Name: Bankowanie mózgu: maksymalne wykorzystanie próbek badawczych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-07-24T16:02:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: Poznaj metodę bankowania mózgu w celu maksymalizacji materiału badawczego przy zachowaniu integralności próbek. Protokół obejmuje przygotowanie bloków mózgowych do cięcia w kriostacie oraz systematyczne pobieranie serii sekcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy chcieliby podziękować Ikielowi Ptito za nieustające wsparcie techniczne.

Część 1: Obróbka wstępna tkanki
<ol>
<li>Tkanka powinna zostać dobrze utrwalona poprzez perfuzję paraformaldehydem, glutaraldehydem lub formaliną. Można to osiągnąć za pomocą standardowej perfuzji transkardialnej, typowo stosowanej podczas pobierania innych organów. W niniejszym badaniu obiekt został głęboko zsedowany chlorowodorkiem ketaminy (10 mg/kg, i.m.), uśmiercony przedawkowaniem pentobarbitalu sodu (25 mg/kg, i.v.) i poddany perfuzji transkardialnej 0,1 M PBS aż do całkowitego upłynnięcia krwi. Następnie zastosowano 4% roztwór paraformaldehydu w PBS przez 5 min (~1 litr).</li>
<li>Mózg należy zablokować stereotaktycznie, wyjąć z czaszki, zważyć i określić jego objętość2. Następnie tkankę należy poddać krioprotekcji w roztworach sacharozy o stopniowanym stężeniu, aż do końcowego stężenia 30% sacharozy w buforze fosforanowym. Bloki tkanki należy następnie zamrozić w izopentanie w temperaturze -65°C i przechowywać w -80°C do momentu przygotowania skrawków.</li>
</ol>
Część 2: Próbkowanie systematyczne
<ol>
<li>Próbkowanie systematyczne opiera się na odpowiednim planie przygotowanym przed wykonaniem sekcji. Cały obszar zainteresowania w wymiarach rostralno-kaudalnych oraz grzbietowo-brzusznych powinien być precyzyjnie zdefiniowany. Pomocny w określeniu obszaru zainteresowania oraz jego długości jest atlas stereotaktyczny dla badanego gatunku. Po ustaleniu długości obszaru zainteresowania konieczne jest określenie interwału próbkowania. Na przykład, na podstawie atlasu stereotaktycznego ustala się, że całkowity zasięg rostralno-kaudalny obszaru zainteresowania przy sekcjonowaniu w płaszczyźnie czołowej wynosi w przybliżeniu 3mm. Następnie ustawia się kriostat na grubość sekcji 50μm, co przy takim parametrze daje 60 sekcji obejmujących cały zasięg rostralno-kaudalny obszaru zainteresowania. W typowym, nieobciążonym badaniu stereologicznym do uzyskania wiarygodnych wyników wymaganych jest od 6 do 10 sekcji pobranych systematycznie. W tym przykładzie 10 sekcji rozmieszczonych w równych odstępach w całym zasięgu rostralno-kaudalnym daje interwał próbkowania wynoszący 1/6 sekcji.</li>
</ol>
Część 3: Tworzenie banku mózgów
<ol>
<li>Po ustaleniu częstotliwości pobierania przekrojów, kolejnym krokiem jest określenie, które barwienia zostaną wykonane niezwłocznie. Na przykład, jeśli barwienie odbywa się fioletem krezylowym, na szkiełku zostanie umieszczony 1 z każdych 6 przekrojów. Będzie to seria 1. Jeśli wiadomo, że może istnieć kilka potencjalnych przeciwciał, które należy przetestować, ale chce się najpierw przeanalizować dane z barwienia podstawowego lub po prostu brakuje czasu na wykonanie immunohistochemii, pozostałe 5 serii przekrojów należy umieścić w kolejności ich wycięcia w dołkach zawierających antigen preserve (1% poliwinylo-pirolidonu, 50% glikolu etylenowego w 0,1M PBS, pH 7,4). Poniższa tabela przedstawia schemat pobierania obejmujący 1 szkiełko i 1 płytkę (standardowa płytka 48-dołkowa) z przekrojami jako część banku mózgów (Tabela 1). <img src="/files/ftp_upload/1260/table1.jpg" alt="Schemat pobierania, rozmieszczenie przekrojów dla systematycznego wyboru interwałowego, metodologia badawcza." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Tabela 1"> Tabela 1. Częstotliwość pobierania przekrojów w tym przypadku wynosi 1/6. Pierwszy przekrój zostaje umieszczony na szkiełku do barwienia fioletem krezylowym, a kolejne 5 przekrojów trafia do roztworu antigen preserve. Następnie przekrój numer 7 jest umieszczany na szkiełku, a przekroje 9-12 trafiają do antigen preserve. Cykl ten jest powtarzany, aż obszar zainteresowania lub blok tkanki zostanie w całości pocięty na przekroje.</li>
<li>Kolejnym krokiem jest całkowite pocięcie bloku tkanki na przekroje. Na uchwycie (chuck) należy umieścić niewielką ilość medium do zatapiania i pozwolić mu zamarznąć. Uchwyt należy włożyć do głowicy mikrotomu i ściąć wystarczającą ilość zamrożonego medium, aby uzyskać płaską powierzchnię. Należy wyjąć uchwyt z głowicy mikrotomu i położyć go płasko w kriotomie. Na uchwyt należy nalać medium do zatapiania, a następnie stabilnie przyłożyć blok mózgu stroną przeciętą stereotaktycznie płasko do uchwytu. Należy powoli i całkowicie zatopić mózg w medium montującym. Uchwyt z mózgiem należy umieścić w głowicy mikrotomu i wykonać przekroje zgodnie z wcześniej ustalonymi parametrami częstotliwości pobierania.</li>
<li>Po całkowitym pocięciu bloku tkanki i umieszczeniu przekrojów w dołkach, płytkę należy przykryć pokrywką, zabezpieczyć ją parafilmem i umieścić w zamrażarce o temperaturze -20°C. Należy zarejestrować całkowitą liczbę pobranych przekrojów dla każdej serii, interwał pobierania przekrojów oraz liczbę serii dla każdego zwierzęcia. Rejestr ten będzie niezbędny do śledzenia późniejszego wyjmowania przekrojów z banku mózgów w celu przeprowadzenia przyszłych badań immunohistochemicznych.</li>
</ol>
Część 4: Reprezentatywne wyniki:
Systematyczne próbkowanie w ten sposób jest standardową praktyką w naszym laboratorium od 3 lat. Osiągnęliśmy duży sukces, przeprowadzając badania immunohistochemiczne na materiale przechowywanym w konserwatorze antygenów przez trzy lata od momentu pocięcia, bez pogorszenia jakości sygnału (Rycina 1). Ponadto, w ramach naszego banku mózgów, w ramach długoterminowych planów badawczych, zarchiwizowaliśmy blisko 20 000 systematycznych przekrojów mózgu naczelnych niebędących ludźmi (Rycina 2). <img src="/files/ftp_upload/1260/1260figure1.jpg" alt="Przekrój tkanki mózgowej barwiony w celu analizy gęstości neuronów; obraz mikroskopowy." data-altupdatedat="1787630408000"> Rycina 1. Jest to przekrój z bieguna potylicznego mózgu naczelnego niebędącego człowiekiem, poddany immunostainingowi na NeuN, wykazujący neurony zarówno warstwy VI, jak i istoty białej śródmiąższowej. Ten konkretny przekrój był przechowywany w konserwatorze antygenów w temperaturze -20°C przez okres 2 lat. Pasek skali = 100µm. <img src="/files/ftp_upload/1260/1260fig2.jpg" alt="Przechowywanie próbek laboratoryjnych, konfiguracja zamrażarki z uporządkowanymi preparatami biologicznymi do analizy badawczej." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="figure2"> Rycina 2. Nasz bank mózgów małp widliczek składa się obecnie z blisko 20 000 systematycznych przekrojów pochodzących od ponad 30 małp.

<ol><li>West, M., Slomianka, L., Gundersen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unbiased+stereological+estimation+of+the+total+number+of+neurons+in+the+subdivisions+of+the+rat+hippocampus+using+the+optical+fractionator.+Aat+Rec%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. Aat Rec.</a> 231, 482-497 (1991).</li>
<li>Burke, M. W., Zangenehpour, S., Boire, D., Ptito, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+Non-human+Primate+Brain+in+Stereotaxic+Space%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissecting the Non-human Primate Brain in Stereotaxic Space.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie zgłaszają żadnych konfliktów interesów.

Próbkowanie systematyczne to niedroga metoda mająca na celu maksymalne wykorzystanie materiału badawczego. Strategia ta została opracowana tak, aby spełniać zasady nieobciążonej stereologii, która wymaga systematycznego próbkowania w całym badanym obszarze. Kluczowe jest zachowanie kolejności przekrojów w każdej serii. W naszym laboratorium z sukcesem zastosowaliśmy tę metodę do tworzenia banków przekrojów mózgu chomika oraz naczelnych niebędących ludźmi. Do tej pory zebraliśmy prawie 20 000 przekrojów mózgu małpy werwet...

<table><tbody><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Fisher Scientific</td><td>E178-4</td><td></td></tr><tr><td>Poliwinylo-pirrolidon</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-500</td><td></td></tr><tr><td>Medium do zatapiania Thermal Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bankowanie mózgów: maksymalne wykorzystanie materiału badawczego

Brain Banking: Making the Most of your Research Specimens

Nieobciążona stereologia jest metodą pozwalającą na dokładne i efektywne szacowanie całkowitej liczby neuronów (lub innego typu komórek) w danym obszarze zainteresowania1Aby osiągnąć ten cel, należy zbadać od 6 do 10 systematycznych przekrojów obejmujących całą strukturę. Zazwyczaj wiąże się to z opracowaniem 1/5 przekrojów, co pozostawia znaczną ilość nieprzetworzonego materiału. W celu maksymalnego wykorzystania materiału proponujemy niedrogi sposób konserwowania utrwalonej tkanki w ramach długoterminowego planu przechowywania do badań. W miarę krojenia i przetwarzania tkanki w celu zastosowania pożądanego barwienia lub przeciwciała, co drugi przekrój powinien być systematycznie umieszczany w preparacie do konserwacji antygenów w temperaturze -20°C w celu późniejszego przetworzenia. Wykorzystując płytki 24-dołkowe, można rozmieszczać przekroje kolejno, aby ułatwić ich późniejsze wyjęcie. Stosując tę metodę, tkankę można przechowywać i poddawać badaniom immunohistochemicznym przez wiele lat.

Bankowanie mózgu i systematyczne pobieranie próbek materiału biologicznego stanowią podstawę do bezstronnej stereologii i pozwalają na maksymalne wykorzystanie danych uzyskanych z każdego preparatu.

Bankowanie mózgów: maksymalne wykorzystanie materiału badawczego

Nieobciążona stereologia jest metodą dokładnego i wydajnego szacowania całkowitej liczby neuronów (lub innego typu komórek) w danym obszarze zainteresowania1. Aby ...

Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować blok mózgu do kriostatu i określić częstotliwość pobierania przekrojów. Następnie należy przygotować preparat do utrwalania antygenów oraz szkiełka. Blok mózgu należy umieścić na uchwycie wewnątrz kriostatu.Po bezpiecznym osadzeniu mózgu na uchwycie do sekcjonowania przy zadanej grubości, należy wykonywać systematyczne przekroje w taki sposób, aby pierwsza seria została umieszczona na szkiełku, a kolejne serie w dołkach wypełnionych wcześniej preparatem do konserwacji antygenów. Po całkowitym zużyciu bloku, należy umieścić płytkę w zamrażarce o temperaturze -20°C jako część banku tkanek mózgowych. Witam, jestem dr Mark Burke z Laboratorium Neuronauk Wizualnych w Szkole Optometrii na Uniwersytecie w Montrealu.Dzień dobry, jestem dr Shahin Zur z Laboratorium Neurobiologii Wzrokowej w Szkole Optometrii Uniwersytetu w Montrealu. Dzień dobry, jestem dr Mo Petto, dyrektor Laboratorium Neurobiologii Wzrokowej w Szkole Optometrii Uniwersytetu w Montrealu. Dzisiaj zaprezentujemy Państwu procedurę systematycznego przechowywania tkanek mózgowych w preparacie Antigen Preserve.W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę, aby zmaksymalizować ilość

brain-banking-making-the-most-of-your-research-specimens

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Banking mózgu: jak najlepiej wykorzystać swoje próbki badawcze

Opisujemy szczurzy model zespołu stresu pourazowego (PTSD), który wykazuje trwałe zmiany w funkcji neuroendokrynnej oraz opóźnioną, długotrwałą i nasiloną reakcję lękową, charakterystyczną dla pacjentów z PTSD. Opisany tutaj model zwierzęcy oraz metody są przydatne do korelacji biomarkerów w jądrach mózgu, które mają charakter mechanistyczny, ale nie mogą być mierzone u pacjentów, z biomarkerami w obwodowych leukocytach, które podlegają pomiarowi.

Biomarkery w modelu zwierzęcym służące do ujawnienia korelatów neuronalnych, hematologicznych i behawioralnych PTSD

Film przedstawia krok po kroku procedurę symetrycznego preparowania ustalonego pośmiertnego ludzkiego mózgu, przygotowując mniejsze bloki tkanek do dalszej analizy.

Symetryczne przecięcie bihemferyczne ludzkiego mózgu pośmiertnego

Powszechny protokół ekstrakcji białek przy użyciu buforu mocznikowego/tiomocznikowego/SDS dla tkanki mózgowej ludzi i myszy umożliwia identyfikację białek za pomocą 2D-DIGE i ich późniejszą charakterystykę za pomocą mini immunoblottingu 2DE. Metoda ta umożliwia uzyskanie bardziej powtarzalnych i wiarygodnych wyników z biopsji człowieka i modeli eksperymentalnych.

Konsensus białka pochodzenia mózgowego, protokół ekstrakcji do badania ludzkiego i mysiego proteomu mózgu przy użyciu immunoblottingu zarówno 2D-DIGE, jak i Mini 2DE

Zorganizowane procedury cięcia mózgu są konieczne, aby skorelować określone zjawiska neuropsychiatryczne z ostatecznymi diagnozami neuropatologicznymi. Cięcia mózgu są wykonywane w różny sposób w zależności od różnych kliniczno-akademickich okoliczności. Protokół ten opisuje symetryczną procedurę dwupółkulowego cięcia mózgu w celu zbadania różnic półkulowych w patologiach ludzkiego mózgu oraz maksymalizacji obecnych i przyszłych technik biomolekularnych/neuroobrazowania.

Symetryczne pośmiertne cięcie mózgu w bihemferze w celu zbadania zdrowych i patologicznych stanów mózgu u ludzi

Tutaj prezentujemy protokół zamrażania i cięcia tkanki mózgowej od wielu zwierząt jako oszczędzającą czas alternatywę dla przetwarzania pojedynczych mózgów. Zmniejsza to zmienność barwienia podczas immunohistochemii i skraca czas kriosekcji i obrazowania.

Jednoczesna kriosekcja wielu mózgów gryzoni

Ten protokół opisuje metodę śledzenia indywidualnych trajektorii starzenia się mózgu poprzez program dawstwa mózgu i właściwą charakterystykę mózgów. Dawcy mózgu biorą udział w długoterminowym badaniu podłużnym, w tym w seryjnych ocenach wielowymiarowych. Protokół zawiera szczegółowy opis przetwarzania przez mózg i dokładną metodologię diagnostyczną.

Protokół Abbiategrasso Brain Bank do gromadzenia, przetwarzania i charakteryzowania starzejących się mózgów

Ta procedura opisuje zbieranie dyskretnie zamrożonych obszarów mózgu w celu uzyskania wysokiej jakości białka i RNA przy użyciu tanich i powszechnie dostępnych narzędzi.

Gromadzenie zamrożonych obszarów mózgu gryzoni do dalszych analiz

Biobanki są kluczowymi zasobami dla badań biomedycznych, a Biobank dla Jednostki Medycyny Translacyjnej i Cyfrowej w Europejskim Instytucie Onkologii jest wzorem w tej dziedzinie. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy opis standardowych procedur operacyjnych biobanków w zakresie zarządzania różnymi rodzajami próbek biologicznych pobranych od ludzi.

Biobank medycyny translacyjnej: Standardowe procedury operacyjne dla optymalnego zarządzania próbkami

Ten protokół opisuje metodę ułatwiającą pobieranie próbek z próbek po radykalnej prostatektomii. Celem jest zmapowanie, scharakteryzowanie i mikro-makro wypreparowanie próbek tkanek z próbek w oparciu o kryteria anatomopatologiczne przed przechowywaniem ich w biobanku.

Zwiększenie wiarygodności biobankowania guzów gruczołu krokowego dzięki ulepszonej technice pobierania próbek i charakterystyce histologicznej

Współczesne neurobiologie muszą badać różnice między wieloma gatunkami, w tym gryzoniami laboratoryjnymi i ludźmi. Jednak trudności techniczne pojawiają się, gdy w grę wchodzą ssaki o dużym mózgu. Podejście to dotyczy zmienności międzygatunkowej populacji neuronalnych u bardzo różnych ssaków, co pozwala na porównywalne wyniki do mapowania w celu ujawnienia wzorców ewolucyjnych.

Podejście porównawcze do ilościowych badań liczenia komórek w bardzo różnych mózgach ssaków

Poznaj metodę bankowania mózgu w celu maksymalizacji materiału badawczego przy zachowaniu integralności próbek. Protokół obejmuje przygotowanie bloków mózgowych do cięcia w kriostacie oraz systematyczne pobieranie serii sekcji.

Bankowanie mózgów: maksymalne wykorzystanie materiału badawczego

Przeglądaj więcej filmów