Filtracja o dużej objętości (20L+) przybrzeżnych próbek wody morskiej

Cześć, nazywam się David Walsh i pracuję w laboratorium Stevena Hallama na Wydziale Mikrobiologii i Immunologii na Uniwersytecie Bridge Columbia. Dzisiaj pokażemy Ci procedurę filtrowania dużych ilości wody morskiej pod kątem biomasy mikrobiologicznej. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania różnorodności mikrobiologicznej w środowisku morskim.

Więc zacznijmy. Aby skonfigurować aparat filtrujący, użyj pęsety, aby umieścić filtr GFD klasy w jednostce obudowy filtra wstępnego. Luźno dokręć obudowę ręcznie.

Z reguły nie dokręcaj zbyt mocno, bo urządzenie będzie przeciekać. Po rozpoczęciu pompowania załóż nasadkę gąsienicy na nasadkę autoklawu i przymocuj rurkę, ostrożnie wkładając wewnętrzną rurkę do samochodu, nie dotykając jej. W razie potrzeby użyj pęsety, aby wprowadzić rurkę do samochodu.

Następnie dokręć nakrętkę, przepuść zewnętrzną rurkę przez pompę perystaltyczną. Przymocuj obudowy filtra wstępnego do końca obu rurek zewnętrznych. Dokręć połączenie szczypcami, aby rozpocząć filtrowanie wody morskiej.

Włącz pompę i ustaw prędkość przepływu na jeden zegarek, aby upewnić się, że woda jest pompowana we właściwym kierunku. Pozwól, aby 500 mililitrów wody swobodnie przepływało przez jednostkę filtra wstępnego do jednolitrowej zlewki. Wyłącz pompę i przymocuj filtr Stax do złączki męskiej przynęty na wolnym końcu zestawu filtra wstępnego.

Ręcznie dokładnie dokręć obudowę filtra wstępnego. Uważaj na nieszczelności na obudowie filtra wstępnego oraz na połączeniu między obudową filtra wstępnego a przewodem prowadzącym do samochodu. Chłopcze, jeśli wystąpią nieszczelności, wyłącz pompę i odpowiednio poluzuj i ponownie dokręć obudowę filtra wstępnego, ponownie włącz pompę.

Zebrać filtrat do czterolitrowych kolb. Gdy będą pełne, opróżnij kolby do czystego balonu. Pamiętaj, aby zanotować objętość przepuszczoną przez każdy zebrany filtr.

Filtrat może być dalej przetwarzany, np. jako filtracja w poszukiwaniu wirusów. Kontynuuj filtrowanie, aż w gąsiorach nie pozostanie woda. Typowe czasy filtracji wahają się od czterech do pięciu godzin na 20-litrowy samochód.

Zależy to jednak w dużej mierze od ilości biomasy w wodzie. Po zakończeniu filtracji wyłącz pompę i odłącz filtry Stax. Do przechowywania filtrów.

Najpierw usuń pozostałą wodę za pomocą strzykawki o pojemności od 30 do 60 mililitrów. Za pomocą pipety dodaj 1,8 mililitra buforu do lizy do filtra, zachowując około 200 mikrolitrów miejsca w filtrze. W przypadku późniejszej edycji odczynników uszczelnij dolną i górną część filtra stex małym kawałkiem folii para, a następnie oznacz filtry datą i identyfikacją próbki.

Przechowuj filtry we wstępnie oznaczonej 50-mililitrowej tubie Falcon w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Wyjmij filtry z obudowy i umieść je w oznaczonych 50-mililitrowych probówkach Falcon zawierających dwa mililitry buforu do lizy. Przechowuj je w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

W celu ostatecznego oczyszczenia umieść rurkę, która znajdowała się wewnątrz samochodu, w kolbie zawierającej 0,1 molowego kwasu solnego. Rurkę prowadzącą do czterolitrowej kolby należy skierować do oryginalnego samochodu. Włącz pompę i uruchom ją trzy, zbierając przepływ w oryginalnym samochodzie.

Na koniec przepłucz rurkę wodą z autoklawu. W każdym 20-litrowym samochodzie znajdują się dwa filtry Stax, z których każdy zawiera biomasę mikrobiologiczną w zakresie wielkości od 0,22 do 2,7 mikrona z około 10 litrów wody morskiej. Ponadto zbierana jest biomasa o wielkości większej niż 2,7 mikrona i koncentrowana na filtrach wstępnych GFD.

Te filtry i filtry wstępne są przechowywane w buforze do lizy i są gotowe do ekstrakcji DNA. Jeśli zostaną podjęte dodatkowe etapy przetwarzania, przepływ 0,2 mikrona może zostać skoncentrowany w dół, aby zebrać również frakcję wirusową. Właśnie opisaliśmy metodę pompowania perystaltycznego do filtracji dużej objętości biomasy planktonowej o średnicy od 0,22 mikrona do 2,7 mikrona.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby po użyciu wytrzeć ławki i pompy wilgotnym ręcznikiem, aby usunąć pozostałą słoną wodę. W przeciwnym razie mogą powodować korozję sprzętu. Chociaż procedura jest prosta, wymagania czasowe mogą być znaczne w zależności od stężenia biomasy lub zanieczyszczeń w filtrowanej próbce.

Więc to wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.