Name: Fotoprzełączanie Dendra2 przez okno obrazowania sutka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-05T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: Poznaj metodę fotoprzełączania Dendra2 w komórkach nowotworowych myszy przez okno obrazowania sutka. Technika ta umożliwia śledzenie dynamiki komórek w mikrośrodowisku guza in vivo przez kilka dni.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez Departament Obrony USA (BC075554 dla B.G. i BC061403 dla D.K.), Narodowe Instytuty Zdrowia USA (U54GM064346 dla J.v.R.; CA100324 dla J.C., J.E.S. i J.W.; CA77522 dla J.E.S., U54CA126511 dla J.C. i B.G.). Dziękujemy D. Entenberg za pomoc w mikroskopii, M. Rottenkolber za pomoc w wykonaniu komory obrazowej oraz J. Pollard (Albert Einstein College of Medicine) za przeciwciało F4/80.

1. Generowanie fluorescencyjnych guzów poprzez wstrzyknięcie komórek nowotworowych do tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego:
<ol>
<li>Hodować linię komórkową wykazującą ekspresję białka Dendra2 (jako markera cytoplazmatycznego) do 40 - 80% konfluencji.</li>
<li>Przepłukać szalki co najmniej 3 razy PBS bez Ca2+ lub Mg2+.</li>
<li>Dodać 3 ml trypsyny na każdą szalkę 10 cm i inkubować w 37 °C, aż większość komórek odklei się, a następnie uderzyć szalką o płaską powierzchnię, aby ją wstrząsnąć.</li>
<li>Spłukać wszystkie komórki z szalki, a następnie użyć skrobaka (gumowego policemana), aby zebrać również macierz.&nbsp; Dodać 5 ml PBS.&nbsp; Pobrać alikwot do policzenia podczas wirowania.</li>
<li>Wirować przy 800 g przez 5 min.</li>
<li>Odssać nadsącz i resuspendować w PBS do stężenia 5- 10x 106/ml.&nbsp; Przechowywać w lodzie do momentu iniekcji (wykonać iniekcję w ciągu 30 min).</li>
<li>Umieścić klatkę zawierającą 4-5 tygodniowe samice myszy z niedoborem odporności (np. SCID) wewnątrz sterylnego komina.</li>
<li>Spryskać obszar wokół 4. sutka (brzusznego) 70% etanolem.</li>
<li>Wstrzyknąć 0,1 ml do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego. Jeśli dostępny jest asystent, jedna osoba może unieruchomić mysz, podczas gdy druga wprowadza igłę do tkanki tłuszczowej gruczołu piersiowego. W przypadku wykonywania iniekcji samodzielnie, poddać mysz lekkiej anestezji z użyciem izofluranu.</li>
<li>Gdy guz urośnie do 5-7 mm, należy wprowadzić okno obrazowania gruczołu piersiowego (MIW). Uwaga: Alternatywnie, w niektórych zastosowaniach MIW można wprowadzić na zdrową tkankę tłuszczową gruczołu piersiowego, a komórki wstrzyknąć później. Takie podejście umożliwia obrazowanie komórek przejściowo transfekowanych w środowisku fizjologicznym.</li>
</ol>
2. Ręczne wykonanie okna obrazowania gruczołu mlekowego (Mammary Imaging Window, MIW):
<ol>
<li>MIW (rycina 1A) są wykonane z tworzywa sztucznego klasy tkankowej, aby zagwarantować biokompatybilność. Do konstrukcji ręcznej używamy szalek o średnicy 5 lub 10 cm.</li>
<li>Założyć rękawiczki lateksowe.</li>
<li>Podgrzać szalkę do hodowli tkanek i utworzyć zakrzywioną powierzchnię, dociskając rozgrzaną szalkę za pomocą zaokrąglonego, twardego przedmiotu (w tym celu używamy bitu do dremela o rozmiarze 1 cala).</li>
<li>Wyciąć środek szalki za pomocą podgrzanej żyletki.</li>
<li>Użyć małego, stożkowatego bitu do dremela, aby wykonać otwór w centrum kopulastej podstawy z tworzywa sztucznego (o średnicy 6-7 mm).</li>
<li>Wygładzić całkowicie krawędzie podstawy z tworzywa sztucznego, szlifując ją dremelem i dodatkowo opiłowując.</li>
<li>Opiłować górną część podstawy z tworzywa sztucznego, tworząc płaską powierzchnię pod szkiełko podstawowe. Średnica opiłowanej, płaskiej powierzchni powinna wynosić 9-10 mm.</li>
<li>Przykleić okrągłe szkiełko podstawowe o średnicy 8 mm (numer 1) do wypłaszczonej powierzchni za pomocą superglue (kleju cyjanoakrylowego).</li>
<li>Odczekać do wyschnięcia kleju (15 minut).</li>
<li>Użyć podgrzanej igły 26G, aby wykonać osiem otworów szwalnych, przebijając podstawę od zewnątrz (od strony szkła) do wewnątrz. Otwory powinny być rozmieszczone równomiernie wokół szkiełka, w odległości 0,5-1 mm od jego krawędzi.</li>
<li>Poszerzyć otwory za pomocą igły szwalnej 5-0.</li>
<li>Przebijanie otworów w plastikowej podstawie spowoduje nierówności wewnętrznej powierzchni. Używając papieru ściernego, należy całkowicie wygładzić tę powierzchnię.</li>
<li>Zmienić rękawiczki i usunąć małe cząsteczki plastiku z MIW za pomocą małego pędzla.</li>
<li>Przemyć MIW wodą dejonizowaną.</li>
<li>Przemyć MIW 70% etanolem. Użyć patyczka higienicznego do oczyszczenia szkła, aby było całkowicie przezroczyste. W przypadku wystąpienia zamglonych plam powstałych z oparów kleju, ostrożnie użyć acetonu i patyczka higienicznego.</li>
<li>Zsterylizować MIW poprzez ekspozycję na promieniowanie UV przez 3 h z każdej strony.</li>
</ol>
Półautomatyczne wykonanie okna obrazowania gruczołu mlekowego (MIW):
W celu wykonania plastikowej podstawy obecnie stosujemy formy odlewnicze z gumy silikonowej, stworzone przy użyciu ręcznie wykonanych MIW. Forma składa się z dwóch części z gumy silikonowej, które po wypełnieniu żywicą poliestrową i natychmiastowym połączeniu tworzą dokładną replikę zarówno przodu, jak i tyłu oryginału.&nbsp;Płynna żywica poliestrowa jest mieszana w proporcji 9:10, co po pełnym utwardzeniu w ciągu 48h daje twardą strukturę. Plastik jest chroniony przed promieniowaniem UV i ma właściwości archiwalne, nie ulegając rozpadowi ani nie żółknąc z upływem czasu. Po utwardzeniu podstawy kroki 2.8-2.16 wykonuje się w ten sam sposób, co w przypadku ręcznie wykonanych MIW.
3. Wprowadzenie MIW:
<ol>
<li>Obszar wokół 4th sutka powinien zawierać mały guz (o średnicy 5-7 mm) kilka dni/tygodni po wstrzyknięciu komórek nowotworowych, w zależności od typu komórek (Rycina 1B). Czas, który upłynął po wstrzyknięciu komórek wykazujących ekspresję fotoprzełączalnego białka Dendra2 lub innych białek fluorescencyjnych, zależy od użytej linii komórkowej. Guz nie powinien wykazywać widocznej martwicy i powinien być pokryty nienaruszoną skórą z owłosieniem. Myszy z guzami martwiczymi należy poddać eutanazji.</li>
<li>Przygotować sterylną przestrzeń do operacji – rozłożyć kawałek sterylnej tkaniny wewnątrz sterylnego dygestorium. Na środku położyć kawałek sterylnej gazy, a wokół niej kilka okien mikroskopowych (MIW) oraz sterylne narzędzia: używamy małych standardowych nożyczek, nożyczek sprężynowych, pęset mikrosekcyjnych, pęset mikrochirurgicznych oraz prowadnika igieł. W rogu dygestorium należy umieścić sterylne patyczki bawełniane, butelkę z 70% etanolem i sterylne rękawiczki.</li>
<li>Mysz zostaje znieczulona w sterylnym dygestorium poprzez wstrzyknięcie dootrzewnowo (IP) 2,5% awertyny (20 μl/g) w HBSS lub alternatywnie 10 μg/kg ketaminy + 10 μg/g ksylazyny (należy skontaktować się z Instytutem Opieki nad Zwierzętami w celu uzyskania zgód i zamówienia środków). Uwaga: Roztwór awertyny należy przygotowywać co dwa tygodnie, sterylizować za pomocą filtra 0,22 μm i przechowywać w alikwotach po 500 μl w temperaturze 4 °C (w ciemności).</li>
<li>Usunąć owłosienie, goląc obszar nad guzem za pomocą trymera dla małych zwierząt.</li>
<li>Usunąć resztę włosów za pomocą kremu do depilacji Nair (dostępnego w drogeriach). Oczyścić skórę za pomocą patyczków bawełnianych nasączonych etanolem.</li>
<li>Przenieść zwierzę na sterylną gazę i nałożyć maść oftalmiczną do oczu, aby zapobiec ich wysuszeniu i infekcji.</li>
<li>Zdezynfekować skórę betadyną i oczyścić 70% etanolem.</li>
<li>Przenieść zwierzę na sterylną tkaninę chirurgiczną wewnątrz sterylnego dygestorium. </li>
<li>Odciągnąć skórę bezpośrednio przyśrodkowo od sutka za pomocą pęsety i wykonać nacięcie skóry o długości ok. 2 mm.</li>
<li>Oddzielić leżący poniżej tkankowy podkład tłuszczowy gruczołu mlekowego od skóry za pomocą nożyczek sekcyjnych i pęsety. Podczas tego etapu oddzielania skóra i otwór rozciągają się do rozmiaru umożliwiającego włożenie okna mikroskopowego (MIW).</li>
<li>Jeśli podczas operacji przypadkowo zostanie uszkodzone naczynie, należy użyć sterylnego patyczka bawełnianego, aby usunąć krew lub zapobiec nadmiernemu krwawieniu. </li>
<li>Włożyć MIW w taki sposób, aby nad jego podstawą znajdowała się skóra, a następnie zaszyć go, używając nici niewchłanialnej i igły tnącej w kierunku odwrotnym.</li>
<li>Użyć kleju tkankowego lub cyjanoakrylanu, aby wypełnić otwory po szwach i przymocować MIW do skóry.</li>
<li>Dodać mieszankę antybiotyków TMP-SMX (sulfametoksazol 0,6 mg/ml, trimetoprim 0,12 mg/ml) do wody w poidełku klatkowym na 3 dni przed i po operacji. </li>
<li>Zwierzę pozostaje pod wpływem znieczulenia przez 1-4 h po wstrzyknięciu awertyny IP. Ponieważ operacja trwa zazwyczaj ok. 45 min, ważne jest wsparcie zwierzęcia w rekonwalescencji:</li>
<li>Umieścić ręczny podkład grzewczy (37 °C) (dostępny w aptekach) na dnie klatki i przykryć go gazą.</li>
<li>Trzymać zwierzę na podkładzie do momentu, aż obróci się na brzuch i zacznie chodzić.</li>
<li>Jeśli zwierzę pozostaje nieprzytomne przez więcej niż 3 h, wstrzyknąć 0,3 ml HBSS dootrzewnowo w celu rehydratacji.</li>
<li>Zwierzęciu pozwala się na rekonwalescencję przez kolejne 3-4 dni przed przeprowadzeniem pierwszej sesji obrazowania.</li>
</ol>
4. Budowa komory obrazowania
Komora do obrazowania zapewnia, że MIW spoczywa płasko, bezpośrednio nad obiektywem mikroskopu. Ułatwia ona również kontrolę temperatury i znieczulenia poprzez stały przepływ izofluranu. Komora jest wykonana z pleksiglasu i sklejona za pomocą spoiny plastikowej. Jest ona dostosowana do konkretnego stolika mikroskopowego, dlatego kształt jej dna różni się w zależności od użytego mikroskopu (rycina 2 przedstawia schemat komory dostosowanej do stolika mikroskopu Leica SP5). Wymiary komory w centymetrach to l=11,4 cm, w=7,6 cm, h=4,4 cm (rycina 2A). Dno komory składa się z pustej płyty o rozmiarach 12,7x8,4 cm, która pasuje do stolika mikroskopu Leica SP5, oraz dwóch przesuwnych „drzwi” o wymiarach 5,7 X 5,7 cm każda, które po zamknięciu tworzą okrągły otwór (d=2,22 cm). MIW jest dopasowany do tego otworu. Przednia część zawiera otwór wlotowy do podawania środka znieczulającego, natomiast jedna z części bocznych zawiera otwór wylotowy prowadzący do pompy próżniowej. Należy pamiętać, że przed umieszczeniem komory do obrazowania należy usunąć kondensator i uchwyt na preparat.
5. Stosowanie komory obrazowej
<ol>
<li>Zpodaj zwierzęciu znieczulenie izofluranem i nałóż maść oftalmiczną na oczy.</li>
<li>Podłącz wylot izofluranu z aparatu do znieczulania do przodu skrzynki obrazującej, na zewnątrz otworu wlotowego (Rycina 2B).</li>
<li>Podłącz drugą rurkę do otworu wylotowego skrzynki obrazującej. Rurka ta powinna być podłączona do filtra gazowego, a następnie do odsysacza.</li>
<li>Otwórz pokrywę oraz drzwiczki skrzynki, umieść zwierzę stroną MIW skierowaną do dołu i przesuń drzwiczki do wnętrza skrzynki.</li>
<li>Przytrzymaj skrzynkę i dostosuj dolne drzwiczki tak, aby podstawa MIW była między nimi utrzymana i unieruchomiona. Podstawa MIW powinna znajdować się na tym samym poziomie co drzwiczki skrzynki obrazującej, natomiast szkiełko okrywowe MIW powinno znajdować się zaledwie kilka milimetrów poniżej tego poziomu. Upewnij się, że ułożenie MIW między dolnymi przesuwnymi drzwiczkami gwarantuje, że szkiełko okrywowe (szklana część MIW) leży płasko i równolegle do dolnych drzwiczek skrzynki. Zapewni to prawidłowe ustawienie ostrości.</li>
<li>Obniż obiektyw mikroskopu, aby zrobić miejsce na umieszczenie skrzynki na stoliku mikroskopowym.</li>
<li>Umieść skrzynkę na stoliku mikroskopowym i ustaw stolik tak, aby szkiełko okrywowe MIW znajdowało się nad obiektywem.</li>
<li>Ustaw ostrość obiektywu i rozpocznij obrazowanie.</li>
<li>Podczas stosowania izofluranu stan zwierzęcia należy monitorować poprzez wizualną kontrolę częstotliwości oddechów. Można to robić bezpośrednio lub poprzez monitorowanie częstotliwości artefaktów oddechowych pojawiających się podczas zbierania obrazów (mogą one zakłócać akwizycję danych). Z sukcesem stosowano system pulsoksymetrii MouseOx (Starr life Sciences Corp). W ten sposób dane mogą być zbierane w sposób ciągły bez konieczności zapalania światła w pomieszczeniu w celu sprawdzenia stanu zwierzęcia. Uwaga: Po każdej sesji obrazowania należy wspomóc wybudzanie zwierzęcia, owijając małą ręczną podkładkę grzewczą w gazę lub chusteczki Kimwipes i kładąc ją pod zwierzęciem w klatce. Uwaga: Jeśli do obrazowania przez MIW używany jest obiektyw imersyjny, medium imersyjne (glicerol, woda, olej) należy usunąć z okna obrazującego. Należy sprawdzić, czy MIW nie posiada pęknięć ani innych uszkodzeń, które mogły powstać podczas obrazowania. Jest to kluczowe dla zbierania danych podczas wielu sesji obrazowania.</li>
</ol>
6. Fotoprzekluczanie i obrazowanie komórek znakowanych Dendra2
Procedura została opisana dla mikroskopu konfokalnego Leica SP5; moc lasera w płaszczyźnie ogniskowej, dostępne obiektywy oraz opcje oprogramowania różnią się w zależności od stosowanego mikroskopu konfokalnego lub zestawu do obrazowania wielofotonowego, w związku z czym poniższy protokół należy traktować jako wskazówkę do optymalizacji eksperymentu na własnym mikroskopie.
<ol>
<li>Obserwując nowotwór przez okular (10x) z użyciem filtru fluorescencji zielonej, należy zlokalizować główne naczynia krwionośne, w których widoczny jest przepływ i które leżą płasko w tej samej płaszczyźnie ogniskowania.</li>
<li>Należy ustawić jedno z naczyń w centrum pola widzenia i przełączyć się na detekcję PMT.</li>
<li>Należy skonfigurować sekwencyjny pobór obrazów dla dwóch kanałów. Jeden z kanałów wykorzystuje linię lasera 488nm (moc 10%) i rejestruje rozproszenie z macierzy zewnątrzkomórkowej (480-495nm) oraz emisję z zielonej formy Dendra2 (505-540nm). Drugi kanał wykorzystuje linię lasera 543nm (moc 90%) i rejestruje emisję z czerwonej formy Dendra2 (555-600nm). Należy zebrać obrazy 3D przed fotoprzełączeniem.</li>
<li>Należy użyć opcji skanowania ROI, aby przeprowadzić fotoprzełączenie wybranej populacji komórek za pomocą linii lasera 405nm (moc 30%, 20-40 skanowań). W celu monitorowania przełączania należy rejestrować emisję czerwonej formy białka.</li>
<li>Korzystając z tej samej procedury sekwencyjnej co w punkcie 6.3, należy zebrać obrazy 3D po przełączeniu.</li>
<li>W przypadku fotoprzełączania więcej niż jednego obszaru w nowotworze zaleca się wykonanie zdjęć przez okulary za pomocą kamery cyfrowej, w obu kanałach – zielonym i czerwonym (Rysunek 3A, B). Ułatwi to orientację podczas kolejnych sesji obrazowania. Uwaga: Dodatkowo naczynia krwionośne można tymczasowo oznakować, wstrzykując do żyły ogonowej fluorescencyjny dekstran (Cascade Blue lub Alexa Fluor 647, oba 10kDa). Kilka godzin po wstrzyknięciu dekstrany opuszczą naczynia krwionośne i trwale oznakują makrofagi.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Rysunek 3C przedstawia prostokątny obszar poddany fotoprzełączaniu (czerwony), zorientowany ortogonalnie względem naczynia krwionośnego (brak fluorescencji). Komórki niepoddane fotoprzełączaniu są zielone, natomiast rozproszenie z macierzy zewnątrzkomórkowej ma kolor fioletowy. Obraz stanowi projekcję maksymalnej intensywności czterech obrazów wzdłuż osi Z (głębokość 20-50 μm).

<ol><li>Farina, K. L., Wyckoff, J. B., Rivera, J., Lee, H., Segall, J. E., Condeelis, J. S., Jones, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+of+tumor+cells+visualized+in+living+intact+primary+tumors+using+green+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cell motility of tumor cells visualized in living intact primary tumors using green fluorescent protein.</a> Cancer Res. 58, 2528-2532 (1998).</li>
<li>Naumov, G. N., Wilson, S. M., MacDonald, I., Schmidt, E. E., Morris, V. L., Groom, A. C., Hoffman, R. M., Chambers, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+green+fluorescent+protein%2C+coupled+with+high-resolution+in+vivo+videomicroscopy%2C+to+monitor+steps+in+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of green fluorescent protein, coupled with high-resolution in vivo videomicroscopy, to monitor steps in tumor metastasis.</a> J Cell Sci. 112, 1835-1842 (1999).</li>
<li>Brown, E. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+gene+expression%2C+angiogenesis+and+physiological+function+in+tumors+using+multiphoton+laser+scanning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy.</a> Nature Med. 7, 864-868 (2001).</li>
<li>Wang, W., Wyckoff, J. B., Frohlich, V. C., Oleynikov, Y., Huttelmaier, S., Zavadil, J., Cermak, L., Bottinger, E. P., Singer, R. H., White, J. G., Segall, J. E., Condeelis, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+behavior+in+metastatic+primary+mammary+tumors+correlated+with+gene+expression+patterns+revealed+by+molecular+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Single cell behavior in metastatic primary mammary tumors correlated with gene expression patterns revealed by molecular profiling.</a> Cancer Res. 62, 6278-6288 (2002).</li>
<li>Sidani, M., Wyckoff, J., Xue, C., Segall, J. E., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+microenvironment+of+mammary+tumors+using+multiphoton+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Probing the microenvironment of mammary tumors using multiphoton microscopy.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 11, 151-163 (2006).</li>
<li>Wyckoff, J. B., Wang, Y., Lin, E. Y., Li, J. F., Goswami, S., Stanley, E. R., Segall, J. E., Pollard, J. W., Condeelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+macrophage-assisted+tumor+cell+intravasation+in+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors.</a> Cancer Res. 67, 2649-2656 (2007).</li>
<li>Egeblad, M., Ewald, A. J., Askautrud, H. A., Truitt, M. L., Welm, B. E., Bainbridge, E., Peeters, G., Krummel, M. F., Werb, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis Model Mech. 1, 155-167 (2008).</li>
<li>Mempel, T. R., Henrickson, S. E., von Adrian, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+priming+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes+occurs+in+three+distinct+phases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">T-cell priming by dendritic cells in lymph nodes occurs in three distinct phases.</a> Nature. 427, 154-159 (2004).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autonomous+T+cell+trafficking+examined+in+vivo+with+intravital+two-photon+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Autonomous T cell trafficking examined in vivo with intravital two-photon microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 100, 2604-2609 (2003).</li>
<li>Kedrin, D., Gligorijevic, B., Wyckoff, J., Verkhusha, V. V., Condeelis, J., Segall, J. E., van Rheenen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravital+imaging+of+metastatic+behavior+through+a+mammary+imaging+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window.</a> Nat. Methods. 5, 1019-1021 (2008).</li>
<li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+intracellular+protein+movements+using+photoswitchable+fluorescent+proteins+PS-CFP2+and+Dendra2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tracking intracellular protein movements using photoswitchable fluorescent proteins PS-CFP2 and Dendra2.</a> Nat. Protocols. 2, 2024-2032 (2007).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>PBS bez Ca, Mg</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>25300</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14025</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka DMEM (komórki MDA-MB-231)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11965</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran (Aerrane)</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td># NDC 10019-773-40</td><td></td></tr><tr><td>Mysz SCID</td><td>National Cancer Institute</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Szalki hodowlane</td><td>BD Biosciences</td><td>353003</td><td>Zamówienie specjalne</td></tr><tr><td>Okrągłe szkiełko nakrywkowe 8 mm</td><td>Scientific, Inc.</td><td>8CIR-1-FIS</td><td></td></tr></tbody></table>

przełączanie fotonowe dendra2 przez okno obrazowania piersi

Dendra2 Photoswitching through the Mammary Imaging Window

W ciągu ostatniej dekady mikroskopia intravitalna guzów piersi u myszy i szczurów z rozdzielczością pojedynczych komórek1-4doprowadziło do uzyskania ważnych informacji na temat mechanizmów zachowań przerzutowych, takich jak migracja, inwazja i intrawasacja komórek nowotworowych5, 6, angiogeneza3i odpowiedź komórek odpornościowych7-9Niedawno opisaliśmy technikę obrazowania ortotopowych raków piersi w trakcie wielu sesji obrazowania intravitalnego u żywych myszy10W tym celu opracowaliśmy okno obrazowania gruczołu mlekowego (Mammary Imaging Window, MIW) oraz zoptymalizowaliśmy parametry obrazowania dla białka Dendra211fotoprzełączanie i obrazowaniein vivoW niniejszym opracowaniu opisujemy protokół wytwarzania MIW, umieszczania MIW na powierzchni guza oraz obrazowania komórek nowotworowych znakowanych Dendra2 przy użyciu specjalnie skonstruowanej komory obrazującej. Protokół ten może być wykorzystany do obrazowania zachowań metastatycznych komórek nowotworowych w różnych mikrośrodowiskach w obrębie guzów i umożliwia długotrwałe obrazowanie naczyń krwionośnych, komórek nowotworowych oraz komórek gospodarza.

Intrawitalne przełączanie fotofizyczne i śledzenie komórek nowotworowych znakowanych Dendra2 za pomocą okna obrazowania gruczołu mlekowego (Mammary Imaging Window) to technika, która pozwala na obrazowanie zachowania przerzutowego komórek nowotworowych w wybranych mikrośrodowiskach guza w skali czasowej obejmującej wiele dni.

Przełączanie fotonowe Dendra2 przez okno obrazowania piersi

W ciągu ostatniej dekady mikroskopia intravitalna guzów piersi u myszy i szczurów z rozdzielczością pojedynczych komórek1-4 dostarczyła istotnych informacji na temat...

Niniejszy film przedstawia protokół rozpoczynający się od wstrzyknięcia linii komórek nowotworowych wykazujących ekspresję białka fluorescencyjnego do tkanki tłuszczowej gruczołu mlekowego myszy. Następnie konstruowana jest specjalistyczna komora do obrazowania in vivo, która zostaje chirurgicznie wszczepiona zwierzęciu, co umożliwia pozyskanie danych obrazowych. Witam, jestem dr Vic z laboratorium dr. Johna Condiego i dr. Jeffreya Siegela z Biophotonics Center w Albert Einstein College of Medicine.Dzisiaj zaprezentujemy procedurę intravitalnego przełączania fotonicznego i obrazowania komórek nowotworowych znakowanych białkiem DRA2 za pomocą okna obrazowania pamięciowego. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania wpływu mikrośrodowiska guza na mobilność komórek nowotworowych. Przystąpmy zatem do pracy, pamiętając o założeniu rękawiczek lateksowych.Rozpocznij wykonanie okna obrazowania gruczołu mlekowego (MIW), podgrzewając szalkę hodowlaną o średnicy od 5 do 10 cm i nadając jej zakrzywiony kształt poprzez dociśnięcie do niej zaokrąglonego, twardego przedmiotu, takiego jak jednocalowy wiertło do narzędzia Dremel. Wytnij środek szalki, używając podgrzanej żyletki. Następnie za pomocą małego, stożkowatego wiertła Dremel wykonaj otwór o średnicy od 6 do 7 mm w centrum kopułowatej plastikowej podstawy.Krawędzie plastikowej podstawy należy całkowicie wygładzić, szlifując je narzędziem Dremel, a następnie dodatkowo opracowując pilnikiem. Górną część plastikowej podstawy należy spiłować, aby uzyskać płaską powierzchnię pod szkiełko nakrywkowe. Średnica spiłowanej płaskiej powierzchni powinna wynosić od 9 do 10 mm.Następnie przyklej szklaną przykrywkę okrągłą o średnicy ośmiu milimetrów. Nasuń ją na spłaszczoną powierzchnię, używając superkleju, i pozostaw do wyschnięcia na 15 minut. Za pomocą podgrzanej igły 26 G wykonaj osiem otworów szewnych, przebijając podstawę od zewnątrz do wewnątrz; otwory powinny być rozmieszczone równomiernie wokół przykrywki.Przesuń nwt o 0,5 do 1 mm od krawędzi szkiełka nakrywkowe. Przemyj MIW wodą dejonizowaną, a następnie ponownie 70% etanolem. Użyj patyczka higienicznego, aby oczyścić szkło, aż stanie się całkowicie przezroczyste.Użyj acetonu, aby usunąć wszelkie pozostałe zamglone plamy powstałe w wyniku odparowania kleju. Na koniec wysterylizuj MIW, wystawiając go na działanie światła ultrafioletowego przez trzy godziny z każdej strony. Przed wsunięciem MIW w obszarze wokół czwartego sutka powinien rozwinąć się mały guz o średnicy od pięciu do siedmiu milimetrów w wyniku iniekcji komórek nowotworowych.W pierwszej części należy upewnić się, że guz nie wykazuje widocznych oznak martwicy. Skóra w obszarze wokół guza powinna być nienaruszona i owłosiona. Aby rozpocząć, należy przygotować sterylną przestrzeń do zabiegu, rozkładając sterylną ściereczkę wewnątrz komory z laminarnym przepływem powietrza.Umieść kawałek sterylnej gazy na środku i przygotuj przybory niezbędne do operacji. Będą potrzebne: mały i duży zestaw nożyczek do preparowania, nożyczki sprężynowe, pęsety mikrochirurgiczne oraz igłotrzymacz. Po znieczuleniu myszy 2,5% avertynem, użyj trymera dla małych zwierząt, aby ogolić obszar nad guzem. Użyj kremu do depilacji, aby usunąć resztki włosów, a następnie oczyść skórę.Używając patyczków higienicznych nasączonych etanolem, przenieś zwierzę na sterylną gazę i nałóż maść oftalmiczną na oczy, aby zapobiec ich wysychaniu i zakażeniu. Zdezynfekuj skórę Betadyną, a następnie oczyść ją 70% etanolem.Za pomocą jałowej gazy chirurgicznej, odciągnij pęsetą skórę bezpośrednio przyśrodkowo od sutka i wykonaj nacięcie o długości około 2 mm. Oddziel znajdującą się poniżej tkankę tłuszczową gruczołu piersiowego od skóry, używając narzędzi do dyssekcji, nożyczek i pęsety. Po oddzieleniu skóra i otwór rozciągną się do rozmiaru umożliwiającego wprowadzenie MIW.Wprowadź MIW w taki sposób, aby nad podstawą MIW znajdowała się skóra, a następnie przyszyj go na miejscu. Użyj kleju tkankowego lub cyjanoakrylanu, aby wypełnić otwory po szwach i przymocować MIW do skóry. Zwierzę powinno teraz odpoczywać przez kolejne trzy do czterech dni przed przeprowadzeniem pierwszej sesji obrazowania.W ramach przygotowań do sesji obrazowania, opisano konstrukcję komory obrazującej, aby umożliwić jej prawidłowe wykorzystanie. Najpierw znieczul zwierzę izofluranem i nałóż maść oftalmiczną do oczu. Podłącz wylot izofluranu z aparatu do znieczulania do przedniej części komory obrazującej.Na zewnątrz otworu wlotowego. Do otworu wylotowego komory obrazowania podłącz drugą rurkę. Rurkę tę należy podłączyć do filtra gazowego, a następnie do pompy próżniowej.Następnie ułóż zwierzę tak, aby MIW było skierowane do dołu. Przytrzymaj pudełko i wyreguluj dolne drzwiczki tak, aby podstawa MIW była utrzymana i unieruchomiona pomiędzy nimi. Podstawa MIW powinna znajdować się na tym samym poziomie co drzwiczki pudełka obrazującego.Choć szkiełko nakrywkowe MIW powinno znajdować się zaledwie kilka milimetrów poniżej tego poziomu, należy upewnić się, że rozmieszczenie MIW między dolnymi przesuwnymi drzwiczkami gwarantuje, że szkiełko nakrywkowe leży płasko i równolegle do dolnych drzwiczek pudełka. Umożliwi to prawidłowe ustawienie ostrości; należy obniżyć obiektyw mikroskopu, aby pozostawić miejsce na umieszczenie pudełka na stoliku mikroskopu. Wyreguluj stolik tak, aby szkiełko nakrywkowe MIW znajdowało się nad obiektywem.Możemy teraz ustawić ostrość obiektywu i rozpocząć obrazowanie. Procedura obrazowania opisana w niniejszym materiale dotyczy konfokalnego mikroskopu Leica SP5 i powinna służyć jako wskazówka do optymalizacji eksperymentu z użyciem konkretnego mikroskopu. Należy rozpocząć od obserwacji guza przez okular z zastosowaniem zielonego filtra fluorescencyjnego.Zlokalizuj główne naczynia krwionośne, w których widoczny jest przepływ i które znajdują się płasko w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Ustaw jedno z naczyń w centrum pola widzenia i przełącz się na detekcję PMT. Skonfigurujemy sekwencyjną akwizycję obrazów dla dwóch kanałów.Jeden kanał wykorzystuje linię lasera 488 nanometrów i zbiera rozproszenie z macierzy zewnątrzkomórkowej oraz emisję z zielonej formy dendra two. Drugi kanał wykorzystuje linię lasera 543 nanometrów i zbiera emisję z czerwonej formy dendra.Two. Należy zebrać obrazy 3D przed przełączeniem fotonicznym.Następnie należy użyć opcji skanowania obszaru zainteresowania, aby przeprowadzić przełączenie fotochemiczne wybranej populacji komórek za pomocą linii lasera 405 nanometrów. Należy zarejestrować emisję czerwonej formy białka w celu monitorowania procesu przełączania. Teraz należy zebrać obrazy 3D po przełączeniu tą samą metodą, którą zarejestrowano obrazy przed przełączeniem.Następnie, przy użyciu 20% mocy lasera UV, w celu konwersji tego obszaru na przełącznik fotooptyczny w więcej niż jednym regionie guza, należy wykonać zdjęcia przez okulary za pomocą cyfrowego aparatu w kanałach zielonym i czerwonym. Pomoże to w orientacji podczas kolejnych sesji obrazowania. Na obrazie tym widoczny jest prostokątny obszar przełącznika fotooptycznego, zorientowany ortogonalnie względem naczynia krwionośnego, który nie wykazuje fluorescencji.Komórki bez przełączenia fotonicznego wydają się zielone, podczas gdy rozproszenie z macierzy zewnątrzkomórkowej jest fioletowe. Obraz stanowi projekcję maksymalnej intensywności czterech obrazów wzdłuż osi Z. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić przełączenie fotoniczne i obrazowanie komórek znakowanych narzędziem RA poprzez okno obrazowania pamięciowego.Zastosowanie tej procedury jest istotne dla porównania zachowania komórek nowotworowych w różnych obszarach guza na przestrzeni wielu dni. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentu.

dendra2-photoswitching-through-the-mammary-imaging-window

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Dendra2 Przełączanie zdjęć przez okno obrazowania sutka

W tym filmie wykonujemy obrazowanie dożylne wstępnie wstrzykniętych komórek rakowych w modelu mysim przez wszczepione okienko czaszkowe. Ta technika obrazowania poklatkowego o wysokiej rozdzielczości umożliwia badanie dynamicznego zachowania komórek nowotworowych u żywej myszy.

Obrazowanie przyżyciowe oparte na oknie czaszkowym w modelu mysim: technika obrazowania służąca do badania zachowania wstępnie wstrzykniętych komórek rakowych w mózgu modelu mysiego

Tutaj opisujemy technikę miejscowego dostarczania odczynników do gruczołu sutkowego królika poprzez wstrzyknięcie doprzewodowe. Dodatkowo opisujemy protokół wizualizacji i potwierdzenia porodu za pomocą wysokorozdzielczego obrazowania ultrasonograficznego środków kontrastowych.

Dostarczanie wewnątrzprzewodowe do gruczołu sutkowego królika

Przedstawiono tutaj podejście do długoterminowego obrazowania przyżyciowego za pomocą optycznie przezroczystych, silikonowych okienek, które można przykleić bezpośrednio do tkanki/organu zainteresowania i skóry. Te okna są tańsze i bardziej wszechstronne niż inne obecnie używane w terenie, a chirurgiczne wprowadzenie powoduje ograniczone stany zapalne i stres u zwierząt.

Podłużne obrazowanie przyżyciowe przez przezroczyste okienka silikonowe

Ten protokół opisuje nowatorskie okno obrazowania sutka z wymienną pokrywą (R.MIW). Mikroskopia przyżyciowa po wszczepieniu R.MIW pozwala na podłużne i wielodniowe obrazowanie zdrowego i chorego gruczołu sutkowego z rozdzielczością komórkową na różnych etapach rozwoju.

Podłużna mikroskopia przyżyciowa z wykorzystaniem okienka do obrazowania sutkowego z wymienną pokrywą

Opisana tutaj metoda obrazowania intravital wykorzystuje generowanie drugiej harmonii kolagenu i endogenną fluorescencję z metabolicznego kofaktora NAD(P)H do nieinwazyjnej segmentacji nieoznaczonego mikrośrodowiska guza na przedziały guza, zrębu i naczyń krwionośnych w celu dogłębnej analizy obrazów 4D intravital.

Bezznacznikowe podejście do segmentacji w obrazowaniu przyżyciowym mikrośrodowiska guza sutka

Niniejszy protokół opisuje łatwą technikę obrazowania gruczołu sutkowego myszy w okresie laktacji za pomocą skaningu laserowego, mikroskopii konfokalnej i wielofotonowej.

Mikroskopia subkomórkowa przyżyciowych gruczołu sutkowego

Przedstawiamy protokół chirurgicznego wszczepienia stabilizowanego okna optycznego do obrazowania w subkomórkowej rozdzielczości mysiej trzustki, umożliwiając seryjne i podłużne badania zdrowej i chorej trzustki.

Stabilizowane okienko do przyżyciowego obrazowania mysiej trzustki

Dynamikę przepływu krwi w korze mózgu można badać in vivo, obrazując fluorescencyjne barwniki dekstranowe wstrzyknięte do żyły ogonowej gryzoni za pomocą mikroskopii dwufotonowej. Niniejszy film pokazuje, jak obrazować dynamikę przepływu krwi w neocortex myszy przy użyciu preparatu okna czaszkowego przykrytego szkłem.

Metoda obrazowania przepływu krwi w neokorze za pomocą obrazowania dwufotonowego przez okno czaszkowe

Mikroskop świetlny jest podstawowym narzędziem biologa komórkowego, który powinien posiadać gruntowną wiedzę na temat zasad jego działania, sposobu regulacji dla różnych zastosowań oraz metod konserwacji niezbędnych do uzyskania maksymalnej zdolności obrazowania i rozdzielczości. Poniżej szczegółowo opisano poszczególne elementy mikroskopu.

Główne elementy mikroskopu świetlnego

Komórki guza piersi wykazujące ekspresję lucyferazy są wszczepiane myszom podskórnie i obrazowane za pomocą obrazowania optycznego w celu nieinwazyjnego monitorowania wzrostu i rozwoju guza w badaniu podłużnym.

In vivo obrazowanie bioluminescencyjne guzów piersi z użyciem systemu IVIS Spectrum

Poznaj metodę fotoprzełączania Dendra2 w komórkach nowotworowych myszy przez okno obrazowania sutka. Technika ta umożliwia śledzenie dynamiki komórek w mikrośrodowisku guza in vivo przez kilka dni.

Przełączanie fotonowe Dendra2 przez okno obrazowania piersi

Przeglądaj więcej filmów