Name: Transfer jądra do komórki jajowej myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2006-11-30T00:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 17 s
Description: Poznaj technikę transferu jądra do komórki jajowej myszy w celu reprogramowania zróżnicowanego jądra do stanu embrionalnego. Ta metoda jest kluczowa dla badań nad komórkami macierzystymi i medycyną regeneracyjną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

DE pragnie podziękować dr Ukryj Akutsu za podzielenie się swoją NT sztuczki i dr Stephen Sullivan i Garrett Birkhoff do krytycznej lektury protokołu.

Przetwory: <ol><li class="jove_step"> Szczegółowy opis superowulacja i mikrokropla kultury zarodka można znaleźć gdzie indziej 2. </li><li class="jove_step"> Przygotować naczynie Petriego z mikrokropel pożywce zarodków (np. KSOM, Chemicon). Pokrywa z oleju mineralnego (partii oleju mineralnego powinny być testowane na zgodność z kultury zarodków). Uzyskania temperatury 37 ° C w powietrzu plus 5% CO 2. (W Thermo-Electron 3110 wody inkubator z płaszczem lub odpowiednik) </li><li class="jove_step"> Przygotować naczynie do izolacji komórek jajowych: krople Miejsce hepes buforowane CZB i hialuronidazy (0,1% w / v, Sigma) w jednej połowie naczynia i HCZB w drugiej połowie. Pokrywa z oleju mineralnego. Trzymaj danie ciepłe na podgrzewanym etapie mikroskopem rozwarstwienie. </li><li class="jove_step"> Przygotowanie mikroskopu: Umieść gospodarstwa pipety z zewnętrznej średnicy około 50 μ m (nieco mniejsza niż średnica oocytu), i otwarcie około 20 μ m w jedną pipetkę posiadacza. Pipety Holding łatwe do wykonania wraz z niezbędnym wyposażeniem, igła ściągacza (Sutter Instruments) i microforge (Narishige), ale mogą być również zakupione od Humagen. Ładowanie 3-5 l rtęci μ do ogona mikropipety (średnica wewnętrzna 8 m μ). Unikać rozlania rtęci. Przygotuj danie z kilku małych kropli każdego z 11% w / v PVP (poliwinylopirolidon) w HCZB i 5 μ g / ml cytochalazyna B w HCZB. Użyj pokrywę płytki Petriego, a nie danie się jako pokrywy ma krótkie obręczy, która nie będzie kolidować z ruchem w gospodarstwie i pipety wyłuszczenie. Wyrównaj gospodarstwa pipety pipety wyłuszczenie w spadku HCZB. Nabrać trochę HZCB do końcówki pipety gospodarstwa. </li><li class="jove_step"> Przygotowanie komórek dawcy dużej mierze zależy od typu komórek i eksperyment badacz zamierza wykonywać. Ogólnie rzecz biorąc, komórek dawcy powinni być leczeni enzym proteolityczny, takich jak trypsyna i trzymano na lodzie w celu zmniejszenia lepkości do transferu. </li><li class="jove_step"> Humanitarnie eutanazji myszy 14-15 godzin po podaniu hCG. Jajowodów zbiorów i wnikliwie je w ciepłe krople HCZB-hialuronidazy. Po ok.. 5 min, komórek jajowych będzie przede wszystkim wolny od komórek wzgórka. Powinny one być następnie przemyto kilka razy w HCZB, następnie przemywa się jeszcze w pre-zrównoważoną krople KSOM, i przechowywane w inkubatorze do wyłuszczenie. </li></ol> Wyłuszczenie Manipulacje są wykonywane z hydraulicznym mikromanipulatorów (Narishige) na mikroskop odwrócony, takich jak Nikon TE200. Mikromanipulatora piezo (Primetech) jest używana do wiercenia osłonki przejrzystej. Płaskiego wyłuszczenie i pipety przenieść można kupić Humagen. Oczyścić i nasmarować pipety wyłuszczenie w PVP spada o wydaleniu mikroskopijnych kropelek rtęci i aspiracji i wydalenia PVP. Aby zapobiec lepkości igły, sama procedura powinna być wykonywana między każdej grupy komórek jajowych, które są enukleowanym lub przeniesione. Miejsce małej grupy komórek jajowych do HCZB-cytochalazyna spadek B. Wielkość grupy powinna być dostosowana do poziomu doświadczenia badacza. Oocytów nie powinny być trzymane na scenie dłużej niż 20-30 min. Przenieś instrumenty HCZB-cytochalazyna B kropli. Gospodarstwa pipety pipety wyłuszczenie powinny zostać dostosowane do dostosowania się do płaszczyzny równikowej z komórki jajowej. Będzie to możliwe, jeżeli w gospodarstwie pipety ma zewnętrzną średnicę, która jest nieco mniejsza niż się komórki jajowej. Obracanie oocytów do inaczej załamania wrzeciona metafazy widać. Jeśli początkujący nie widać wrzeciona, metafazy płyty można zidentyfikować przy użyciu DNA barwnika Hoechst i oświetlenie UV, jednak, że nie jest zgodne z zasadami efektywności rozwoju embrionalnego. Umieść metafazy wrzeciona godzinie 3 i przytrzymać go dobrze z pipety gospodarstwa. Zastosuj impulsów piezo do penetracji osłonki przejrzystej. Dotknij metafazy płyta z pipety wyłuszczenie. Po opór wrzeciona metafazy może być &quot;czuł&quot;, odciągnąć wrzeciona i wyciągnąć igłę. Cytoplazmie oocytu jest płynna, trzpień metafazie jednak porusza się w gąszczu przy dotknięciu z pipety. Spróbuj zmniejszyć ilość cytoplazmy, która została usunięta z wrzecionem. Po grupy oocytów został enukleowanym, umyć je przez pożywce zarodków i umieścić je w inkubatorze do transferu. Niektóre enukleowanym oocytów nie powinny zostać przeniesione, ale powinno być aktywowane i służą jako kontrola wyłuszczenie. Te oocytów będzie fragment ciągu kilku godzin, co oznacza udane wyłuszczenie. Transfer jądra Komórek miejsce w PVP rozwiązanie (11% PVP w HCZB). Jeśli wielu klonów aresztowania na etapie 1-komórek, stężenie PVP powinna zostać obniżona do 5% lub mniej. Komórek Mix oraz with PVP. Zebrać komórki za pomocą pipety o średnicy wewnętrznej nieco mniejszej niż średnica komórki. Błonę komórki powinien się na aspiracje. W niektórych przypadkach powtarzających się wydalenia i aspiracji, a także stosowanie delikatnych impulsów piezo może być używany do rozbijania komórek dawcy. Nowy spadek komórek dawcy powinny być z każdej grupy komórek jajowych zostało przeniesione, jak komórki dawcy stają się lepkie, po pewnym czasie. Wstrzyknąć podzielone komórki dawcy wkrótce po zerwaniu membrany. Transferu, skupić się na płaszczyźnie równikowej z oocytu się zamiast płaszczyzny równikowej warstwy przejrzystej i ustaw transfer i pipety gospodarstwa w tej samej płaszczyźnie. Trzymaj oocytów w tym część jej cytoplazmy mocno. Penetracji osłonki przejrzystej za pomocą impulsów piezoelektrycznych. Doprowadzić jądra dawcy do końcówki pipety, a następnie naciśnij końcówki pipety niemal do przeciwnej stronie enukleowanym oocytów, blisko pipety gospodarstwa, co głęboka bruzda w oocytu. Nabrać niewielką ilość cytoplazmy komórki jajowej do pipety, zastosować jeden słaby puls piezo do przerwania błony komórki jajowej, wysuwa jądra dawcy, wyciągnąć igłę szybko podczas zasysania w błonie cytoplazmatycznej na prawej stronie bruzdy. Przez jednoczesne wycofanie igły i aspiracji, powinno być możliwe, aby zamknąć otwór pozostawiony przez NT. Ta &quot;technika usuwania otwór zmniejszy liczbę komórek jajowych, które lizy w NT. Umyć zrekonstruowany oocytów w KSOM i zwrócić je do inkubatora przez 1-3 godzin. Aktywacja oocytów Przygotuj połowę naczynia z kropelek wapnia wolne MCZB, a druga połowa z kropelkami wapnia wolne MCZB oraz 10 mM Sr 2 + oraz 5 μ g / ml cytochalazyna B hamuje polarnych wyciskanie ciała. Równowagi przez 30 min. poniżej 5% CO 2 w powietrzu. Umyć zarodków NT oraz w wolne od wapnia MCZB a następnie umieścić je w małych grupach w różnych kropli jonów wapnia MCZB. Powrót naczynie do inkubatora i kultury przez 5-6 godzin. Do kontroli sztucznego protokołu aktywacji i warunków hodowli zarodków, nie enukleowanym oocytów powinny być stosowane. Będą rozwijać się jako zarodki partenogenetyczne. Po aktywacji, myć embrionów poprzez KSOM i miejsce zarodków w inkubatorze do hodowli długoterminowej. Przedjądrzy powinny być widoczne w tym czasie, co wskazuje na udany transfer. Pożywki zarodka Cookbook Sole Mistrza Zacznij 980 ml ​​ultra H 2 O w sterylnych 1 butelka L Dodaj suche składniki: NaCl 4760 mg (81mm) Sigma S-5886 KCl 360 mg (5 mM) Sigma P-5405 MgSO 4 • 7H 2 O 290 mg (1.18mM) Sigma M-2773 KH 2 PO 4 160 mg (1.17mM) Sigma P-5655 EDTA 2na 40 mg (0,1 mm) Sigma E-6635 Glukozy (D) 1000 mg (5,5 mm) Sigma G-6152 Dodaj płynnych składników Na-mleczan (kwas mlekowy) 5,3 ml &amp; nbsp; Sigma 44263 Pen&#39;Strep 10 ml Gibco 15140-122 Na Sole MCZB fotografii: Filtr sterylizacji 500 ml soli mistrza (dobry na 3-4 miesięcy; przechowywać w temperaturze 4 ° C) Na Sole HCZB fotografii: Start z 500 ml soli mistrza Dodać 50 mg PVA (na zimno rozpuszczalny; Sigma P-8136) Mieszać przez 30-60 min i (dobre 3 miesiące; przechowywać w temperaturze 4 ° C) sterylny filtr Ca + + Darmowe MCZB (do aktywacji oocytów w 5% CO 2) Start z 99 ml soli MCZB ręki Dodaj suche składniki: NaHCO3 211 mg Sigma S-5761 Na-pirogronian (kwas pirogronowy) 3 mg Sigma P-4562 L-glutamina 15 mg Sigma G-8540 Albuminy surowicy wołowej (BSA) 500 mg Sigma-3311 Swirl, aż wszystkie składniki są rozpuszczone, sterylny filtr. HCZB (do mikromanipulacji w otaczającej atmosferze) Start z 99 ml soli HCZB ręki Dodaj suche składniki: Hepes-Na 520 mg Sigma H-3784 NaHCO3 42 mg Sigma S-5761 Dodaj płynnych składników: 128 mM CaCl2 (18.8g / l) 1 ml Sigma C-7902 Doprowadzić pH do 7.5 za pomocą 1 N HCl Swirl aż do rozpuszczenia, sterylny filtr.

<ol><li>Eggan, K., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEggan%2C+K+%22Mammalian+and+Avian+Transgenesis-+New+Approaches%22">Mammalian and Avian Transgenesis- New Approaches</a>. Pease, S., Lois, C. , Springer. (2006).</li>
<li>Nagy, A., Gertsenstein, M., Vintersten, K., Behringer, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo%22">Manipulating the mouse embryo</a>. Press, C. S. H. L. , (2003).</li>
<li>Wakayama, T., Perry, A. C., Zuccotti, M., Johnson, K. R., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-term+development+of+mice+from+enucleated+oocytes+injected+with+cumulus+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei.</a> Nature. 394, 369-374 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Prosimy sprawdzić dodatkowe bufory kompozycje w części protokołu.

transfer jądra do komórki jajowej myszy

Nuclear Transfer into Mouse Oocytes

Transfer jądra do zapłodnione komórki jajowej może przywrócić potencjału rozwojowego do zróżnicowanych komórek. To pokazuje, że procesy leżące u podstaw rozwoju, różnicowania i starzenie się są epigenetyczne, a nie genetyczne procesy. Odwracalności tych procesów otwiera ekscytujące perspektyw w zakresie badań podstawowych, a w bardziej odległej przyszłości, w medycynie regeneracyjnej. U myszy, embrionalnych komórek macierzystych mogą być uzyskane ze sklonowanych zarodków etapie preimplantacyjnej. Takie embrionalne komórki macierzyste mają zdolność do prowadzić do wszystkich typów komórek dorosłego organizmu. Co ważne, te komórki są genetycznie identyczne z dawcą. Jeśli zastosowanie do człowieka, pozwoli na wyprowadzenie komórek macierzystych od pacjenta. Komórki te mogą następnie być zróżnicowane w których to dotyczy typ komórek pacjenta oraz badania in vitro, lub stosowane w celu zastąpienia uszkodzonych lub brakujących ogniw. Badanie transfer jądra u myszy pozostaje istotne, ponieważ mogą nas informować o zasadach jądrowej przeprogramowania. Ten film i towarzyszący mu protokół mają pomóc nauki transfer jądra u myszy, metoda opracowana początkowo w grupie prof Yanagimachi (Wakayama et al. 1998).

Ten film i protokół mają pomóc nauki transfer jądra.

Transfer jądra do komórki jajowej myszy

Transfer jądra do niezapłodnionej oocyty może przywrócić potencjał rozwojowy zróżnicowanej komórce. Dowodzi to, że procesy leżące u podstaw...

Przeprowadzamy transfer jądra (NT), ponieważ nasza grupa interesuje się reprogramowaniem. Jest to fascynujący proces, w którym zróżnicowane jądro może zostać reprogramowane do stanu embrionalnego. Tutaj znajdują się odczynniki SUM i HCCV, a tutaj hialuronidaza.Najpierw przygotowuję naczynie, które zostanie umieszczone w inkubatorach w celu wyrównania poziomu CO2. Są to krople, kilka kropel dla Turinga, pokrytych olejem mineralnym. Służą one do kalibracji atmosfery CO2.Teraz należy przygotować kroplę HCZB. Będzie ona służyć do płukania. Jest ona gęsta w dzień i ponownie pokryta tym olejem mineralnym.Ten poziom obniża się w obecności hialuronidazy. Ta część tutaj to jedynie krople HCCP. Służą one do przemywania.Służy to do usuwania komórek ulu ze strony O. Ta platforma jest podgrzewana, więc będzie się nagrzewać do czasu, aż wrócę po próbki oleju od myszy i pokryję wszystko olejem mineralnym. Tutaj znajdują się krople PVP do czyszczenia igły oraz do przenoszenia komórek, a to jest HCCB plus Cyla B. I tutaj będę przeprowadzać manipulacje.Dobrze, tutaj mamy kolor igły. Teraz wyciągam igłę. Dobrze, mam teraz bardzo dobrą igłę, bardzo cienką.A tutaj znajduje się mikrokuźnia. Muszę odciąć igłę w odpowiednim miejscu, aby uzyskać pipetę trzymającą o właściwym rozmiarze. Podgrzewam szklaną kuleczkę, opuszczam igłę, aż się do niej stopi, a następnie ją odłamuję.Odsuwam to. Widzą Państwo, że złamana igła jest idealna. Teraz schodzę tutaj i zwiększam temperaturę.Teraz szklana kulka zmieni kolor na czerwony i zacznie się topić; naciskając ją, uformujemy krzywiznę. To wystarczy. Usuwam ją.Jak widać, następnie wprowadzam igłę. Właśnie zamocowaliśmy pipetę trzymającą w tym uchwycie. Teraz należy ponownie umieścić ją w mikroskopie.Mikropipeta, kapilara i załadowana rtęcią. Załadowałem ją do tej końcówki. Napełnij tę kapilarę rtęcią.Wprowadź to do środka. Umieść igłę tutaj, w tym uchwycie. Mocno dokręć, a następnie wycofaj.Obrócenie w prawo przesunie rtęć tutaj do przodu, tak aby była widoczna. A teraz wkładam końcówkę do oleju. Widzicie? Teraz przesuwam igłę w dół, aby uzyskać widoczność.Wypuść kilka kropli rtęci i zaciągnij nieco QVP. To w porządku. Następnie przesuń je ponownie w górę.Udaję się do HCCB i schodzę w dół otworu. Moja głowica trafia do P, czyli pipety do myszy. Muszę przygotować kapilarę, aby wstawić ją tutaj. Dziękuję. Już jest. Dobrze.Zatem przygotujmy kapilary. Dobrze. I w rurce. Jestem ley.Przyjechałem ze Szwajcarii i rozpocząłem tę pracę rok temu, kiedy trafiłem do laboratorium K, gdzie zacząłem uczyć się transferu jąder komórkowych. To naprawdę wspaniałe miejsce i praca tutaj jest ogromną przyjemnością. Oczywiście jest to bardzo złożony eksperyment i podczas jego przeprowadzania mogą pojawić się liczne problemy.Zatem na początku mogą wystąpić problemy, takie jak lizy wielu komórek podczas nukleacji lub przenoszenia. Może się również zdarzyć, że mimo pomyślnego przeniesienia, komórki nie rozwijają się. Przyczyn tego stanu rzeczy może być wiele.Mam na myśli to, że można zacząć od systemu hodowli we wszystkich miejscach. Zawsze potrzebne są pewne kontrole, takie jak elementy kontroli genetycznej lub zapłodnione embriony, aby przetestować system hodowli oraz inkubatory. Następnie należy również doskonalić umiejętności obsługi mikroskopu.Wymaga to po prostu dużej wprawy, aby móc niezawodnie wykonać inokulację boczny i następnie przenieść kulturę z powrotem. Jest to kwestia praktyki i zajmie to kilka tygodni lub miesięcy, aż opanujecie tę technikę. W pozostałym zakresie układ jest gotowy do długotrwałych eksperymentów.Warto zatem zarezerwować na to cały dzień. Kolejnym trudnym elementem na początku jest pipetowanie mysie. Należy unikać tworzenia pęcherzyków powietrza, aby zachować pełną kontrolę i nie stracić nadzoru, a przede wszystkim, by nie uszkodzić klonu. Jest to szczególnie istotne, ponieważ zewnętrzna warstwa, czyli sonarlucita, jest otwarta, więc podczas pipetowania można uszkodzić klon, co może spowodować jego wyciek z tej warstwy sonarlucita.Należy zatem uważać, aby w rurce doprowadzającej nie znalazł się olej. Nie wolno zbyt mocno ssać ani zbyt mocno dmuchać, jednak umiejętność ta jest stosunkowo łatwa do opanowania.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Wykazujemy tutaj, że przeprogramowanie epigenetyczne za pomocą transferu jąder komórek somatycznych (SCNT) może być wykorzystane jako narzędzie do tworzenia modeli mysich o zdefiniowanych specyficznościach receptorów limfocytów T (TCR). Myszy transjądrowe te wykazują ekspresję odpowiadającego TCR z ich locus endogennego pod kontrolą promotora endogennego.

Myszy transnuklearne o zdefiniowanej specyficzności receptorów limfocytów T przeciwko Toxoplasma gondii uzyskane poprzez SCNT

Oocyty są podatne na aneuploidię z powodu błędów w segregacji chromosomów podczas dojrzewania meiotycznego. Aneuploidne komórki jajowe mogą prowadzić do niepłodności, poronień lub zaburzeń rozwojowych, takich jak zespół Downa. W niniejszej pracy opisujemy metody wprowadzania wybranych materiałów do oocytów oraz metody badania dojrzewania meiotycznego i oceny ploidii.

Mikroiniekcja, dojrzewanie i ocena ploidii oocytów mysich

Ten film opisuje wstrzyknięcie projądrkowe wektorów lentiwirusowych do przestrzeni okołokomórkowej zapłodnionego zarodka myszy. Lentiwirus zawiera transgen, który jest włączany do genomu zapłodnionego zarodka, ostatecznie dając początek transgenicznym myszom.

Wstrzyknięcie periviteliny opartej na wektorze lentiwirusowym: metoda transdukcji interesującego genu do zapłodnionych jednokomórkowych oocytów myszy

Tutaj prezentujemy protokół charakterystyki oocytów antralnych myszy na podstawie organizacji jąder.

Izolacja i charakterystyka mysich oocytów antralnych na podstawie organizacji chromatyny jąderkowej

Opisujemy znacznie ulepszoną metodę klonowania myszy przy użyciu trichostatyny A, witaminy C i dejonizowanej albuminy surowicy bydlęcej. Pokazujemy uproszczony, powtarzalny protokół, który wspiera efektywny rozwój sklonowanych zarodków. W związku z tym ta metoda może stać się standardową procedurą klonowania myszy.

Skojarzone leczenie trichostatyną A i witaminą C poprawia skuteczność klonowania myszy poprzez transfer jądra komórki somatycznej

W miarę jak warianty genetyczne związane z chorobami ludzkimi zaczynają być odkrywane, coraz ważniejsze staje się opracowanie systemów, za pomocą których można szybko ocenić biologiczne znaczenie tych zidentyfikowanych wariantów. Protokół ten opisuje metody oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy żeńskiej I przy użyciu mysich oocytów.

Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Przedstawiono zoptymalizowany protokół, który umożliwia wyczerpanie cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy podczas metafazy I za pomocą lasera femtosekundowego bliskiej podczerwieni.

Wielofotonowa ablacja laserowa cytoplazmatycznych centrów organizowania mikrotubul w oocytach myszy

Błąd w segregacji chromosomów jest powszechną cechą oocytów. Dlatego badanie punktu kontrolnego montażu wrzeciona daje ważne wskazówki na temat mechanizmów potrzebnych do produkcji zdrowych jaj. Niniejszy protokół opisuje trzy uzupełniające się testy do oceny integralności punktu kontrolnego montażu wrzeciona w oocytach myszy.

Ocena integralności punktu kontrolnego zespołu wrzeciona w oocytach myszy

Ten protokół dostarcza eksperymentalnych ram do dokumentowania fizycznego wpływu cytoszkieletu na kształt jądra i wewnętrzne organelle pozbawione błony w układzie oocytów myszy. Struktura może być dostosowana do użycia w innych typach komórek i kontekstach.

Uchwycenie mieszania jądra oocytu myszy na podstawie cytoszkieletu w różnych skalach przestrzennych

Niniejszy protokół przedstawia technikę izolowania oocytów lub embrionów na wczesnym etapie rozwoju z jajowodu myszy. Umiejętność zidentyfikowania lejka jajowodu oraz wprowadzenia do niego igły z tępym końcem jest niezbędna do prawidłowego przeprowadzenia tej procedury.

Pozyskiwanie oocytów mysich

Poznaj technikę transferu jądra do komórki jajowej myszy w celu reprogramowania zróżnicowanego jądra do stanu embrionalnego. Ta metoda jest kluczowa dla badań nad komórkami macierzystymi i medycyną regeneracyjną.

Transfer jądra do komórki jajowej myszy

Przeglądaj więcej filmów