Name: Proteomika w celu identyfikacji białek oddziałujących z kanałami kationowymi bramkowanymi ligandem P2X2 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-18T23:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 36 s
Description: Poznaj metodę proteomiki do identyfikacji białek oddziałujących z C-koncem receptora P2X2 przy użyciu techniki pull-down i spektrometrii mas. Protokół ten umożliwia badanie sygnalizacji receptorów P2X w mózgu szczura.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SW i TMV są wspierani przez NCRR oraz NHLBI w ramach National Institutes of Health. BSK i HS są wspierani przez NINDS i NIGMS w ramach National Institutes of Health.

PROCEDURY EXPERYMENTALNE
Procedura doświadczalna (Rys. 2) składa się z czterech części, które opisano poniżej w formie krok po kroku.
Część 1: Subklonowanie i ekspresja C-końca receptorów P2X2.
Wyeksprymowaliśmy pełną długość końca C receptorów P2X2 w bakteriach, aby zidentyfikować białka mózgowe, z którymi one wiążą.
<ol>
	<li>Koniec C (reszty 353-472) receptora P2X2 (Rys. 1) został namnożony metodą PCR, sklonowany do wektora pGEX 4NT1 (GE Life Sciences) i zweryfikowany poprzez sekwencjonowanie.</li>
	<li>Rekombinowany plazmid przetransformowano do szczepu E. coli (BL21) w celu ekspresji białek rekombinowanych.</li>
	<li>Zamrożone w glicerolu zapasy bakterii (E. coli BL21) zawierających plazmid P2X2 CT-GST zostały pobrane za pomocą sterylnej końcówki pipety i zaszczepione w 5 ml pożywki Luria-Bertani (LB) z odpowiednim markerem selekcyjnym (50 µg/ml ampicyliny), a następnie inkubowane przez noc w inkubatorze orbitalnym w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Kultury wyhodowane przez noc zaszczepiono do 250 ml pożywki LB z odpowiednim antybiotykiem (50 μg/ml ampicyliny) i inkubowano w inkubatorze orbitalnym przy 250 rpm przez 2-3 h w 37°C, aż gęstość optyczna przy 600 nm osiągnęła wartość ~ 0.6-0.7.</li>
	<li>Kulturę indukowano 1 mM IPTG i inkubowano dalej w 37°C przez 3 h w celu ekspresji białka.</li>
	<li>Kulturę wirowano następnie przy 5000 g przez 15 min w 4°C (1 ml kultury zachowano do analizy poziomu ekspresji i oznakowano jako „indukowana”). Nadnadkład odlano, a osad resuspendowano w 20 ml buforu Saline Tris-EDTA (STE) (10 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA pH 8.0).</li>
	<li>Suspensję wirowano przy 5000 g przez 15 min w probówce typu Falcon 50 ml. Nadnadkład odlano, a półsuchy osad zamrożono w -70°C przez noc.</li>
	<li>Osad z -70°C resuspendowano w 40 ml lodowatego buforu do lizy (2% (w/v) sarkosylu, 15 mg lizozymu, 150 mM NaCl, 50 mM Tris pH7.5, 5 mM DTT oraz tabletka kompleksowego inhibitora proteaz), a suspensję inkubowano na lodzie przez 30 min. Podczas tej inkubacji 3 ml kulek Glutathione–Sepharose 4B przemyto 20 ml buforu fosforanowo-solnego (PBS) oraz 20 ml T-PBS (0.1% (v/v) Triton X-100 w PBS), a następnie ponownie PBS. Kulki resuspendowano w 1 ml PBS.</li>
	<li>Suspensję bakteryjną zamrażano i rozmrażano 3 razy w ciekłym azotcie, a następnie sonikowano (1 s włącz/wyłącz, 30 mikronów przez 3 min na lodzie) i inkubowano dalej przez 30 min na lodzie z dodatkiem 4% (v/v) Triton X-100, 10 mM MgSO4 i 2 mM ATP.</li>
	<li>Lizat wirowano przy 20000 g przez 15 min w 4°C i odrzucono osad (próbkę z osadu oraz 1 ml nadnadkładu zachowano do elektroforezy SDS-PAGE w celu oceny ilości białek w cytosolu i błonach). Nadnadkład inkubowano z kulkami przez 1 h (lub przez noc) w 4°C.</li>
	<li>Kulki wirowano przy 500 g przez 5 min i odlano nadnadkład (próbkę zachowano jako frakcję nie związaną). Kulki przemyto pięciokrotnie buforem T-PBS (popłuczyny zachowano jako kontrole płukania).</li>
	<li>Kulki resuspendowano następnie w PBS, aby uzyskać zawiesinę 50% (w/v), i przechowywano w lodówce w 4°C do czasu użycia. Stężenie białka oszacowano metodą Bradforda (zgodnie z instrukcjami producenta).</li>
</ol>
Część 2: Przygotowanie lizatów całego mózgu
 wiadomo, że receptory P2X2 są w dużym stopniu ekspresowane w mózgu8. W niniejszych analizach dążyliśmy do zidentyfikowania białek oddziałujących z receptorami P2X2 z lizatów całego mózgu szczura (Ryc. 3).
<ol>
	<li>Pobrano mózg dorosłego szczura (zwierzęta zostały uśpione zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez UCLA IAACUC oraz zgodnie z wytycznymi NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals) i niezwłocznie przepłukano lodowatym PBS (3X).</li>
	<li>Aby zlizować komórki, do pobranego mózgu dodano 10 ml (~5-krotność masy mokrej pobranego mózgu) lodowatego buforu do lizy zawierającego 150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 10 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM PMSF, 5 μg/ml leupeptyny, 1% (v/v) NP-40 oraz tabletkę z koktajlem inhibitorów proteaz.</li>
	<li>Tkankę mózgową homogenizowano na lodzie za pomocą szklanego homogenizatora Dounce'a do uzyskania mieszaniny o jednorodnej konsystencji.</li>
	<li>Lizat komórkowy wirowano przy 2000 g przez 5 minut w celu usunięcia nielizowanych komórek. Zebrano supernatant i ponownie wirowano go przy 29000 g przez 60 minut, aby usunąć nienaruszone organella i agregaty błonowe.</li>
	<li>Niezwłocznie po wirowaniu supernatant przeniesiono do czystej probówki. Stężenie białka w całkowitym lizaie mózgu zmierzono za pomocą metody Bradforda (zazwyczaj ~15 mg/ml).</li>
	<li>Lizat podzielono na alikwoty i przechowywano w temperaturze -70°C.</li>
</ol>
Część 3: Izolacja białek związanych z końcem C receptora P2X2
W celu zidentyfikowania partnerów wiążących P2X2 CT-GST z lizatów całego mózgu przeprowadzono test pull-down, wykorzystując CT-GST unieruchomiony na kuleczkach sepharose 4B z glutationem jako przynętę. Jako kontrolę zastosowano same kuleczki z wiążącym się GST.
<ol>
	<li>Lizat mózgu poddano wstępnemu oczyszczaniu za pomocą kulek GST przez 1 h w 4°C. Osad odrzucono, a supernatant wykorzystano do dalszych analiz.</li>
	<li>Równe ilości GST oraz P2X2 CT-GST (10 μg) związanych z kulkami sepharose 4 B z glutationem inkubowano przez noc z 100 µg wstępnie oczyszczonych, solubilizowanych białek z lizatu całego mózgu szczura, w buforze do lizy, przy stałym obracaniu w 4°C.</li>
	<li>Kulek wirowano przy 1000 g przez 5 min, a następnie odrzucono supernatant.</li>
	<li>Kulek przemyto raz buforem do lizy i gotowano w zmodyfikowanym buforze Laemmliego [4% (w/v) SDS, 10% (v/v) 2-merkaptoetanolu, 2% (v/v) glicerolu, 0,004% (w/v) błękitu bromofenolowego i 0,125 M TrisCl pH 6,8] przez 5 min.</li>
	<li>Próbki wirowano przy 5000 g przez 5 min, a supernatant rozdzielono za pomocą 10% SDS-PAGE (Ryc. 4). Żele barwiono barwnikiem do białek SYPRO® Ruby (zgodnie z instrukcją producenta) i wizualizowano w świetle ultrafioletowym. Białka powiązane z P2X2 CT porównano z białkami odzyskanymi przy użyciu GST-null jako przynęty. Wykonano cztery powtórzenia biologiczne (tj. cztery mózgi i cztery niezależne próby pull-down).</li>
</ol>
Część 4: Identyfikacja białek.
Białka rozdzielone za pomocą elektroforezy żelowej wycięto z żelu i zidentyfikowano metodą spektrometrii mas12. Uwaga: brak kurzu w całym procesie jest kluczowy dla ograniczenia zanieczyszczenia keratyną. Osoba przeprowadzająca eksperyment powinna przez cały czas nosić maseczkę ochronną, siatkę na włosy oraz rękawiczki i nigdy nie powinna dotykać interesującego obszaru żelu bez użycia rękawiczek.
<ol>
	<li>Wszystkie widoczne prążki białkowe odzyskane z pull-downu P2X2 wycięto czystym ostrzem żyletki i posiekano (Rys. 4). Odpowiadające im obszary żelu w ścieżce pull-downu GST-null również wycięto w ten sam sposób, niezależnie od barwienia prążków (wycięto i zidentyfikowano również prążki specyficzne dla przynęci GST-null), aby upewnić się, że nie pominięto białek znajdujących się poniżej progu czułości barwienia.</li>
	<li>Fragmenty żelu inkubowano z 200 μl 50 mM wodorowęglanu amonu w 50% (v/v) acetonitrylu (ACN), a probówki mieszano na wortexu przez 15 min w RT. Krok płukania ten powtórzono.</li>
	<li>Fragmenty żelu odwodniono, dodając 200 μl acetonitrylu (fragmenty żelu powinny się skurczyć i stać się nieprzezroczyste).</li>
	<li>Acetonitryl usunięto, a fragmenty żelu wysuszono w speedvacu przez ok. 10 min.</li>
	<li>Fragmenty żelu inkubowano następnie z 30 μl świeżo przygotowanego roztworu 10 mM DTT/10 mM Tris (2-karboksyetylo)fosfinianu sodu (TCEP) w objętości wystarczającej do zanurzenia fragmentów. Inkubację prowadzono przez 30 min w kąpieli wodnej o temperaturze 56°C.</li>
	<li>Następnie roztwór DTT zastąpiono 100 μl 500 mM roztworu wodorowęglanu amonu w 50% acetonitrylu, a plastry żelu przemyto wodorowęglanem amonu.</li>
	<li>Roztwór płuczący odessano i dodano 200 μl acetonitrylu w celu odwodnienia żeli.</li>
	<li>Następnie usunięto acetonitryl i dodano 100 μl świeżo przygotowanego 100 mM roztworu jodoacetamidu w celu alkilacji wolnych grup sulfhydrylowych. Ten etap trwał 25 min w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Roztwór jodoacetamidu usunięto, a fragmenty żelu przemyto 200 μl 50 mM wodorowęglanu amonu w 50% acetonitrylu (pH 8,0) przez 2 min podczas mieszania na wortexu. Krok płukania ten powtórzono.</li>
	<li>Po usunięciu roztworu płuczącego fragmenty żelu inkubowano z 200 μl acetonitrylu, który następnie usunięto w speedvacu przez ok. 10 min.</li>
	<li>Na tym etapie fragmenty żelu są gotowe do trawienia trypsyną. Fragmenty żelu inkubowano w 30 μl roztworze trypsyny (stężenie robocze 20 ng/μL) i pozostawiono na lodzie przez 10 min, aby żele dobrze spęczniały. Nadmiar trypsyny usunięto, a rehydratyzowane cząstki żelu pokryto 30 μl 50 mM wodorowęglanu amonu, aby pozostały zanurzone przez cały proces trawienia, który trwał od 12 do 16 godzin w temperaturze 37°C.</li>
	<li>Dodano 5 μl 5% (v/v) kwasu mrówkowego, aby zdezaktywować trypsynę i przerwać trawienie.</li>
	<li>Probówki mieszano na wortexu przez ok. 15 min i krótko wirowano, aby ciecz zebrała się na dnie probówki, którą następnie przeniesiono do czystej i opisanej fiolki o pojemności 0,5 ml.</li>
	<li>Następnie do fragmentów żelu dodano 30 μl 0,1% (v/v) kwasu mrówkowego w 50% acetonitrylu, tak aby były ledwo zakryte, a następnie dwukrotnie mieszano na wortexu przez 10–15 min, oddzielając te cykle krótkim wirowaniem. Ten krok powtórzono raz, wymieniając mieszaninę kwasu mrówkowego i acetonitrylu pomiędzy etapami.</li>
	<li>Końcową ciecz usunięto, a cały roztwór ekstrakcyjny połączono w jednej fiolce. Objętość zredukowano do ok. 30 uL w speedvacu. Próbka była teraz gotowa do nano-chromatografii cieczowej w fazie odwróconej i identyfikacji białek za pomocą spektrometrii mas. W tym konkretnym przykładzie etap ten przeprowadzono na tandemowym spektrometrze mas Orbi-trap firmy ThermoFisher (wybranym ze względu na wysoką dokładność masy, szybki cykl pracy w detekcji białek i ogólnie solidne cechy eksploatacyjne), choć inne modele i instrumenty różnych producentów mogłyby zostać łatwo zastosowane w opisanej do tego momentu procedurze.</li>
	<li>Poniżej krótko przedstawiono szczegóły i kryteria analiz spektrometrycznych. Wszystkie peptydy rozdzielono za pomocą nano-LC w fazie odwróconej (Eksigent) i nałożono na kolumnę C18 w fazie odwróconej przy szybkości przepływu 3 μl/min. Faza ruchoma A stanowiła 0,1% kwasu mrówkowego i 2% ACN w wodzie; faza ruchoma B stanowiła 0,1% kwasu mrówkowego i 20% wody w ACN. Peptydy eluoowano z kolumny przy szybkości przepływu 220 nl/min, stosując gradient liniowy od 5% B do 50% B w ciągu 90 min, następnie do 95% B w ciągu 5 min, a na koniec utrzymując stałe 95% B przez 5 min. Widma pozyskano w trybie zależnym od danych (data-dependent), wykorzystując Orbi-trap do skanów MS i LTQ do skanów MS/MS. Peptydy zidentyfikowano poprzez przeszukiwanie widm w bazie danych szczura IPI v.3.53 przy użyciu algorytmu SEQUEST zintegrowanego z pakietem oprogramowania Bioworks. Każdy peptyd spełniał następujące kryteria: XCorr ≥2 (+1), ≥3 (+2), ≥4 (+3) oraz DeltaCN&gt;0,1. Wszystkie widma wykorzystane do identyfikacji białek sprawdzono ręcznie; nie zaakceptowano białek, dla których zidentyfikowano mniej niż dwa peptydy. Do dalszych analiz wzięto pod uwagę tylko białka obecne po każdym z czterech pull-downów P2X2 i nieobecne podczas pull-downów GST-null.</li>
</ol>
<img alt="Schemat struktury białka błonowego z końcem N- i C-terminalnym oraz sekwencją aminokwasową." src="/files/ftp_upload/1178/1178fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 1">
Rycina 1. Schematyczna reprezentacja podjednostki receptora P2X2. A. Ilustracja przedstawia topologię podjednostki receptora P2X2. Domena cytozolowa składa się z końców N i C. Końcowa część C receptora P2X2 (kolor czerwony) została wykorzystana jako przynęta w teście pull down. B. Sekwencja aminokwasowa końcowej części C receptora P2X2 wykorzystana w niniejszym badaniu.
<img alt="Schemat oczyszczania białka P2X2; etapy obejmują transformację, lizę oraz spektrometrię mas." src="/files/ftp_upload/1178/1178fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 2">
Rysunek 2. Schemat blokowy i oś czasu protokołu zastosowanego do ekspresji, oczyszczania, pull-down oraz identyfikacji białek. Przedstawiono zarys protokołu wraz z osią czasu. Lizat mózgu dorosłego szczura przygotowano na świeżo bezpośrednio przed przeprowadzeniem testów pull-down.
<img alt="Proces izolacji białek z C-końcem P2X2; schemat rozdziału w żelu, trawienia trypsyną oraz analizy LC/MS/MS." src="/files/ftp_upload/1178/1178fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 3">
Rysunek 3. Schematyczny przedstawienie binarnej analizy proteomicznej sieci końcowego odcinka C receptora P2X2 w mózgu szczura. Do analiz pull-down wykorzystano końcowy odcinek C receptorów P2X2 połączony z białkiem GST, który był związany z kuleczkami GST. Przygotowano lizat mózgu, a następnie białka inkubowano z unieruchomionymi białkami rekombinowanymi. Frakcję niezwiązaną przemyto buforem do lizy. Białka zidentyfikowano za pomocą spektrometrii mas.
<img alt="Żel SDS-PAGE wykazujący prążki białkowe; markery masy cząsteczkowej; analiza białka fuzyjnego GST." src="/files/ftp_upload/1178/1178fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 4">
Rysunek 4. Identyfikacja partnerów wiążących się z końcem C receptorów P2X2. Żel barwiony Sypro wykazujący spektrum domniemanych białek oddziałujących z końcem C receptorów połączonych z GST (niebieska ramka). Przedstawiono również ścieżki kontrolne dla samego GST (żółta ramka) oraz samych kulek sefarozy z glutationem. Strzałki wskazują przykłady unikalnych prążków, które wycięto w celu dalszej analizy metodą spektrometrii mas.

<ol><li>Hille, B. Ion channels of excitable membranes. , 3rd edition, Sinauer Associates Inc. Sunderland Massachusetts, USA. (2001).</li>
<li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+P2X+receptors+and+ATP+signalling+at+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of P2X receptors and ATP signalling at synapses.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 165-174 (2001).</li>
<li>Egan, T. M., Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+calcium+ions+to+P2X+channel+responses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Contribution of calcium ions to P2X channel responses.</a> J Neurosci. 24, 3413-3420 (2004).</li>
<li>Burnashev, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+permeability+of+ligand-gated+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Calcium permeability of ligand-gated channels.</a> Cell Calcium. 24, 325-332 (1998).</li>
<li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li>
<li>Levitan, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+protein+complexes+associated+with+neuronal+ion+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Signaling protein complexes associated with neuronal ion channels.</a> Nat Neurosci. 9, 305-310 (2006).</li>
<li>Khakh, B. S., North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((P2X+receptors+as+cell-surface+ATP+sensors+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">P2X receptors as cell-surface ATP sensors in health and disease.</a> Nature. 442, 527-532 (2006).</li>
<li>Roger, S., Pelegrin, P., Surprenant, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facilitation+of+P2X7+receptor+currents+and+membrane+blebbing+via+constitutive+and+dynamic+calmodulin+binding%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Facilitation of P2X7 receptor currents and membrane blebbing via constitutive and dynamic calmodulin binding.</a> J Neurosci. 28, 6393-6401 (2008).</li>
<li>North, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of P2X receptors.</a> Physiol Rev. 82, 1013-1067 (2002).</li>
<li>Khakh, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+union+of+pharmacology.+XXIV.+Current+status+of+the+nomenclature+and+properties+of+P2X+receptors+and+their+subunits.%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Rev%22%5BJournal%5D)">International union of pharmacology. XXIV. Current status of the nomenclature and properties of P2X receptors and their subunits.</a> Pharmacol Rev. 53, 107-118 (2001).</li>
<li>Young, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+shape%2C+architecture+and+size+of+P2X4+receptors+determined+using+fluorescence+resonance+energy+transfer+and+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Molecular shape, architecture and size of P2X4 receptors determined using fluorescence resonance energy transfer and electron microscopy.</a> J Biol Chem. 283, 26241-26251 (2008).</li>
<li>Edmondson, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+epsilon+signaling+complexes+include+metabolism-+and+transcription%2Ftranslation-related+proteins%3A+complimentary+separation+techniques+with+LC%2FMS%2FMS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C epsilon signaling complexes include metabolism- and transcription/translation-related proteins: complimentary separation techniques with LC/MS/MS.</a> Mol Cell Proteomics. 1, 421-433 (2002).</li>
<li>Evans, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthosteric+and+allosteric+binding+sites+of+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Orthosteric and allosteric binding sites of P2X receptors.</a> Eur Biophys J. 38, 319-327 (2009).</li>
</ol>

Kanały jonowe stanowią główną klasę integralnych białek błonowych. Zawierają one wypełnione wodą pory, które selektywnie umożliwiają ruch jonów wzdłuż ich gradientów elektrochemicznych przez błonę plazmatyczną. Kanały jonowe przełączają się między stanem otwartym a zamkniętym. Etap bramkowania jest wyzwalany przez przekaźniki (np. ATP) w przypadku ligandowo-bramkowanych kanałów jonowych P2X lub może być regulowany poprzez oddziaływania z innymi białkami. W ciągu ostatniej dekady wzrosła nasza wiedza na temat sposobu, w j...

<table><tbody><tr><td>Acetonitryl</td><td>Odczynnik</td><td>JT Baker</td><td>9829-02</td><td></td></tr><tr><td>Akrylamid</td><td>Odczynnik</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0156</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>Odczynnik</td><td>VWR international</td><td>VW1507-01</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan amonu</td><td>Odczynnik</td><td>Fluka</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Persiarczan amonu (APS)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Adenozyno-trifosforan (ATP)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>Odczynnik Bradforda</td><td>Odczynnik</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Błękit bromofenolowy</td><td>Odczynnik</td><td>Fisher Scientific</td><td>B-392</td><td></td></tr><tr><td>Błękit Coomassie R-250</td><td>Odczynnik</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>Sc-24972</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>3860</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA)</td><td>Odczynnik</td><td>VWR international</td><td>VW1474-01</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenoglikolotetraoctowy (EGTA)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8145</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>11670-1</td><td></td></tr><tr><td>Kuleczki Sepharose 4B z glutationem</td><td>Odczynnik</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5132-01</td><td></td></tr><tr><td>Kwas solny (HCl)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl-beta-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15502</td><td></td></tr><tr><td>Jodoacetamid</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Luria-Bertani (LB)</td><td>Odczynnik</td><td>EMD Millipore</td><td>1.00547.5007</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptyna</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8511</td><td></td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek sodu (NaF)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>Ortowanadan sodu (Na&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;VO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Odczynnik</td><td>Fluka</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Fluoroodmian fenylmetanosulfonylowy (PMSF)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Tabletki z inhibitorem proteaz</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>Standard białkowy</td><td>Odczynnik</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0305</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl</td><td>Odczynnik</td><td>Acros Organics</td><td>61207</td><td></td></tr><tr><td>Fiolka z zakrętką</td><td>Narzędzie</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0866</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td></td></tr><tr><td>Barwnik do żeli białkowych SYPRO&amp;#174; Ruby</td><td>Odczynnik</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3125</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N&amp;rsquo;,N&amp;rsquo;-tetrametyloetylenodiamina (TEMED)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>Tris (zasada)</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Odczynnik</td><td>Promega Corp.</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td>Odczynnik</td><td>Burdick &amp;amp; Jackson</td><td>365-4</td><td></td></tr><tr><td>Tandemowy spektrometr mas LTQ-Orbitrap</td><td>Narzędzie</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System nano-chromatografii cieczowej</td><td>Narzędzie</td><td>Eksigent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B-merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>Odczynnik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td></td><td>EMD Millipore</td><td>GX0185-6</td><td></td></tr></tbody></table>

proteomika w celu identyfikacji białek oddziałujących z ligandowo-bramkowanymi kanałami kationowymi p2x2

Proteomics to Identify Proteins Interacting with P2X2 Ligand-Gated Cation Channels

Kanały jonowe sterowane ligandem leżą u podstaw komunikacji synaptycznej w układzie nerwowym1. U ssaków wyróżnia się trzy rodziny kanałów sterowanych ligandem: kanały z pętlą cysteinową (cys loop), kanały sterowane glutaminianem oraz kanały receptora P2X2. W każdym z tych przypadków wiązanie przekaźnika prowadzi do otwarcia poru, przez który jony przepływają zgodnie ze swoimi gradientami elektrochemicznymi. Wiele kanałów sterowanych ligandem jest również przepuszczalnych dla jonów wapnia3, 4, które pełnią role w sygnalizacji wewnątrzkomórkowej5 (np. regulacja genów), co może trwać dłużej niż czas otwarcia kanału. Zatem kanały sterowane ligandem mogą przekazywać sygnały w szerokim zakresie czasowym – od kilku milisekund do wielu dni. Biorąc pod uwagę te istotne role, konieczne jest zrozumienie, w jaki sposób same kanały jonowe sterowane ligandem są regulowane przez białka oraz jak białka te mogą modyfikować sygnalizację. Niedawne badania sugerują, że wiele, jeśli nie wszystkie kanały, może być częścią białkowych kompleksów sygnalizacyjnych6. W niniejszym artykule wyjaśniamy, jak zidentyfikować białka wiążące się z końcowym fragmentem C-terminalnym cytozolowej domeny receptora P2X2.
Receptory P2X są bramkowanymi przez ATP kanałami kationowymi i składają się z siedmiu podjednostek (P2X1-P2X7). Receptory P2X są szeroko rozpowszechnione w mózgu, gdzie pośredniczą w pobudzającej transmisji synaptycznej oraz presynaptycznym ułatwieniu uwalniania neurotransmiterów7. Receptory P2X występują w komórkach pobudliwych i niepobudliwych i odgrywają kluczową rolę w sygnalizacji neuronalnej, zapaleniu oraz funkcjiach sercowo-naczyniowych8. Receptory P2X2 są liczne w układzie nerwowym9 i stanowią przedmiot niniejszego badania. Przyjmuje się, że każda podjednostka P2X posiada dwa segmenty przebiegające przez błonę (TM1 i TM2), oddzielone regionem zewnątrzkomórkowym7 oraz wewnątrzkomórkowymi końcami N i C (Ryc. 1a)7. Podjednostki P2X10 (P2X1-P2X7) wykazują 30-50% homologii sekwencji na poziomie aminokwasów11. Receptory P2X zawierają tylko trzy podjednostki, co stanowi najprostszą stechiometrię wśród receptorów jonotropowych. Koniec C receptora P2X2 składa się ze 120 aminokwasów (Ryc. 1b) i zawiera kilka konsensusowych miejsc dokowania białek, co wspiera hipotezę, że receptor P2X2 może być częścią kompleksów sygnalizacyjnych. Jednakże, mimo że końcowi C receptorów P2X2 przypisano kilka funkcji9, żadne badanie nie opisało partnerów molekularnych, którzy łączą się z wewnątrzkomórkową stroną tego białka za pośrednictwem pełnej długości końca C. W niniejszej pracy metodycznej opisujemy podejście proteomiczne w celu identyfikacji białek oddziałujących z pełną długością końca C receptorów P2X2.

Opisujemy prosty protokół służący do identyfikacji białek mózgowych wiążących się z pełną sekwencją końca C receptorów P2X2 bramkowanych przez ATP. Przewiduje się, że rozszerzenie i systematyczne zastosowanie tego podejścia do wszystkich receptorów P2X doprowadzi do lepszego zrozumienia sygnalizacji receptorów P2X.

Proteomika w celu identyfikacji białek oddziałujących z ligandowo-bramkowanymi kanałami kationowymi P2X2

Ligandowo-bramkowane kanały jonowe leżą u podstaw komunikacji synaptycznej w układzie nerwowym1. U ssaków wyróżnia się trzy rodziny kanałów ligandowo-bramkowanych: cysteinowe...

Procedura ta rozpoczyna się od nadekspresji rekombinowanej części C-końcowej receptora P2X lub P2X2, zaprojektowanego jako białko fuzyjne GST, a następnie następuje lizy bakterii. Oczyszczone białko inkubuje się z kuleczkami glutathione sepharose 4B, a stężenie wyznacza się metodą Bradforda. Następnie białka z oczyszczonego lizatu mózgu szczura inkubuje się z C-końcem receptorów P2X2 związanych z kuleczkami glutathione sepharose; kompleksy białkowe związane z C-końcem receptorów P2X2 izoluje się za pomocą elektroforezy w żelu SDS-PAGE i wycinania, a następnie identyfikuje metodą spektrometrii mas.Witajcie, nazywam się Harpring i reprezentuję laboratorium JIT K w Katedrze Fizjologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. Witajcie, nazywam się Sarah Walburn i pochodzę z laboratorium Toma Vka w Katedrze Anestezjologii na Uniwersytecie Kalifornijskim w Los Angeles. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji i oczyszczania CTS receptorów P2X2.Wykorzystujemy te białka do identyfikacji w czerwonym mózgu, a w naszym laboratorium używamy ich do badania skutków funkcjonalnych dla receptorów P2X2. Przejdźmy zatem do szczegółów. Domena cytozolowa receptora P2X2 składa się z terminusa N

proteomics-to-identify-proteins-interacting-with-p2x2-ligand-gated

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Proteomika w celu zidentyfikowania białek współdziałających z P2X2 ligandowo-zależnymi kanałami kationowymi

Przepuszczalny przez błony komórkowe czynnik sieciujący DSP [dithiobis-(succinimidyl propionate)] stabilizuje przejściowe i nietrwałe oddziaływania in vivo, co umożliwia ich izolację przy użyciu rygorystycznych technik oczyszczania kompleksów białkowych. W niniejszym materiale przedstawiamy technikę sieciowania komórek hodowlanych, a następnie izolacji kompleksów białkowych metodą immunoprecypitacji.

Izolacja nietrwałych kompleksów wielobiałkowych za pomocą kontrolowanego sieciowania komórkowego in vivo oraz immunomagnetycznej chromatografii powinowactwa

Opisano podejście biochemiczne do identyfikacji in vivo interakcji białko-białko (PPI) białek błonowych. Metoda łączy w sobie sieciowanie białek, oczyszczanie powinowactwa i spektrometrię mas i można ją dostosować do prawie każdego typu komórki lub organizmu. Dzięki takiemu podejściu możliwa staje się nawet identyfikacja przejściowych IPP.

Membrane-SPINE: narzędzie biochemiczne do identyfikacji interakcji białko-białko białek błonowych in vivo

Techniki biosensorów optycznych mogą wykrywać zmiany w masie w pobliżu błony plazmatycznej w żywych komórkach i pozwalają śledzić reakcje komórkowe zarówno w pojedynczych komórkach, jak i populacjach komórek. Protokół ten będzie opisywał wykrywanie modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem G w nienaruszonych komórkach przy użyciu tego podejścia.

Zastosowanie bezznacznikowych biosensorów optycznych do wykrywania modulacji kanałów potasowych przez receptory sprzężone z białkiem G

Białka oddziałują na siebie nawzajem i te interakcje determinują w dużej mierze ich funkcje. Partnerzy interakcji białkowych można zidentyfikować przy wysokiej przepustowości in vivo za pomocą testu sprawności drożdży opartego na teście komplementacji fragmentów białka reduktazy dihydrofolianu (DHFR-PCA).

Badania przesiewowe interakcji białko-białko w całym genomie za pomocą testu komplementacji fragmentów białka (PCA) w żywych komórkach

Opisany test komórkowy jest przeznaczony do identyfikacji czynników oddziałujących z receptorem chemokiny 4 (CXCR4) CXC, które hamują lub stymulują, konkurencyjnie lub allosterycznie, wewnątrzkomórkowe uwalnianie Ca2+ zainicjowane przez aktywację CXCR4.

Test mobilizacji Ca2 + oparty na fluorescencji kinetycznej w celu identyfikacji agonistów, antagonistów i modulatorów allosterycznych sprzężonych z białkiem G

Tutaj prezentujemy protokół do badania mikromacierzy białek zewnątrzkomórkowych w celu identyfikacji nowych interakcji receptor-ligand w wysokiej przepustowości. Opisujemy również metodę usprawniającą wykrywanie przejściowych interakcji białko-białko za pomocą kompleksów białko-mikrogranulki.

Technologia zewnątrzkomórkowych mikromacierzy białkowych do wysokoprzepustowego wykrywania interakcji receptor-ligand o niskim powinowactwie

Zapewniając czułość pojedynczej komórki, cytometria przepływowa w czasie rzeczywistym jest wyjątkowo odpowiednia do ilościowego określania funkcji receptorów multimodalnych w żywych kulturach. Wykorzystując dorosłe nerwowe komórki progenitorowe, funkcję receptora P2X7 oceniano poprzez napływ wapnia wykrywany przez barwnik wskaźnikowy wapnia, tworzenie porów transbłonowych przez wychwyt bromku etydyny i fagocytozę za pomocą fluorescencyjnych kulek lateksowych.

Cytometria przepływowa żywych komórek w czasie rzeczywistym w celu zbadania napływu wapnia, tworzenia porów i fagocytozy przez receptory P2X7 w dorosłych nerwowych komórkach progenitorowych

Ten protokół przedstawia metodę pomiaru wiązania nukleotydów adeninowych z receptorami w czasie rzeczywistym w środowisku komórkowym. Wiązanie mierzy się jako transfer energii rezonansu Förstera (FRET) między pochodnymi nukleotydów trinitrofenylowych a białkiem znakowanym niekanonicznym, fluorescencyjnym aminokwasem.

Pomiar wiązania nukleotydów z nienaruszonymi, funkcjonalnymi białkami błonowymi w czasie rzeczywistym

Opisano techniki generowania biblioteki krótkich peptydów, które mogą aktywować komórki tuczne za pośrednictwem receptora MRGPRX2. Powiązane techniki są łatwe, niedrogie i można je rozszerzyć na inne receptory komórkowe.

Peptydy przesiewowe, które aktywują MRGPRX2 za pomocą zmodyfikowanych komórek HEK

Przedstawiamy protokół umożliwiający wychwytywanie i identyfikację specyficznych dla choroby interakcji białko-białko z komórek i tkanek rodzimych za pomocą sond chemicznych i spektrometrii mas. Uzyskane zbiory danych interakcji są analizowane za pomocą dedykowanej platformy internetowej, aby ujawnić dynamiczne dysfunkcje sieci oraz zmiany w ścieżkach związane z chorobą.

Mapowanie dysfunkcyjnych interakcji białko-białko w chorobach

Metoda ChIRP oparta na UV do identyfikacji bezpośrednich interakcji lncRNA-białko.

Metoda ChIRP oparta na UV do zweryfikowanej identyfikacji białek, które bezpośrednio współpracują z LncRNA: Od hodowanych komórek do jąder mysich

Poznaj metodę proteomiki do identyfikacji białek oddziałujących z C-koncem receptora P2X2 przy użyciu techniki pull-down i spektrometrii mas. Protokół ten umożliwia badanie sygnalizacji receptorów P2X w mózgu szczura.

Proteomika w celu identyfikacji białek oddziałujących z ligandowo-bramkowanymi kanałami kationowymi P2X2

Przeglądaj więcej filmów