Name: Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w dysku imaginalnym oka Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę obrazowania na żywo migracji komórek glejowych w dysku imaginalnym oka Drosophila. Technika GFP umożliwia wizualizację dynamiki komórek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Patrick Cafferty otrzymuje wsparcie w ramach stypendium podoktorskiego przyznanego przez Multiple Sclerosis Society of Canada.

Część 1: Przygotowanie przed eksperymentem.
<ol>
	<li>Na tydzień przed badaniem należy skrzyżować muchy w celu uzyskania larw wykazujących ekspresję GFP pod kontrolą promotora specyficznego dla gleju. W naszym doświadczeniu wizualizowano GFP z sekwencją lokalizacji jądrowej eksprymowaną w komórkach glejowych przy użyciu promotora reversed polarity (repo) (3, 4).</li>
	<li>Przykrywki należy przygotować co najmniej jeden dzień wcześniej, namaczając okrągłe przykrywki o średnicy 18 mm przez 10 minut w 1% roztworze poli-L-lizyny, a następnie pozostawiając do wyschnięcia na powietrzu przez noc.</li>
	<li>W dniu poprzedzającym badanie należy oczyścić magnetyczną komorę hodowlaną Chamlide, namaczając jej elementy przez noc w 70% etanolu.</li>
	<li>W dniu badania należy przygotować pożywkę hodowlaną, dodając do 10 ml pożywki dla owadów Schneidera serum płodowe cieląt, roztwór penicyliny i streptomycyny oraz insulinę, stosując technikę aseptyczną. Stężenia robocze to: 1X serum płodowe cieląt; 100U/ml penicyliny; 0.1mg/ml streptomycyny oraz 0.2 mg/ml insuliny w pożywce dla owadów Schneidera (zmodyfikowano na podstawie (5)).</li>
	<li>Należy pozostawić komorę hodowlaną do wyschnięcia na powietrzu w dygestorium do hodowli komórkowych. Pozostałości etanolu z komory hodowlanej należy usunąć, płucząc ją przygotowaną pożywką hodowlaną.</li>
</ol>
Część 2: Disekcja kompleksu oko-mózg Drosophila.
<ol>
	<li>Wybierz larwę wędrującą w trzecim stadium z boku fiolki z muchami i umieść ją w kropli schłodzonej pożywki hodowlanej na szalce Petriego na lodzie na kilka minut. Schłodzenie larwy jest zalecane w celu spowolnienia perystaltycznych skurczów ciała, co ułatwia sekcję.</li>
	<li>Umieść schłodzoną larwę w kropli pożywki hodowlanej na szalce pokrytej Sylgardem pod mikroskopem sekcyjnym.</li>
	<li>Pod mikroskopem sekcyjnym, używając precyzyjnej pęsety Dumont, mocno chwyć larwę w odległości około jednej trzeciej od końca tylnego. Poczekaj, aż larva wysunie haki gębowe z końca przedniego. Chwyć haki gębowe drugą pęsetą po ich pełnym wysunięciu. Aby przeprowadzić sekcję larwy, powoli pociągnij obie pęsety w przeciwnych kierunkach. Kompleks oko-mózg wraz z gruczołami ślinowymi, ciałami tłuszczowymi i tkanką imaginalną zostanie oddzielony od ciała larwy. Nie pociągnij haków gębowych zbyt gwałtownie, w przeciwnym razie mogą one zostać oderwane od kompleksu oko-mózg.</li>
	<li>Odetnij gruczoły ślinowe, ciała tłuszczowe i krążki imaginalne za pomocą ultraprecyzyjnych nożyczek chirurgicznych. Dwie półkule mózgu i krążki oczne pozostaną przytwierdzone do brzusznego sznura nerwowego i haków gębowych.</li>
	<li>Połóż szkiełko podstawowe o średnicy 18 mm na szkiełku przedmiotowym. Pozostaw jedną krawędź szkiełka podstawowego poza krawędzią szkiełka przedmiotowego, aby ułatwić jego późniejsze podniesienie. Dodaj kroplę pożywki hodowlanej na szkiełko podstawowe 18 mm. Przenieś kompleks oko-mózg do pożywki hodowlanej, chwytając haki gębowe pęsetą. Nie chwytaj bezpośrednio kompleksu oko-mózg pęsetą, aby nie uszkodzić tkanki.</li>
	<li>Używając precyzyjnych nożyczek sekcyjnych, odetnij haki gębowe od kompleksu oko-mózg i wyrzuć je. Usunięcie haków gębowych jest ważne w przypadku obrazowania żywych tkanek, ponieważ haki gębowe będą nadal kurczyć się w pożywce hodowlanej, co spowoduje przemieszczanie się tkanki podczas mikroskopii.</li>
	<li>Aby zwizualizować migrację gleju w obrębie krążka imaginalnego oka, ostrożnie przetnij szypułkę optyczną (cienka tkanka łącząca mózg z krążkiem oka) i odsuń lub usuń mózg (patrz ryc. 1A). Aby zwizualizować glej w obrębie szypułki optycznej, pozostaw mózg, szypułkę optyczną i krążek imaginalny oka nienaruszone (patrz ryc. 1E).</li>
	<li>Podnieś szkiełko podstawowe pęsetą i narysuj pod nim okrąg wokół interesującej tkanki za pomocą markera permanentnego. Okrąg ten pomoże w zlokalizowaniu tkanki podczas mikroskopii w Części 4.</li>
</ol>
Część 3: Montaż tarczki wyobraźliowej oka w magnetycznej komorze hodowlanej.
<ol>
	<li>Za pomocą pęsety chwyć zwisający brzeg szkiełka nakrywki. Przenieś szkiełko nakrywki na płytkę denną magnetycznej komory Chamlide, nie naruszając tkanki w hodowli.</li>
	<li>Umieść silikonowy pierścień O-ring na korpusie komory Chamlide. Zamontuj korpus na płytce dennej.</li>
	<li>Powoli dodaj pożywkę hodowlaną do komory. Nie dodawaj pożywki zbyt szybko, aby nie naruszyć badanej tkanki. Nie wypełniaj komory całkowicie, aby umożliwić wymianę gazową pod przykryciem.</li>
	<li>Ostrożnie połóż niewidoczną pokrywkę na górze komory Chamlide.</li>
</ol>
Część 4: Wizualizacja migrujących komórek glejowych w tarczce oka.
<ol>
	<li>Umieść komorę hodowlaną na stole mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego. Zlokalizuj próbkę przy małym powiększeniu, używając kółka na szkiełku nakrywkowym jako punktu odniesienia.</li>
	<li>Ustaw ostrość na próbce, korzystając z obiektywu 40x. Pozostaw tkankę do czasu jej osadzenia się na szkiełku nakrywkowym. Wykonuj zdjęcia tarczy oka lub szypuły nerwu wzrokowego co 10-15 min przez okres od 3 do 4 godzin. Tkanka może drgać i wypadać z płaszczyzny ostrości. Ręczne ustawienie ostrości na tkance przed wykonaniem zdjęcia pozwoli rozwiązać ten problem.</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki:
Prawidłowo wykonany protokół pozwolił nam zebrać serię obrazów komórek glejowych z markerem GFP, które migrowały z szypuły nerwu wzrokowego do pryzmorycznej tarczy oka (Rycina 1 B-D). Podczas gdy obrazowanie na żywo w okresie 60 minut było wystarczające do zaobserwowania zmian w położeniu jąder komórek glejowych w pryzmorycznej tarczy oka typu dzikiego, jądra komórek glejowych u mutanta genu niezbędnego do migracji komórek glejowych całkowicie nie opuściły szypuły nerwu wzrokowego (strzałki Rycina 1 F-H).
Hodowaliśmy kompleksy oko-mózg przez okresy do 240 minut przed zaobserwowaniem degradacji hodowanej tkanki. Po punkcie czasowym 240 minut zaczynamy obserwować komórki wykazujące ekspresję GFP w pożywce otaczającej hodowane kompleksy oko-mózg (strzałka Rysunek 2 C). Ponadto GFP będzie gromadzić się w postaci rozproszonych plamek w całej tkance, co sugeruje naruszenie jej integralności.
<img alt="Proces podziału komórek typu dzikiego w porównaniu do mutantów; mikroskopia poklatkowa, t=0 do 60 min; analiza ED, OS." height="241" src="/files/ftp_upload/1155/1155fig1.jpg" width="589" data-altupdatedat="1787630408000">
Rycina 1: Obrazowanie na żywo jąder komórek glejowych znakowanych GFP w rozwijających się systemach wzrokowych typu dzikiego oraz mutantów. 
A, E) Obrazy wykonane za pomocą mikroskopii kontrastu interferencyjnego (DIC) hodowlanych tarcz wyobraźnych oka (ED) typu dzikiego oraz mutantów. W typie dzikim komórki glejowe powstają w szypule nerwu wzrokowego (OS) i migrują z niej do tarczy oka. Mózg został usunięty, aby ułatwić spłaszczenie i obrazowanie tarczy wyobraźnej oka. B-D) Mikroskopia fluorescencyjna hodowlanej tarczy wyobraźnej oka typu dzikiego z (A) w punktach czasowych 0, 30 i 60 minut wykazuje, że jądra komórek glejowych znakowane GFP migrują w obrębie tarczy oka.
F-H) Mikroskopia fluorescencyjna zmutowanego kompleksu oko-mózg z obrazu (E) w punktach czasowych 0, 30 i 60 minut wykazuje zatrzymanie jąder glejowych znakowanych GFP wewnątrz sznurowca wzrokowego (strzałka). Mózg (BR) pozostał przyłączony do sznurowca wzrokowego, aby ułatwić obrazowanie gleju wewnątrz sznurowca.
<img alt="Komórkowe zmiany dynamiczne w czasie; sekwencja obrazów mikroskopowych; punkty czasowe: 0, 150, 300 min." height="156" src="/files/ftp_upload/1155/1155fig2.jpg" width="600" data-altupdatedat="1787630408000">
Rysunek 2: Obrazowanie na żywo błon glejowych znakowanych GFP w prążku imaginalnym oka typu dzikiego. Pomyślnie hodowano kompleksy oko-mózg przez okresy 240 minut. Tkanki hodowane dłużej niż 240 minut zaczynają ulegać degradacji. Pożywka hodowlana otaczająca prążek imaginalny oka (ED), szypułkę optyczną (OS) oraz płat mózgu (BR) w czasie 0 (A) i 150 minut (B), w porównaniu do punktu czasowego 300 minut (C), jest wolna od komórek GFP-dodatnich, co wskazano strzałką.

<ol><li>Aigouy, B., Lepelletier, L., Giangrande, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+chain+migration+requires+pioneer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial chain migration requires pioneer cells.</a> J. Neurosci. 28, 11635-11641 (2008).</li>
<li>Silies, M., Yuva, Y., Engelen, D., Aho, A., Stork, T., Klambt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cell+migration+in+the+eye+disc%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial cell migration in the eye disc.</a> J. Neurosci. 27, 13130-13139 (2007).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Sepp, K. J., Auld, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+lacZ+enhancer+trap+lines+to+GAL4+lines+using+targeted+transposition+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Conversion of lacZ enhancer trap lines to GAL4 lines using targeted transposition in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 151, 1093-1101 (1999).</li>
<li>Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emergence+of+geometric+order+in+proliferating+metazoan+epitheia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The emergence of geometric order in proliferating metazoan epitheia.</a> Nature. 442, 1038-1041 (2006).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+%28MARCM%29+for+Drosophila+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) for Drosophila neural development.</a> Trends Neurosci. 24, 251-254 (2001).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym protokole opisujemy obserwację migracji komórek glejowych do tarczki wyobrażeniowej oka przy użyciu mikroskopii żywych komórek. W naszym przykładzie wild type (rycina 1 A-D) wykorzystaliśmy jądrowy marker GFP do obserwacji ruchu komórek glejowych w tarczce oka w ciągu jednej godziny. W mutancie genu kandydującego, niezbędnego do migracji komórek glejowych, który jest obecnie badany w naszym laboratorium, zaobserwowaliśmy zatrzymanie jąder komórek glejowych wewnątrz sznurowata wzrokowa w okresie jedn...

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lizyna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka dla owadów Schneidera&amp;rsquo;</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0146</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-streptomycyna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4458</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór insuliny z trzustki bydlęcej</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0516</td><td></td></tr><tr><td>Komora magnetyczna Chamlide</td><td>Narzędzie</td><td>Live cell Instrument</td><td>CM-R-10</td><td>Komora typu szalka 35 mm dla szkiełka nakrywkowego 18 mm</td></tr><tr><td>Nożyczki do precyzyjnego przycinania</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>15200-00</td><td></td></tr><tr><td>Pinceta Dumont #5</td><td>Narzędzie</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Mikroskop</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Można użyć dowolnego systemu obrazowania fluorescencyjnego, który posiada odpowiednie filtry i wzbudzenie dla GFP. </td></tr></tbody></table>

obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceimaginal oka drosophila

Live Imaging of Glial Cell Migration in the Drosophila Eye Imaginal Disc

Komórki glejowe organizmów kręgowców i bezkręgowców muszą migrować do docelowych obszarów, aby otoczyć osłonkami i wspierać powiązane z nimi neurony. Chociaż w ostatnim czasie poczyniono postępy w opisie migracji żywych komórek glejowych w rozwijającym się skrzydle poczwarki (1), badania nadDrosophilabadania nad migracją komórek glejowych zazwyczaj opierały się na analizie utrwalonych tkanek. Mikroskopowa analiza żywych, ruchliwych komórek umożliwia badanie zachowania komórkowego w trakcie całego procesu migracji, w tym określanie szybkości i zmian kierunku wzrostu. W połączeniu z narzędziami genetycznymi obrazowanie na żywo może być wykorzystywane do precyzyjnego określania roli konkretnych genów w procesie rozwoju. Wcześniejsze prace Silieset al.(2) opisano migrację gleju pochodzącego z łodyżki nerwu wzrokowego — struktury łączącej rozwijające się oko z mózgiem — do tarczki wyobraźnięcia oka w utrwalonej tkance. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół badania migracji żywych komórek glejowych doDrosophilatarcza imaginalna oka. Wykorzystujemy linię Drosophila, która wykazuje ekspresję GFP w rozwijających się glejach, aby śledzić progresję komórek glejowych u zwierząt typu dzikiego oraz u mutantów.

W niniejszej pracy opisujemy protokół badania migracji komórek glejowych do rozwijającego się oka Drosophila za pomocą analizy mikroskopowej żywych tkanek z wykorzystaniem komórek glejowych znakowanych GFP.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Komórki glejowe organizmów kręgowców i bezkręgowców muszą migrować do docelowych obszarów, aby otoczyć osłonkami i wspierać powiązane z nimi neurony. Podczas gdy...

Larwy rozcinamy, chwytając ich końce tylny i przedni, a następnie rozsuwając pęsety w przeciwnych kierunkach. Nadmiar tkanki usuwamy za pomocą nożyczek ultraprecyzyjnych. W ten sposób odsłoniemy dwie półkule mózgu larwy oraz krążki wyobrażeniowe oczu.Brzuszny sznur nerwowy i haki gębowe. Larwalny kompleks mózgu i oczu zostaje przeniesiony do komory hodowlanej. Oddzielamy płat mózgu od szypułki nerwu wzrokowego, aby zwizualizować migrację komórek glejowych wewnątrz tarczki imaginalnej oka typu dzikiego.Aby zaobserwować zatrzymane komórki glejowe w szypule nerwu wzrokowego u mutanta, pozostawiamy płat mózgu przytwierdzony do szypuły. Jestem Patrick Cafferty z laboratorium Vanessy Als w Katedrze Zoologii na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Cześć, jestem Rin.Dzisiaj przedstawimy procedurę wizualizacji migrujących komórek glejowych w rozwijającym się oku Drosophila. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania rozwoju komórek glejowych. Zapraszamy do rozpoczęcia.Na tydzień przed rozpoczęciem eksperymentu muchy są kojone w celu uzyskania larw wykazujących ekspresję GFP pod kontrolą promotora specyficznego dla gleju. Niniejszy eksperyment obejmuje wizualizację GFP z sekwencją lokalizacji jądrowej eksprymowanego w komórkach glejowych. Korzystając z promotora o odwróconej polarności, należy przygotować okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 18 mm z co najmniej jednodniowym wyprzedzeniem, mocząc je przez 10 minut w 1% roztworze poli-L-lizyny, a następnie pozostawiając do wyschnięcia na powietrzu przez noc w dniu poprzedzającym eksperyment.W dniu przeprowadzenia eksperymentu oczyść komorę hodowlaną z magnesami w układzie łańcuchowym, mocząc jej elementy przez noc w 70% etanolu. Przygotuj pożywkę hodowlaną, stosując techniki aseptyczne. Do 10 mililitrów pożywki dla owadów Schneidera dodaj płodową surowicę bydlęcą, roztwór penicyliny i streptomycyny oraz insulinę.Pozostaw czystą komorę hodowlaną z magnesami do wyschnięcia w komorze z laminarnym przepływem powietrza, a następnie usuń resztki etanolu, płucząc ją przygotowanym podłożem hodowlanym. Po zakończeniu tych przygotowań można przystąpić do sekcji kompleksu oko-mózg Drosophila. Aby rozpocząć tę procedurę, wybierz larwę trzeciego stadium w fazie wędrowania z brzegu fiolki z muchami i umieść ją w kropli schłodzonego podłoża hodowlanego na szalce Petriego pozostawionej na lodzie na kilka minut w celu schłodzenia.Zaleca się spowolnienie perystaltycznych skurczów ciała larw w celu ułatwienia sekcji. Następnie umieść schłodzone larwy w kropli pożywki na płytce powlekanej agarosem pod mikroskopem sekcyjnym; za pomocą precyzyjnych pęset Dumont mocno chwyć larwę. Chwyć ją mniej więcej w jednej trzeciej odległości od końca tylnego, a następnie poczekaj, aż larwa wysunie haki gębowe z końca przedniego. Gdy haki gębowe będą w pełni wysunięte, chwyć je drugą pęsetą.Aby przeprowadzić sekcję larw, powoli rozsuń dwie pary pęset w przeciwnych kierunkach. Kompleks około-mózgowym, wraz z gruczołami ślinowymi, ciałkami tłuszczowymi i tkanką imaginalną, oddzieli się od ciała larwy. Nie odciągaj haczyków gębowych zbyt gwałtownie, aby nie oderwały się od kompleksu iBrain.Odciąć gruczoły ślinowe, ciała tłuszczowe i dyski imaginalne. Za pomocą ultraprecyzyjnych nożyczek chirurgicznych oddzielić dwie półkule mózgu oraz dyski oczne, pozostawiając je połączonymi z brzusznym sznurem nerwowym i haczykami gębowymi. Następnie umieścić szkiełko cover slip o średnicy 18 milimetrów na lamellce szklanej, tak aby jeden brzeg szkiełka wystawał poza krawędź lamellki. Aby ułatwić późniejsze podniesienie szkiełka, nanieść na nie kroplę pożywki hodowlanej.Chwyć haki gębowe pęsetą i przenieś kompleks oka i mózgu (iBrain) do pożywki hodowlanej na szkiełku nakrywce. Po przeniesieniu kompleksu oka i mózgu na szkiełko nakrywkowe, użyj precyzyjnych nożyczek do sekcji, aby odciąć haki gębowe od kompleksu oka i mózgu.Usunięcie haczyków gębowych jest istotne dla obrazowania na żywo, ponieważ haczyki gębowe będą nadal kurczyć się w medium hodowlanym, powodując ruch tkanki podczas mikroskopii. Aby zwizualizować GL wewnątrz szypułki optycznej, pozostaw mózg, szypułkę optyczną i tarczkę wyobraźnię oka nienaruszone. Aby zwizualizować migrację gleju w obrębie tarczki wyobraźniej oka, ostrożnie przetnij szypułkę optyczną — cienką tkankę łączącą mózg z tarczką oka — a następnie odsuń lub usuń mózg.Na koniec podnieś szkiełko nakrywką za pomocą pęsety i obrysuj markerem permanentnym okrąg pod szkiełkiem wokół interesującej tkanki. Okrąg ten pomoże w późniejszym zlokalizowaniu tkanki podczas badania mikroskopowego. Teraz tarcza imaginalna oka jest gotowa do zamontowania w magnetycznej komorze hodowlanej.Aby zamocować tarczkę wyobrażeniową oka w magnetycznej komorze hodowlanej, należy za pomocą pęsety chwycić zwisający brzeg szkiełka nakrywki i przenieść je na płytkę denną magnetycznej komory łańcuchowej, nie naruszając tkanki w kulturze. Następnie należy umieścić silikonowy pierścień O-ring na głównym korpusie komory łańcuchowej. Powoli zainstalować główny korpus na płytce dennej.Dodaj pożywkę do komory. Nie dodawaj pożywki zbyt szybko, aby nie zaburzyć tkanki i umożliwić wymianę gazową pod przykryciem. Nie napełniaj komory całkowicie, a następnie delikatnie nałóż niewidoczną pokrywę na górę komory z linią łańcuchową.Aby zwizualizować migrujące komórki glejowe, należy umieścić komorę hodowlaną na stoliku mikroskopu konfokalnego lub fluorescencyjnego. Przy małym powiększeniu należy zlokalizować próbkę, wykorzystując okrąg na szkiełku nakrywkowym jako punkt odniesienia. Następnie należy ustawić ostrość na próbce, używając obiektywu 40x.Należy odczekać, aż tkanka osiądzie, a następnie wykonywać zdjęcia tarczki oka lub szypuły nerwu wzrokowego co 10 do 15 minut przez trzy do czterech godzin, jeśli procedura została przeprowadzona prawidłowo. Protokół ten pozwoli na uzyskanie serii obrazów komórek glejowych znakowanych GFP, migrujących z szypuły nerwu wzrokowego do tarczki imaginalnej oka. O ile obrazowanie na żywo przez okres 60 minut było wystarczające do zaobserwowania zmian w położeniu jąder komórek glejowych w tarczce imaginalnej oka typu dzikiego, o tyle jądra komórek glejowych u mutantów z genem niezbędnym do migracji komórek glejowych całkowicie nie opuściły szypuły nerwu wzrokowego.Hodowaliśmy kompleksy oko-mózg przez okresy trwające do 240 minut, zanim zaobserwowano pogorszenie stanu hodowanej tkanki. Po upływie 240 minut zaczynamy dostrzegać komórki GFP-dodatnie w pożywce hodowlanej otaczającej hodowane kompleksy oko-mózg. Ponadto GFP gromadzi się w rozproszonych punktach w całej tkance, co sugeruje utratę integralności tkankowej.Właśnie pokazaliśmy Państwu, jak hodować krążki imaginalne w celu badania migracji komórek glejowych. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

live-imaging-glial-cell-migration-drosophila-eye-imaginal

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Relacja na żywo z migracji komórek glejowych na tarczy ocznej Drosophila

Opisujemy nowy reporter w postaci czerwonego białka fluorescencyjnego (RFP), który jest specyficznie ekspresowany w oku Drosophila. Szczegółowo przedstawiamy metodologię preparowania tarczki wyobraźnej oka oraz sposób, w jaki reporter ten może pomóc w preparacji i identyfikacji konkretnych typów komórek w rozwijającym się oku.

Nowy reporter RFP wspomagający wizualizację tarczki wyobraźnej oka u Drosophila

Drosophila hemocyty rozprzestrzeniają się po całym rozwijającym się embrionie. Niniejszy protokół demonstruje sposób montowania i obrazowania tych migracji z wykorzystaniem embrionów z hemocytami znakowanymi fluorescencyjnie.

Obrazowanie na żywo migracji hemocytów embrionalnych Drosophila melanogaster

Niniejszy protokół opisuje trzy preparaty Drosophila: 1) wypreparowanie mózgu dorosłego osobnika, 2) wypreparowanie siatkówki dorosłego osobnika oraz 3) wypreparowanie kompleksów rozwijającego się krążka oka i mózgu. Szczególny nacisk położono na specjalne techniki przygotowania i warunki obrazowania żywych tkanek, choć wszystkie preparaty mogą być wykorzystane do immunohistochemii tkanek utrwalonych.

Przygotowanie rozwijających się oraz dorosłych mózgów i siatkówek Drosophila do obrazowania na żywo

Ten film demonstruje barwienie immunofluorescencyjne transgenicznego mózgu Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych. Mózg wykazuje ekspresję białek ukierunkowanych na błonę, połączonych z różnymi kombinacjami epitopów antygenowych pod kontrolą specyficznego dla gleju systemu rekombinazy. Wyizolowane i utrwalone mózgi są barwione pierwszorzędowymi przeciwciałami specyficznymi dla epitopów antygenowych, a następnie przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z fluoroforem.

Barwienie immunofluorescencyjne mózgów Drosophila do obrazowania pojedynczych komórek glejowych

Źródło: Hellerman, M. B., et al. Obrazowanie na żywo Drosophila Oko poczwarki. J. Vis. exp. (2015){{TAG_ 28}}Film demonstruje technikę obrazowania na żywo do badania wzorców oczu u poczwarki Drosophila melanogaster. Markery znakowane zielonym białkiem fluorescencyjnym (GFP) umożliwiają wizualizację organizacji i różnicowania komórek podczas tworzenia rozwijającej się struktury oka.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej

Ten protokół szczegółowo opisuje uproszczoną metodę używaną do przeprowadzania obrazowania żywych komórek w kontekście nienaruszonego mózgu larwy. Metody obrazowania żywych komórek są nieocenione w badaniu asymetrycznych podziałów nerwowych komórek macierzystych, a także innych procesów neurogennych i rozwojowych, konsekwentnie odkrywając mechanizmy, które wcześniej były pomijane.

Obrazowanie na żywo neuroblastów larw Drosophila

Dorosłe struktury Drosophila wywodzą się z workowatych struktur zwanych dyskami imaginalnymi. Analiza tych dysków zapewnia wgląd w wiele procesów rozwojowych, w tym określanie tkanek, ustalanie granic przedziałów, proliferację komórek, specyfikację losu komórki i polaryzację komórek płaskich. Protokół ten służy do przygotowania dysków wyobrażeniowych do mikroskopii świetlnej/fluorescencyjnej.

Rozwarstwienie i barwienie immunologiczne dysków wyobrażonych z Drosophila melanogaster

Ten protokół przedstawia skuteczną metodę obrazowania żywego nabłonka oka poczwarki Drosophila. Metoda ta kompensuje ruch tkanek i nierówną topologię, poprawia wizualizację granic komórek dzięki zastosowaniu wielu białek połączeniowych znakowanych GFP i wykorzystuje łatwe w montażu urządzenie do obrazowania.

Obrazowanie na żywo oka poczwarki Drosophila

Ten protokół opisuje szczegółową metodę długoterminowej hodowli ex vivo i obrazowania na żywo wyobrażonego dysku Drosophila. Pokazuje różnicowanie fotoreceptorów i rotację ommatidialną w ciągu 10 godzin obrazowania na żywo tarczy oka. Protokół jest prosty i nie wymaga kosztownej konfiguracji.

Długoterminowe obrazowanie na żywo dysku oka Drosophila

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół do wykonywania na żywo obrazowania asymetrycznego podziału komórek macierzystych linii zarodkowej (GSC) w niszy jajnikowej Drosophila. Używamy linii transgenicznej, która wszechobecnie ulega ekspresji fuzji białka zielonej fluorescencji (GFP) białka spektrosomu Par-1.

Rozszerzone obrazowanie na żywo nisz komórek macierzystych linii zarodkowej Drosophila melanogaster

Opisujemy protokół pomiaru kontaktów między komórkami w sąsiednich warstwach nabłonka w żywych dyskach imaginalnych skrzydeł Drosophila przy użyciu podejścia opartego na rekonstytucji GFP.

System podwójnej ekspresji oparty na komplementacji GFP do oceny kontaktu komórka-komórka, w którym pośredniczą cytonemy w żywych krążkach imaginalnych skrzydeł Drosophila

Poznaj metodę obrazowania na żywo migracji komórek glejowych w dysku imaginalnym oka Drosophila. Technika GFP umożliwia wizualizację dynamiki komórek w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie na żywo migracji komórek glejowych w tarczceImaginal oka Drosophila

Przeglądaj więcej filmów