Przełączanie fotonowe Dendra2 przez okno obrazowania piersi

Niniejszy film przedstawia protokół rozpoczynający się od wstrzyknięcia linii komórek nowotworowych wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego do tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego myszy. Następnie konstruowana jest specjalistyczna komora do obrazowania in vivo, która zostaje chirurgicznie wszczepiona zwierzęciu, co umożliwia pozyskanie danych obrazowych. Witam, jestem dr Vic z laboratorium dr. Johna Condiego i dr. Jeffreya Siegela z Biophotonics Center w Albert Einstein College of Medicine.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę intravitalnego przełączania fotonicznego i obrazowania komórek nowotworowych znakowanych białkiem DRA2 za pomocą okna obrazowania pamięciowego. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania wpływu mikrośrodowiska guza na mobilność komórek nowotworowych. Przystąpmy zatem do pracy, pamiętając o założeniu rękawiczek lateksowych.

Rozpocznij wykonanie okna obrazowania gruczołu mlekowego (MIW), podgrzewając szalkę hodowlaną o średnicy od 5 do 10 cm i nadając jej zakrzywiony kształt poprzez dociśnięcie do niej zaokrąglonego, twardego przedmiotu, takiego jak jednocalowy wiertło do narzędzia Dremel. Wytnij środek szalki, używając podgrzanej żyletki. Następnie za pomocą małego, stożkowatego wiertła Dremel wykonaj otwór o średnicy od 6 do 7 mm w centrum kopułowatej plastikowej podstawy.

Krawędzie plastikowej podstawy należy całkowicie wygładzić, szlifując je narzędziem Dremel, a następnie dodatkowo opracowując pilnikiem. Górną część plastikowej podstawy należy spiłować, aby uzyskać płaską powierzchnię pod szkiełko nakrywkowe. Średnica spiłowanej płaskiej powierzchni powinna wynosić od 9 do 10 mm.

Następnie przyklej szklaną przykrywkę okrągłą o średnicy ośmiu milimetrów. Nasuń ją na spłaszczoną powierzchnię, używając superkleju, i pozostaw do wyschnięcia na 15 minut. Za pomocą podgrzanej igły 26 G wykonaj osiem otworów szewnych, przebijając podstawę od zewnątrz do wewnątrz; otwory powinny być rozmieszczone równomiernie wokół przykrywki.

Przesuń nwt o 0,5 do 1 mm od krawędzi szkiełka nakrywkowe. Przemyj MIW wodą dejonizowaną, a następnie ponownie 70% etanolem. Użyj patyczka higienicznego, aby oczyścić szkło, aż stanie się całkowicie przezroczyste.

Użyj acetonu, aby usunąć wszelkie pozostałe zamglone plamy powstałe w wyniku odparowania kleju. Na koniec wysterylizuj MIW, wystawiając go na działanie światła ultrafioletowego przez trzy godziny z każdej strony. Przed wsunięciem MIW w obszarze wokół czwartego sutka powinien rozwinąć się mały guz o średnicy od pięciu do siedmiu milimetrów w wyniku iniekcji komórek nowotworowych.

W pierwszej części należy upewnić się, że guz nie wykazuje widocznych oznak martwicy. Skóra w obszarze wokół guza powinna być nienaruszona i owłosiona. Aby rozpocząć, należy przygotować sterylną przestrzeń do zabiegu, rozkładając sterylną ściereczkę wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza.

Umieść kawałek sterylnej gazy na środku i przygotuj przybory niezbędne do operacji. Będą potrzebne: mały i duży zestaw nożyczek do preparowania, nożyczki sprężynowe, pęsety mikrochirurgiczne oraz igłotrzymacz. Po znieczuleniu myszy 2,5% avertynem, użyj trymera dla małych zwierząt, aby ogolić obszar nad guzem. Użyj kremu do depilacji, aby usunąć resztki włosów, a następnie oczyść skórę.

Używając patyczków higienicznych nasączonych etanolem, przenieś zwierzę na sterylną gazę i nałóż maść oftalmiczną na oczy, aby zapobiec ich wysychaniu i zakażeniu. Zdezynfekuj skórę Betadyną, a następnie oczyść ją 70% etanolem.

Za pomocą jałowej gazy chirurgicznej, odciągnij pęsetą skórę bezpośrednio przyśrodkowo od sutka i wykonaj nacięcie o długości około 2 mm. Oddziel znajdującą się poniżej tkankę tłuszczową gruczołu piersiowego od skóry, używając narzędzi do dyssekcji, nożyczek i pęsety. Po oddzieleniu skóra i otwór rozciągną się do rozmiaru umożliwiającego wprowadzenie MIW.

Wprowadź MIW w taki sposób, aby nad podstawą MIW znajdowała się skóra, a następnie przyszyj go na miejscu. Użyj kleju tkankowego lub cyjanoakrylanu, aby wypełnić otwory po szwach i przymocować MIW do skóry. Zwierzę powinno teraz odpoczywać przez kolejne trzy do czterech dni przed przeprowadzeniem pierwszej sesji obrazowania.

W ramach przygotowań do sesji obrazowania, opisano konstrukcję komory obrazującej, aby umożliwić jej prawidłowe wykorzystanie. Najpierw znieczul zwierzę izofluranem i nałóż maść oftalmiczną do oczu. Podłącz wylot izofluranu z aparatu do znieczulania do przedniej części komory obrazującej.

Na zewnątrz otworu wlotowego. Do otworu wylotowego komory obrazowania podłącz drugą rurkę. Rurkę tę należy podłączyć do filtra gazowego, a następnie do pompy próżniowej.

Następnie ułóż zwierzę tak, aby MIW było skierowane do dołu. Przytrzymaj pudełko i wyreguluj dolne drzwiczki tak, aby podstawa MIW była utrzymana i unieruchomiona pomiędzy nimi. Podstawa MIW powinna znajdować się na tym samym poziomie co drzwiczki pudełka obrazującego.

Choć szkiełko nakrywkowe MIW powinno znajdować się zaledwie kilka milimetrów poniżej tego poziomu, należy upewnić się, że rozmieszczenie MIW między dolnymi przesuwnymi drzwiczkami gwarantuje, że szkiełko nakrywkowe leży płasko i równolegle do dolnych drzwiczek pudełka. Umożliwi to prawidłowe ustawienie ostrości; należy obniżyć obiektyw mikroskopu, aby pozostawić miejsce na umieszczenie pudełka na stoliku mikroskopu. Wyreguluj stolik tak, aby szkiełko nakrywkowe MIW znajdowało się nad obiektywem.

Możemy teraz ustawić ostrość obiektywu i rozpocząć obrazowanie. Procedura obrazowania opisana w niniejszym materiale dotyczy konfokalnego mikroskopu Leica SP5 i powinna służyć jako wskazówka do optymalizacji eksperymentu z użyciem konkretnego mikroskopu. Należy rozpocząć od obserwacji guza przez okular z zastosowaniem zielonego filtra fluorescencyjnego.

Zlokalizuj główne naczynia krwionośne, w których widoczny jest przepływ i które znajdują się płasko w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Ustaw jedno z naczyń w centrum pola widzenia i przełącz się na detekcję PMT. Skonfigurujemy sekwencyjną akwizycję obrazów dla dwóch kanałów.

Jeden kanał wykorzystuje linię lasera 488 nanometrów i zbiera rozproszenie z macierzy zewnątrzkomórkowej oraz emisję z zielonej formy dendra two. Drugi kanał wykorzystuje linię lasera 543 nanometrów i zbiera emisję z czerwonej formy dendra.Two. Należy zebrać obrazy 3D przed przełączeniem fotonicznym.

Następnie należy użyć opcji skanowania obszaru zainteresowania, aby przeprowadzić przełączenie fotochemiczne wybranej populacji komórek za pomocą linii lasera 405 nanometrów. Należy zarejestrować emisję czerwonej formy białka w celu monitorowania procesu przełączania. Teraz należy zebrać obrazy 3D po przełączeniu tą samą metodą, którą zarejestrowano obrazy przed przełączeniem.

Następnie, przy użyciu 20% mocy lasera UV, w celu konwersji tego obszaru na przełącznik fotooptyczny w więcej niż jednym regionie guza, należy wykonać zdjęcia przez okulary za pomocą cyfrowego aparatu w kanałach zielonym i czerwonym. Pomoże to w orientacji podczas kolejnych sesji obrazowania. Na obrazie tym widoczny jest prostokątny obszar przełącznika fotooptycznego, zorientowany ortogonalnie względem naczynia krwionośnego, który nie wykazuje fluorescencji.

Komórki bez przełączenia fotonicznego wydają się zielone, podczas gdy rozproszenie z macierzy zewnątrzkomórkowej jest fioletowe. Obraz stanowi projekcję maksymalnej intensywności czterech obrazów wzdłuż osi Z. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić przełączenie fotoniczne i obrazowanie komórek znakowanych narzędziem RA poprzez okno obrazowania pamięciowego.

Zastosowanie tej procedury jest istotne dla porównania zachowania komórek nowotworowych w różnych obszarach guza na przestrzeni wielu dni. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.