Name: Kwantyfikacja chronologicznej długości życia drożdży na podstawie wzrostu starzejących się komórek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-06T00:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 24 s
Description: Poznaj metodę wysokoprzepustową do pomiaru chronologicznej długości życia drożdży poprzez analizę krzywych wzrostu. Technika ta umożliwia badanie procesów starzenia się komórek eukariotycznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez grant NIH 1R21AG031965-01A1. M. K. jest nowym stypendystą w dziedzinie starzenia (New Scholar in Aging) w Ellison Medical Foundation.

Część 1: Przygotowanie kultur starzejących się
<ol>
	<li>Wysiać interesujące szczepy z zamrożonych stoków na płytki z agarem YEPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% bakto-peptonu, 2% agaru, 2% glukozy).</li>
	<li>Inkubować komórki w temperaturze 30˚C przez 48 godzin lub do pojawienia się pojedynczych kolonii.</li>
	<li>Wybrać pojedyncze kolonie i zaszczepić je do 5 mL płynnej pożywki YEPD (1% ekstraktu drożdżowego, 2% bakto-peptonu, 2% glukozy) w probówkach.</li>
	<li>Hodować kultury przez noc w temperaturze 30˚C, zapewniając stałe mieszanie za pomocą wytrząsarki lub bębna obrotowego.</li>
	<li>Zaszczepić 5 mL syntetycznej pożywki kompletnej (SC) (Tabela 1) za pomocą 50 µL kultury nocnej. Zazwyczaj dla każdego szczepu przygotowuje się trzy kultury SC, aby zapewnić potrójną powtórzalność biologiczną analizy długości życia dla każdego badanego szczepu.</li>
	<li>Utrzymywać kultury w temperaturze 30˚C przy stałym mieszaniu na bębnie obrotowym przez cały czas trwania eksperymentu (zazwyczaj 2 lub więcej tygodni).</li>
</ol>
Część 2: Wyznaczanie punktu wiekowego przeżywalności
Po dwóch dniach hodowli w medium SC komórki powinny znajdować się w fazie stacjonarnej, co oznacza, że można pobrać pierwszy punkt czasowy (wiek komórek). Kolejne punkty czasowe należy pobierać co 2-3 dni przez minimum dwa tygodnie. Dla każdego punktu czasowego:
<ol>
	<li>Przygotuj 100-dołkowe płytki Bioscreen Honeycomb do szczepienia, napełniając każdą studzienkę 145 µL pożywki YEPD. Należy pozostawić przynajmniej jedną studzienkę wypełnioną samą pożywką YEPD, bez komórek, do późniejszej analizy danych.</li>
	<li>Wyjmij starzejące się kultury z inkubatora.</li>
	<li>Krótko wymieszaj na wirówce typu vortex pierwszą kulturę przeznaczoną do zaszczepienia na płytce Honeycomb, uważając, aby nie rozlać zawartości.</li>
	<li>Pobierz 5 µL wymieszanej kultury i pipetuj ją do pierwszej studzienki płytki Honeycomb. Wypal płomieniem wylot każdej probówki przed i po pobraniu 5 µL alikwotu.</li>
	<li>Powtórz tę procedurę dla każdej starzejącej się kultury, pamiętając o zapisaniu położenia studzienki odpowiadającej każdej kulturze. W całym eksperymencie dla każdego kolejnego punktu czasowego (wieku) należy stosować te same położenia studzienek.</li>
	<li>Po zakończeniu szczepienia umieść kultury z powrotem w inkubatorze w temperaturze 30˚C.</li>
</ol>
Część 3: Załadunek maszyny Bioscreen C MBR
<ol>
	<li>Odsłoń komorę inkubatora, podnosząc pokrywę, a następnie zdejmij osłonę tacy na próbki.</li>
	<li>Włóż nowo zaszczepioną płytkę Honeycomb do tacy na próbki (w przypadku odczytu tylko jednej płytki użyj lewego slotu).</li>
	<li>Załóż ponownie osłonę tacy na próbki i opuść pokrywę komory inkubatora.</li>
	<li>Upewnij się, że poziom cieczy przenoszącej ciepło znajduje się powyżej minimalnego poziomu wypełnienia. W przypadku niskiego poziomu, dolej cieczy, używając pipety 1000 µL i dostarczonego medium przenoszącego ciepło.</li>
	<li>W oprogramowaniu Bioscreen „EZExperiment” ustaw następujące parametry, aby uzyskać odpowiednie krzywe wzrostu dla Saccharomyces cerevisiae:
	<ul>
		<li>Liczba próbek (Number of samples): wpisz liczbę studzienek z pożywką lub 200</li>
		<li>Filtr (Filter): 420-580nm, Wideband</li>
		<li>Temperatura (Temperature): 30˚C</li>
		<li>Czas trwania eksperymentu (Experiment Length): 1 dzień, 0 godzin, 0 sekund</li>
		<li>Interwał pomiarowy (Measurement Interval): 30 minut</li>
		<li>Wstrząsanie (Shaking): Włączone (On), wstrząsanie ciągłe (Continuous shaking), wysokie (High)</li>
	</ul>
	</li>
	<li>Kliknij „Start”, aby rozpocząć odczyty.</li>
</ol>
Część 4: Analiza danych
Zazwyczaj w ciągu dwóch tygodni wyznacza się sześć punktów czasowych (wiekowe). Punkty te przypadają na dni 2, 4, 6, 9, 11 i 13. W zależności od projektu eksperymentalnego oraz testowanych szczepów, może być korzystne wyznaczanie punktów czasowych częściej, rzadziej lub przez okres dłuższy niż 2 tygodnie. Ważne jest, aby płytkę Honeycomb wypełniać w tej samej kolejności dla każdego punktu czasowego, tak aby każda starzejąca się kultura odpowiadała tej samej pozycji studzienki w każdym punkcie; znacznie ułatwi to późniejszą analizę danych.
<ol>
	<li>Pobierz pliki wyjściowe z urządzenia Bioscreen C MBR. Oprogramowanie „EZExperiment” eksportuje dane Bioscreen do pliku z rozdzielaczami tabulacyjnymi, który jest kompatybilny z programem Microsoft Excel oraz innym oprogramowaniem. Pierwsza kolumna wskazuje czas wykonania pomiaru OD podczas eksperymentu, a kolejne kolumny reprezentują poszczególne studzienki w płytkach Bioscreen Honeycomb (Rycina 1).</li>
	<li>Usuń pierwszy odczyt OD z każdej kolumny. Odczyt ten stanowi „szum”.</li>
	<li>Znormalizuj dane, odejmując wartość OD studzienki zawierającej samą pożywkę YEPD od wszystkich wartości OD w każdej kolumnie. Pozwala to usunąć tło absorbancji pożywki.</li>
	<li>Wykreśl krzywe wzrostu. Krzywe będą przesuwać się w zależności od wieku (Rycina 2). Na przykład, wykreślając krzywe wzrostu z kolumny 1 (studzienka 1 płytki Honeycomb) dla sześciu punktów czasowych, można zaobserwować wyraźne przesunięcie krzywych w prawo wraz z upływem czasu.</li>
	<li>Oblicz czas podwojenia (δ) dla każdej studzienki na podstawie kinetyki wzrostu dla punktu wiekowego z dnia 2. Równanie używane do obliczenia czasu podwojenia to: 
	<img alt="Wzór na obliczanie czasu połowicznego rozpadu, diagram logarytmu naturalnego i gęstości optycznej, do celów edukacyjnych." src="/files/ftp_upload/1156/equat.png" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie"> 
	gdzie OD1 i OD2 reprezentują kolejne pomiary OD, a t1 i t2 to czas między pomiarami. Obliczaj czasy podwojenia wyłącznie dla wartości OD w zakresie od 0,2 do 0,5. Średnia z tych wartości stanowi czas podwojenia dla danej studzienki. Większość szczepów drożdży typu dzikiego powinna dawać wartość czasu podwojenia od 85 do 90 minut.</li>
	<li>Dla każdego punktu wiekowego oblicz przesunięcie czasowe (∆t) w krzywych wzrostu względem początkowego punktu wiekowego (dzień 2). Prostym sposobem jest wyznaczenie różnicy w czasie potrzebnym na osiągnięcie OD 0,3 w każdej studience pomiędzy początkowym punktem wiekowym a każdym kolejnym punktem wiekowym. Czas, w którym dana studzienka osiągnęła OD 0,3, można obliczyć z równania regresji liniowej dla ln(OD) jako funkcji czasu pomiędzy dwoma punktami czasowymi obejmującymi wartość OD=0,3.</li>
	<li>Oblicz frakcję przeżywalności dla każdego punktu wiekowego, aby wygenerować krzywą przeżywalności (Rycina 3). Przyjmij, że początkowy punkt wiekowy (dzień 2) odpowiada 100% żywotności. Dla każdego kolejnego punktu wiekowego oblicz procent przeżywalności, korzystając z równania: 
	<img alt="Wzór analizy statystycznej, obliczanie indeksu wrażliwości, równanie Sn=1/2(Δtn/δn)×100." height="115" src="/files/ftp_upload/1156/equat2.png" width="245" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Drugie równanie"> 
	gdzie sn to procent przeżywalności, ∆tn to przesunięcie czasowe, a δn to czas podwojenia.</li>
	<li>Wygeneruj krzywe przeżywalności (Rycina 3B) zgodnie z potrzebami dla każdej studzienki (lub powtórzeń studzienek), wykreślając frakcję (lub procent) żywych komórek jako funkcję wieku.</li>
	<li>Oblicz całkę przeżywalności (SI) dla każdej studzienki. SI jest definiowana jako pole pod krzywą przeżywalności i może być szacowana według wzoru: 
	<img alt="Wzór równowagi statycznej: SI=Σ(Sn-1+Sn)/2*(agen-age n-1). Diagram równania matematycznego." height="79" src="/files/ftp_upload/1156/equat3.png" width="400" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Równanie 3"> 
	gdzie agen to punkt wiekowy (np. 2, 4, 6, 9, 11 i 13), a sn to wartość przeżywalności w tym punkcie wiekowym.</li>
	<li>Wyznacz parametry statystyczne powtórzeń studzienek z danych SI i przeżywalności. Typowe istotne parametry statystyczne obejmują średnią, medianę i wariancję dla każdego zestawu powtórzeń biologicznych. Do porównywania parzystego SI dla różnych grup eksperymentalnych i kontrolnych można zastosować test t-Studenta lub podobną analizę. Wskazane może być również wygenerowanie krzywych przeżywalności, jak opisano w punkcie 4.8, na podstawie uśrednionych powtórzeń biologicznych.</li>
</ol>
Część 5: Reprezentatywne wyniki
Po zakończeniu eksperymentu wykreślona zostanie krzywa przeżywalności i przeprowadzona analiza danych wystarczająca do określenia potencjału starzenia chronologicznego dla kilku różnych szczepów lub warunków. Jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo, krzywe wzrostu uzyskane z urządzenia Bioscreen C MBR powinny wyglądać podobnie do tych przedstawionych na Rysunku 2, a wynikowe krzywe przeżywalności powinny przypominać te ukazane na Rysunku 3. Zazwyczaj komórki typu dzikiego hodowane w opisanych tutaj warunkach wykazują medianowy czas życia chronologicznego rzędu 7 dni. Znaczne różnice w przeżywalności obserwuje się u różnych szczepów oraz w niektórych warunkach; na przykład w przypadku wzrostu w pożywce z 0,05% glukozy medianowa przeżywalność może przekroczyć 30 dni.
<img alt="Arkusz analizy danych przedstawiający surowe dane liczbowe dla wielu zmiennych i przedziałów czasowych." src="/files/ftp_upload/1156/1156fig1.png" data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rysunek 1. Wyniki danych z programu Bioscreen „EZExperiment”. Kolumna A przedstawia czas, w którym dokonano pomiaru absorbancji. Kolejne kolumny reprezentują studzienki płytki Honeycomb zaszczepionej komórkami pobranymi z kultur starzejących się.
<img alt="Wykres absorbancji w funkcji czasu; wzrost mikrobiologiczny z wielu dni; pomiar gęstości optycznej." src="/files/ftp_upload/1156/1156fig2.png" data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rycina 2. Krzywe wzrostu z jednego powtórzenia biologicznego w trakcie trwania eksperymentu. Wraz z upływem czasu widoczne jest wyraźne przesunięcie krzywych, gdy komórki w starzejącej się kulturze tracą żywotność. Odstęp czasu między początkowym punktem pomiarowym (dzień 2) a kolejnym punktem pomiarowym określa żywotność w danym wieku.
<img alt="Wykres przeżywalności w zależności od wieku; wykres liniowy; analiza danych dotyczących dni względem procentowej przeżywalności." src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3a.png" data-altupdatedat="1787630408000"><img alt="Wykres porównujący przeżywalność szczepów w czasie; wykres liniowy przedstawia procent przeżywalności względem wieku w dniach." src="/files/ftp_upload/1156/1156fig3b.png" data-altupdatedat="1787630408000"> 
Rysunek 3. A) Krzywa przeżywalności wygenerowana na podstawie danych o wzroście z Rysunku 1. Punkt czasowy w 2. dniu został przyjęty jako punkt 100% przeżywalności. B) Końcowe krzywe przeżywalności dwóch szczepów przetestowanych w tym samym eksperymencie. Krzywe te reprezentują średnią przeżywalność trzech powtórzeń biologicznych dla każdego szczepu. Słupki błędów reprezentują odchylenie standardowe w obrębie powtórzeń biologicznych. Zacieniowany obszar pod krzywą przeżywalności reprezentuje całkę przeżywalności (SI) dla szczepu 1.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Tabela 1. Syntetyczne medium zdefiniowane stosowane w badaniach starzenia chronologicznego (tło szczepu BY4743)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Składnik</td>
			<td>Stężenie (g/L)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-glukoza</td>
			<td>20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast nitrogen base (-AA/AS)</td>
			<td>1.7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4</td>
			<td>5.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adenina</td>
			<td>0.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-arginina</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas L-asparginowy</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas L-glutaminowy</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-histydyna</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-leucyna</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-lizyna</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-metionina</td>
			<td>0.02</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-fenyloalanina</td>
			<td>0.05</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-seryna</td>
			<td>0.375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-treonina</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tryptofan</td>
			<td>0.04</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-tyrozyna</td>
			<td>0.03</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-walina</td>
			<td>0.15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uracyl</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Uwaga: Niniejsza receptura uwzględnia aukstrofie w diploidalnym szczepie BY4743. Aukstrofie aminokwasowe należy zrekompensować, dodając do syntetycznego medium kompletnego składniki do końcowego stężenia 5X.

<ol><li>Steinkraus, K. A., Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replicative+aging+in+yeast%3A+the+means+to+the+end%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Replicative aging in yeast: the means to the end.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 24, 29(2008).</li>
<li>Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaeberlein%2C+M+%22Handbook+of+models+for+human+aging%22">Handbook of models for human aging</a>. Conn, P. M. , Elsevier Press. Boston. 109(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., Longo, V. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chronological+life+span+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae.</a> Aging Cell. 2 (2), 73(2003).</li>
<li>Murakami, C. J., Burtner, C. R., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high-throughput+quantitative+analysis+of+yeast+chronological+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A method for high-throughput quantitative analysis of yeast chronological life span.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (2), 113(2008).</li>
<li>Piper, P. W., Harris, N. L., MacLean, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preadaptation+to+efficient+respiratory+maintenance+is+essential+both+for+maximal+longevity+and+the+retention+of+replicative+potential+in+chronologically+ageing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Preadaptation to efficient respiratory maintenance is essential both for maximal longevity and the retention of replicative potential in chronologically ageing yeast.</a> Mech Ageing Dev. 127 (9), 733(2006).</li>
<li>Fabrizio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+is+a+mediator+of+an+altruistic+aging+program+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Superoxide is a mediator of an altruistic aging program in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Cell Biol. 166 (7), 1055(2004).</li>
</ol>

Opisany tutaj wysokoprzepustowy test chronologicznej długości życia jest skuteczną metodą ilościowego określania potencjału starzenia się dla dużej liczby szczepów z wysoką dokładnością i precyzją. Główną zaletą tej metody w stosunku do klasycznych metod określania przeżywalności poprzez zliczanie jednostek tworzących kolonie (np. patrz 3) jest zastosowanie urządzenia łączącego funkcje wytrząsarki, inkubatora i czytnika płytek, takiego jak aparat Bioscreen C MBR, w celu uzyskania wysokorozdzielczych krzywych w...

<table><tbody><tr><td>Pepton Bacto</td><td>Odczynnik</td><td>BD Biosciences</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy Bacto</td><td>Odczynnik</td><td>BD Biosciences</td><td>288620</td><td></td></tr><tr><td>Agar Difco</td><td>Odczynnik</td><td>BD Biosciences</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Yeast Nitrogen Base bez aminokwasów i siarczanu amonu</td><td>Odczynnik</td><td>MidSci</td><td>J630-500G</td><td></td></tr><tr><td>Aminokwasy</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siarczan amonu</td><td>Odczynnik</td><td>Spectrum</td><td>AM185</td><td></td></tr><tr><td>Dekstroza</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-10</td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie Bioscreen C MBR</td><td>Narzędzie</td><td>Growth Curves USA</td><td>5101370</td><td></td></tr><tr><td>Płytka Bioscreen 100-dołkowa typu Honeycomb</td><td>Narzędzie</td><td>Growth Curves USA</td><td>9502550</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja chronologicznej długości życia drożdży poprzez odrastanie starzejących się komórek

Quantifying Yeast Chronological Life Span by Outgrowth of Aged Cells

Drożdże pączkująceSaccharomyces cerevisiaeokazał się być istotnym organizmem modelowym w badaniach nad starzeniem1Długość życia replikacyjnego oraz chronologicznego to dwa uznane paradygmaty stosowane w badaniu starzenia się drożdży. Starzenie replikacyjne definiuje się jako liczbę komórek potomnych, które pojedyncza macierzyńska komórka drożdży produkuje przed wejściem w stan senescencji; starzenie chronologiczne definiuje się jako czas, przez który komórki mogą przeżyć w niedzielącym się stanie przypominającym spoczynek.2Opracowaliśmy wysokoprzepustową metodę ilościowego pomiaru chronologicznej długości życia. Metoda ta polega na starzeniu komórek w określonym medium, w warunkach mieszania i przy stałej temperaturze. W każdym punkcie czasowym starzenia subpopulacja komórek jest pobierana z hodowli starzejącej się i szczepiona w bogatym medium wzrostowym. Następnie, przy użyciu urządzenia Bioscreen C MBR, uzyskuje się krzywą wzrostu o wysokiej rozdzielczości dla tej subpopulacji starzejących się komórek. W dalszej kolejności stosuje się algorytm w celu określenia względnej proporcji żywych komórek w każdej subpopulacji na podstawie kinetyki wzrostu w każdym punkcie czasowym. Metoda ta wymaga znacznie mniej czasu i zasobów w porównaniu z innymi testami chronologicznej długości życia, zachowując jednocześnie powtarzalność i precyzję. Wysokoprzepustowy charakter tego testu powinien umożliwić prowadzenie wielkoskalowych przesiewów genetycznych i chemicznych w celu zidentyfikowania nowych modyfikatorów długowieczności do dalszych badań na bardziej złożonych organizmach.

Starzenie chronologiczne u drożdży odnosi się do utraty żywotności komórek związanej z czasem przebywania w fazie stacjonarnej. W niniejszej pracy opisujemy wysokoprzepustową metodę ilościowego określania chronologicznej długości życia drożdży.

Kwantyfikacja chronologicznej długości życia drożdży poprzez odrastanie starzejących się komórek

Drożdże piekarnicze Saccharomyces cerevisiae okazały się ważnym organizmem modelowym w badaniach nad starzeniem 1. Starzenie replikacyjne i ...

Starzejące się kultury utrzymuje się w probówkach w temperaturze 30 °C przy stałym mieszaniu. Za pomocą bębna obrotowego, alikwot komórek z każdej starzejącej się kultury zaszczepia się do dołka płyty plastra miodu bio screen zawierającej podłoże YEPD. Urządzenie bio screen CMBR inkubuje i wstrząsa płytą plastra miodu przez 24 godziny, mierząc jednocześnie gęstość optyczną każdego dołka.Krzywe wzrostu mogą być generowane co 30 minut na podstawie danych wyjściowych z bio screenu, co pozwala na obliczenie żywotności każdej starzejącej się kultury. Po 24-godzinnej inkubacji gęstość komórek w dołkach płytki plastra miodu może się różnić w zależności od żywotności pierwotnej starzejącej się kultury. Cześć, jestem Chris Murakami z laboratorium dr. Matta Capline'a oraz z Katedry Patologii na University of Washington.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę ilościowego określania chronologicznej długości życia drożdży przy użyciu wzrostu komórek w różnym wieku. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać, w jaki sposób czynniki genetyczne i środowiskowe wpływają na długowieczność drożdży. Zatem zacznijmy.Aby przygotować kultury do starzenia, najpierw należy wysiać dwa szczepy drożdży z zamrożonych zasobów na szalki z agar YEPD, a następnie inkubować komórki w temperaturze 30 °C przez 48 godzin lub do momentu pojawienia się pojedynczych kolonii. Po pojawieniu się pojedynczych kolonii należy je wyizolować i zaszczepić w 5 mL płynnej pożywki YEPD.W probówkach hodować kultury przez noc w temperaturze 30 °C w bębnie obrotowym, aby zapewnić stałe mieszanie. Po inkubacji nocnej użyć 50 µl każdej kultury do zaszczepienia 5 mL syntetycznego pożywki kompletnej (SC). Zazwyczaj dla każdego szczepu przygotowuje się trzy kultury SC, aby zapewnić potrójną replikację biologiczną analizy długości życia dla każdego badanego szczepu. Przez cały czas trwania eksperymentu, który zazwyczaj trwa dwa lub więcej tygodni po dwóch dniach hodowli, utrzymywać kultury w temperaturze 30 °C przy stałym mieszaniu w bębnie obrotowym.W pożywce SC komórki powinny znajdować się w fazie stacjonarnej, co oznacza gotowość do pobrania pierwszej próbki w określonym punkcie czasowym. Kolejne próbki należy pobierać co dwa do trzech dni przez minimum dwa tygodnie. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować ekran biologiczny.Płytki plastrem miodu z 100 dołkami do inokulacji, wypełniając każdy dołek 145 µL pożywki YEPD. Należy upewnić się, że co najmniej jeden dołek zawiera samą pożywkę YEPD bez komórek, w celu późniejszej analizy danych. Wyjąć starzejące się kultury z inkubatora.Krótko mówiąc, wymieszaj na wirówce pierwszą kulturę przeznaczoną do inokulacji na płytce plastra miodu. Należy uważać, aby nie rozlać kultury. Odpalam wylot probówki, pobierz 5 µL kultury i pipetuj ją do pierwszej studni płytki plastra miodu.Nie zapomnij o opaleniu wlotu probówki. Po pobraniu pięciomikrolitrowej alikwoty powtórz tę procedurę inokulacji dla każdej starzejącej się kultury. Pamiętaj, aby dokładnie zanotować pozycję dołka odpowiadającą każdej identycznej kulturze.Dla każdego kolejnego punktu wiekowego w całym przebiegu eksperymentu należy wykorzystywać te same pozycje studzienek. Przenieś kultury z powrotem do inkubatora ustawionego na 30 °C. Po zakończeniu szczepień i zaszczepieniu kultur do płyty plastra miodu, płytę ładuje się do urządzenia bio screen CMBR.Aby to zrobić, należy odsłonić komorę inkubatora, podnosząc pokrywę. Następnie należy zdjąć osłonę tacy na próbki. Do tacy na próbki należy włożyć nowo zaszczepioną płytkę typu honeycomb.Użyj lewego slotu. Jeśli odczytujesz tylko jedną płytkę, załóż pokrywę na tackę z próbkami i opuść pokrywę komory inkubatora. Ważne jest, aby upewnić się, że poziom cieczy przekazującej ciepło znajduje się powyżej minimalnego poziomu wypełnienia.Jeśli tak nie jest, należy dodać więcej płynu przekazującego ciepło, używając pipety 1000 µL. W oprogramowaniu bio screen wybierz Easy experiment. Ustaw następujące parametry, aby uzyskać odpowiednie krzywe wzrostu dla croce visi. W polu liczby próbek wprowadź liczbę studzienek z pożywką lub 200, a filtr ustaw na pasmo o szerokości od 420 do 580 nm.Ustaw temperaturę na 30 °C. Czas trwania eksperymentu powinien wynosić jeden dzień, zero godzin i zero sekund. Interwał pomiarowy powinien wynosić 30 minut.Na koniec należy ustawić wstrząsanie na tryb ciągły (continuous shaking) i kliknąć start (high), aby rozpocząć odczyty. Pobierz pliki wynikowe z urządzenia bio screen CMBR. Oprogramowanie do łatwego przeprowadzania eksperymentów wyeksportuje dane z bio screen w formie pliku z tabulatorami, który jest kompatybilny z programem Microsoft Excel oraz innym oprogramowaniem.Pierwsza kolumna, kolumna A, przedstawia czas dokonania pomiaru OD podczas eksperymentu. Kolejne kolumny reprezentują poszczególne studzienki w płytkach bio screen typu honeycomb, zaszczepionych komórkami z kultur starzejących się. Usuń pierwszy odczyt OD z każdej kolumny, ponieważ odczyt ten stanowi szum.Znormalizuj dane, odejmując wartość gęstości optycznej dołka zawierającego samą pożywkę YEPD od wartości gęstości optycznej w każdej kolumnie. Pozwala to na usunięcie absorbancji tła pożywki. Krzywe wzrostu.Krzywe będą przesuwać się w zależności od wieku; na przykład, po wykreśleniu krzywych wzrostu z kolumny pierwszej, studni pierwszej płytki plastra miodu dla sześciu punktów czasowych, widoczne jest wyraźne przesunięcie krzywych w prawo wraz z upływem czasu. Odstęp czasu między początkowym punktem czasowym, dniem drugim, a kolejnym punktem czasowym określa żywotność w tym konkretnym wieku. Oblicz czas podwojenia dla każdej studni na podstawie kinetyki wzrostu dla punktu wiekowego z dnia drugiego.Równanie służące do obliczenia czasu podwojenia wygląda następująco, gdzie OD one oraz OD two reprezentują kolejne pomiary gęstości optycznej, a T one i T two to czas pomiędzy pomiarami. Czas podwojenia należy obliczać wyłącznie dla wartości OD w zakresie od 0.2 do 0.5. Średnia z tych wartości stanowi czas podwojenia dla danej próbki.Większość szczepów drożdży typu dzikiego powinna wykazać czas podwojenia w przedziale od 85 do 90 minut dla każdego punktu wiekowego. Oblicz przesunięcie czasowe delta T w krzywych wzrostu w stosunku do początkowego punktu wiekowego, którym jest drugi dzień. Prostym sposobem wykonania tej operacji jest wyznaczenie różnicy w czasie potrzebnym każdemu dołkowi na osiągnięcie wartości OD równej 0,3 pomiędzy początkowym punktem wiekowym a każdym z kolejnych punktów wiekowych.Czas, w którym konkretna studzienka osiągnęła wartość OD równą 0.3, można obliczyć z równania regresji liniowej odpowiadającego naturalnemu logarytmowi gęstości optycznej. Oblicz frakcję przeżywalności dla każdego punktu wiekowego w celu wygenerowania krzywej przeżywalności, przyjmując początkowy punkt wiekowy z drugiego dnia jako 100% żywotności dla każdego kolejnego punktu wiekowego. Oblicz procent przeżywalności, korzystając z poniższego równania.Gdzie SN to procent przeżywalności. Delta TN to przesunięcie czasowe, a Sigma N to czas podwojenia. Wygeneruj krzywe przeżywalności dla każdego z parametrów według potrzeb.Następnie, wykreślając frakcję żywych komórek w funkcji wieku, oblicz całkę przeżywalności dla każdej studzienki. SI definiuje się jako pole pod krzywą przeżywalności i można je oszacować za pomocą tego wzoru, gdzie age N oznacza punkt wieku, a SN wartość przeżywalności w tym punkcie wieku; na podstawie danych SI i przeżywalności wyznacz parametry statystyczne dla studnieniek powtórzeń. Typowe parametry statystyczne, które są analizowane, obejmują średnią, medianę i wariancję dla każdego zestawu powtórzeń biologicznych. Do porównywania parzystego SI dla różnych grup eksperymentalnych i kontrolnych można zastosować test t-Studenta lub podobną analizę.Wskazane może być również wygenerowanie krzywych przeżywalności na podstawie średnich z powtórzeń biologicznych. Po zakończeniu eksperymentu narysują Państwo krzywą przeżywalności i przeprowadzą wystarczającą analizę danych, aby określić potencjał starzenia chronologicznego dla kilku różnych szczepów lub warunków. Jeśli procedura zostanie wykonana prawidłowo, krzywe wzrostu uzyskane z urządzenia bio screen CMBR powinny wyglądać podobnie do tej krzywej. Zazwyczaj komórki typu dzikiego hodowane w warunkach opisanych w niniejszej instrukcji będą charakteryzować się medianą czasu życia chronologicznego rzędu siedmiu dni.W różnych szczepach oraz w określonych warunkach obserwuje się znaczne zróżnicowanie przeżywalności; na przykład w przypadku wzrostu w podłożu z 0,05% Glucose mediana przeżywalności może przekraczać 30 dni. Przedstawiliśmy właśnie wysokoprzepustową metodę ilościowego określania chronologicznej długości życia drożdży. Croce visier.Należy pamiętać, że podczas wykonywania tej procedury rutynowa konserwacja urządzenia bio screen CMBR jest kluczowa zarówno dla powtarzalności danych, jak i dla ich dokładności. To wszystko. Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

quantifying-yeast-chronological-life-span-by-outgrowth-of-aged-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Określenie chronologiczne życia drożdży poprzez wzrost zestarzanych komórek

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru replikacyjnej długości życia komórek macierzystych drożdży.

Pomiar replikacyjnej długości życia drożdży pączkujących

W niniejszym opracowaniu opisujemy zestaw testów mutacji DNA, które można połączyć z modelem chronologicznej długości życia drożdży w celu zbadania genów i szlaków regulujących lub przyczyniających się do niestabilności genomowego DNA podczas starzenia.

Badanie zależnej od wieku niestabilności genomicznej z wykorzystaniem modelu chronologicznej długości życia S. cerevisiae

Opisujemy tutaj działanie urządzenia mikroprzepływowego, które umożliwia ciągłe i wysokorozdzielcze obrazowanie mikroskopowe pojedynczych pączkujących komórek drożdży podczas ich pełnego okresu replikacji i/lub chronologicznego życia.

Ciągła obserwacja mikroskopowa w wysokiej rozdzielczości starzenia replikacyjnego u pączkujących drożdży

Szybkość mutacji w młodych komórkach Saccharomyces cerevisiae mierzona za pomocą testów fluktuacyjnych służy do przewidywania częstości mutacji dla komórek macierzystych w różnym wieku replikacji. Sortowanie magnetyczne i cytometria przepływowa są następnie wykorzystywane do pomiaru rzeczywistej częstości mutacji i wieku komórek macierzystych w celu zidentyfikowania wszelkich odchyleń od przewidywanych częstości mutacji.

Połączenie sortowania magnetycznego komórek macierzystych i testów fluktuacji w celu analizy niestabilności genomu podczas starzenia się komórek mitotycznych u Saccharomyces cerevisiae

Ten artykuł przedstawia protokół zoptymalizowany pod kątem produkcji chipów mikroprzepływowych oraz konfiguracji eksperymentów mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych pojedynczych komórek drożdży.

Wykorzystanie urządzeń mikroprzepływowych do pomiaru długości życia i fenotypów komórkowych w pojedynczych pączkujących komórkach drożdży

Prezentujemy metodę ilościowego określania fenotypów wzrostu pojedynczych komórek drożdży, gdy rosną one w kolonie na stałych podłożach, za pomocą mikroskopii poklatkowej zwanej One-cell Duubling Evaluation of Living Arrays of Yeast (ODELAY). Heterogeniczność populacji genetycznie identycznych komórek rosnących w kolonie może być bezpośrednio obserwowana i określana ilościowo.

ODELAY: Wielkoskalowa metoda wieloparametrowej kwantyfikacji wzrostu drożdży

Tutaj prezentujemy protokół do oszacowania metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego poprzez dopasowanie wykładniczego wzrostu Saccharomyces cerevisiae do równania wzrostu wykładniczego. Obliczanie parametrów kinetycznych pozwala na badanie przesiewowe wpływu substancji/związków na fermentację lub oddychanie mitochondrialne.

Saccharomyces cerevisiae (Saccharomyces cerevisiae) Kinetyka wzrostu wykładniczego w hodowli wsadowej w celu analizy metabolizmu oddechowego i fermentacyjnego

Tutaj prezentujemy implementację MATLAB automatycznego wykrywania i ilościowego opisu kropelek lipidów w obrazach mikroskopii fluorescencyjnej rozszczepienia i pączkowania komórek drożdży.

Analiza zawartości kropelek lipidów w drożdżach rozszczepialnych i pączkujących przy użyciu zautomatyzowanego przetwarzania obrazu

Oto protokół do identyfikacji interakcji genetycznych za pomocą zwiększonej liczby kopii u Saccharomyces cerevisiae. Metoda ta pozwala naukowcom identyfikować, klonować i testować supresory w krótko żyjących mutantach drożdży. Testujemy wpływ wzrostu liczby kopii SIR2 na długość życia w autofagii mutanta zerowego.

Ekran supresorowy do charakterystyki powiązań genetycznych regulujących chronologiczną długość życia u Saccharomyces cerevisiae

W niniejszym artykule przedstawiamy ogólny protokół pomiaru długości życia nicieni utrzymywanych na pożywkach stałych z bakteriami zneutralizowanymi za pomocą promieniowania UV.

Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans na podłożach stałych

Poznaj metodę wysokoprzepustową do pomiaru chronologicznej długości życia drożdży poprzez analizę krzywych wzrostu. Technika ta umożliwia badanie procesów starzenia się komórek eukariotycznych.

Kwantyfikacja chronologicznej długości życia drożdży poprzez odrastanie starzejących się komórek

Przeglądaj więcej filmów