełka, nanieść na nie kroplę pożywki hodowlanej.

Chwyć haki gębowe pęsetą i przenieś kompleks oka i mózgu (iBrain) do pożywki hodowlanej na szkiełku nakrywce. Po przeniesieniu kompleksu oka i mózgu na szkiełko nakrywkowe, użyj precyzyjnych nożyczek do sekcji, aby odciąć haki gębowe od kompleksu oka i mózgu.

Usunięcie haczyków gębowych jest istotne dla obrazowania na żywo, ponieważ haczyki gębowe będą nadal kurczyć się w medium hodowlanym, powodując ruch tkanki podczas mikroskopii. Aby zwizualizować GL wewnątrz szypułki optycznej, pozostaw mózg, szypułkę optyczną i tarczkę wyobraźnię oka nienaruszone. Aby zwizualizować migrację gleju w obrębie tarczki wyobraźniej oka, ostrożnie przetnij szypułkę optyczną — cienką tkankę łączącą mózg z tarczką oka — a następnie odsuń lub usuń mózg.

Na koniec podnieś szkiełko nakrywką za pomocą pęsety i obrysuj markerem permanentnym okrąg pod szkiełkiem wokół interesującej tkanki. Okrąg ten pomoże w późniejszym zlokalizowaniu tkanki podczas badania mikroskopowego. Teraz tarcza imaginalna oka jest gotowa do zamontowania w magnetycznej komorze hodowlanej.

Aby zamocować tarczkę wyobrażeniową oka w magnetycznej komorze hodowlanej, należy za pomocą pęsety chwycić zwisający brzeg szkiełka nakrywki i przenieść je na płytkę denną magnetycznej komory łańcuchowej, nie naruszając tkanki w kulturze. Następnie należy umieścić silikonowy pierścień O-ring na głównym korpusie komory łańcuchowej. Powoli zainstalować główny korpus na płytce dennej.

Dodaj pożywkę do komory. Nie dodawaj pożywki zbyt szybko, aby nie zaburzyć tkanki i umożliwić wymianę gazową pod przykryciem. Nie napełniaj komory całkowicie, a następnie delikatnie nałóż niewidoczną pokrywę na górę komory z linią łańcuchową.

Aby zwizualizować migrujące komórki glejowe, należy umieścić komorę hodowlaną na stoliku mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego. Przy małym powiększeniu należy zlokalizować próbkę, wykorzystując okrąg na szkiełku nakrywkowym jako punkt odniesienia. Następnie należy ustawić ostrość na próbce, używając obiektywu 40x.

Należy odczekać, aż tkanka osiądzie, a następnie wykonywać zdjęcia tarczki oka lub szypuły nerwu wzrokowego co 10 do 15 minut przez trzy do czterech godzin, jeśli procedura została przeprowadzona prawidłowo. Protokół ten pozwoli na uzyskanie serii obrazów komórek glejowych znakowanych GFP, migrujących z szypuły nerwu wzrokowego do tarczki imaginalnej oka. O ile obrazowanie na żywo przez okres 60 minut było wystarczające do zaobserwowania zmian w położeniu jąder komórek glejowych w tarczce imaginalnej oka typu dzikiego, o tyle jądra komórek glejowych u mutantów z genem niezbędnym do migracji komórek glejowych całkowicie nie opuściły szypuły nerwu wzrokowego.

Hodowaliśmy kompleksy oko-mózg przez okresy trwające do 240 minut, zanim zaobserwowano pogorszenie stanu hodowanej tkanki. Po upływie 240 minut zaczynamy dostrzegać komórki GFP-dodatnie w pożywce hodowlanej otaczającej hodowane kompleksy oko-mózg. Ponadto GFP gromadzi się w rozproszonych punktach w całej tkance, co sugeruje utratę integralności tkankowej.

Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak hodować krążki imaginalne w celu badania migracji komórek glejowych. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.