Name: Wykrywanie ubikwitynacji białek (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-08-19T00:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj metody wykrywania ubikwitynacji białek w komórkach hodowlanych i in vitro. Techniki te umożliwiają badanie ligaz ubikwityny i mechanizmów chorobowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była wspierana przez granty NIH RO1 DC006497, RO1 NS057289 oraz PO1 ES016738 (dla Z. Zhang); granty California Institute for Regenerative Medicine RS1-00331-1 oraz RL1-00682-1 (dla Z. Zhang); American Parkinson Disease Association (dla Z. Zhang i Y. S. Choo) oraz Michael J. Fox Foundation for Parkinson’s Research (Z. Zhang).

Wykrywanie ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych
<ol>
<li>Przeprowadzić transfekcję hodowlanych komórek plazmidami wykazującymi ekspresję białka docelowego oraz (wersją z etykietą epitopową) ubikwityny.</li>
<li>Przygotować kompletny bufor do lizy komórek (2% SDS, 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0) z dodatkiem 2mM ortowanadanu sodu, 50 mM fluorku sodu oraz inhibitorów proteaz.</li>
<li>Zlizować komórki, używając 100 µl buforu do lizy komórek na płytkę (szalka 6 cm). W przypadku użycia większej szalki odpowiednio dostosować objętość.&nbsp; Ostrożnie zakręcić szalką, aby bufor do lizy pokrył cały obszar wzrostu komórek.</li>
<li>Zebrać komórki za pomocą skrobaka do komórek i przenieść lizaty komórkowe do probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml. Natychmiast umieścić probówkę na płycie grzewczej i gotować przez 10 min.</li>
<li>Rozbić komórki za pomocą sonikatora.</li>
<li>Dodać 900ul buforu do rozcieńczania (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Triton). Inkubować próbki w temperaturze 4°C przez 30-60 min przy jednoczesnym obracaniu.</li>
<li>Wirować rozcieńczone próbki przy 20,000 x g przez 30 min. Przenieść otrzymany supernatant do nowej probówki Eppendorfa. Należy uważać, aby nie naruszyć osadu.</li>
<li>Zmierzyć stężenie białka.</li>
<li>Przygotować przeciwciała przeciwko białku docelowemu sprzężone z kuleczkami agarozy Protein A lub G w odpowiednim buforze (zawiesina 50%). Odciąć wąski koniec końcówki pipety P-200 i przenieść 14-20 μl żywicy do 500-1,500 μg przygotowanych lizatów komórkowych w celu przeprowadzenia immunoprecypitacji. W przypadku komórek o wysokiej wydajności transfekcji wystarczy 500 μg. W przypadku komórek o niskiej wydajności transfekcji może być wymagane więcej białka.</li>
<li>Inkubować mieszaninę lizatu komórkowego i kuleczek w temperaturze 4°C przez noc przy jednoczesnym obracaniu.</li>
<li>Odwirować kuleczki przy 5000 x g przez 5 min. Odessać supernatant. Przemyć żywicę dwukrotnie buforem do mycia (10 mM Tris-HCl, pH 8.0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 1% NP-40).</li>
<li>Wirować kuleczki ostatni raz przy 20,000 x g przez 30 s. Odessać pozostały bufor do mycia i zagotować żywicę z 2X buforem do ładowania SDS.</li>
<li>Nanieść próbki na żel SDS-PAGE do analizy immunoblottingowej.</li>
<li>Wykryć ubikwitynę oraz białko docelowe za pomocą odpowiednich przeciwciał. W przypadku immunoblottingu zazwyczaj najpierw wykrywamy ubikwitynę. Membrana zostanie następnie wykorzystana do wykrycia białka wytrąconego.</li>
</ol>
Wykrywanie ubikwitynacji białka docelowego za pomocą testu ubikwitynacji in vitro
<ol>
<li>Przygotować bufor do ubikwitynacji 5X (100 mM Tris-HCl, pH 7.5, 25 mM MgCl2, 2.5 mM DTT, 10 mM ATP). Przechowywać go w małych alikwotach w temperaturze -20 °C przez maksymalnie 6 miesięcy. Niektóre protokoły zalecają dodanie do buforu fosfoalkoślanu kreatyny i kinazy kreatynowej w celu regeneracji ATP 1,2.</li>
<li>Dla każdej reakcji przygotować mieszaninę zawierającą następujące składniki: 
<table border="1">
<tbody >
<tr >
<td >8 μl</td >
<td >bufor do ubikwitynacji 5X</td >
</tr >
<tr >
<td >250 ng</td >
<td >E1 ubikwitynacji</td >
</tr >
<tr >
<td >500 ng</td >
<td >E2 ubikwitynacji</td >
</tr >
<tr >
<td >0.5 μg</td >
<td >ubikwityna</td >
</tr >
<tr >
<td >0.5 μg</td >
<td >białko docelowe</td >
</tr >
<tr >
<td >&nbsp;</td >
<td >woda do uzyskania całkowitej objętości 40 μl</td >
</tr >
</tbody >
</table >
Jako kontrole przygotować analogiczne reakcje z pominięciem E1, E2 lub ubikwityny.</li>
<li>Inkubować mieszaninę w temperaturze 37°C przez 1 godzinę lub dłużej.</li>
<li>Zatrzymać reakcję poprzez dodanie buforu do próbek SDS-PAGE i gotować próbkę przez 10 min.</li>
<li>Nanieść próbki na żel SDS-PAGE do analizy immunoblottingowej.</li>
<li>Wykryć ubikwitynę oraz białko docelowe za pomocą odpowiednich przeciwciał.</li>
</ol>

<ol><li>Xiong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PINK1%2C+and+DJ-1+form+a+ubiquitin+E3+ligase+complex+promoting+unfolded+protein+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">PINK1, and DJ-1 form a ubiquitin E3 ligase complex promoting unfolded protein degradation.</a> J Clin Invest. 119, 650-660 (2009).</li>
<li>Xirodimas, D. P., Saville, M. K., Bourdon, J. C., Hay, R. T., Lane, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mdm2-mediated+NEDD8+conjugation+of+p53+inhibits+its+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mdm2-mediated NEDD8 conjugation of p53 inhibits its transcriptional activity.</a> Cell. 118, 83-97 (2004).</li>
<li>Didier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNF5%2C+a+RING+finger+protein+that+regulates+cell+motility+by+targeting+paxillin+ubiquitination+and+altered+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">RNF5, a RING finger protein that regulates cell motility by targeting paxillin ubiquitination and altered localization.</a> Mol Cell Biol. 23, 5331-5345 (2003).</li>
<li>Laney, J. D., Hochsetrasser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unit+14.5+Analysis+of+Protein+Ubiquitination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Unit 14.5 Analysis of Protein Ubiquitination.</a> Current Protocols in Protein Science. , 14.5.1-14.5.11 (2002).</li>
</ol>

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

W niniejszej prezentacji opisaliśmy w pierwszej kolejności etapy pozwalające na wykrycie modyfikacji ubikwitynowej białka docelowego w hodowlach komórek ssaków. Aby wykryć ubikwitynowanie specyficznie na białku docelowym, a nie na białkach oddziałujących niekowalencyjnie, zastosowaliśmy rygorystyczne warunki lizy komórek, immunoprecypitacji i przemywania 1,3.&nbsp; Ubikwitynowanie, wykryte poprzez immunoprecypitację białka docelowego w tak surowych warunkach, a następnie immunoblotting z użyciem przeciwciał an...

wykrywanie ubikwitynacji białek

Detection of Protein Ubiquitination

Ubikwitynacja, czyli kowalencyjne przyłączanie polipeptydu ubikwityny do białek docelowych, jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Są to enzym aktywujący ubikwitynę E1, enzym konjugujący ubikwitynę E2 oraz ligaza ubikwityny E3. W przeciwieństwie do E1 i E2, ligazy ubikwityny E3 wykazują specyficzność względem substratu. Z kolei liczne enzymy deubikwitynujące pełnią role w przetwarzaniu białek poliubikwitynowanych. Ubikwitynacja może prowadzić do zmiany stabilności białek, ich lokalizacji komórkowej oraz aktywności biologicznej. Mutacje genów zaangażowanych w szlak ubikwitynacji/deubikwitynacji lub zaburzone funkcjonowanie systemu ubikwitynowego są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi, takimi jak różne typy nowotworów, neurodegeneracja i zaburzenia metaboliczne. Wykrycie zmienionej lub prawidłowej ubikwitynacji białek docelowych może zapewnić lepsze zrozumienie patogenezy tych chorób. &nbsp;W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowychin vivoi probówkiin vitroProtokoły te są również przydatne do wykrywania innych modyfikacji małymi cząsteczkami podobnymi do ubikwityny, takich jak sumoilacja i nedylacja.

Ubikwitynacja jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zestaw trzech enzymów. Mutacje genów zaangażowanych w tę modyfikację są powiązane z wieloma różnymi chorobami ludzi. W niniejszej pracy opisujemy protokoły wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych in vivo oraz w probówkach in vitro.

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Ubikwitynacja, polegająca na kowalencyjnym przyłączaniu polipeptydu ubikwityny do białek docelowych, jest kluczową modyfikacją potranslacyjną przeprowadzaną przez zespół...

Cześć, jestem Chu z laboratorium Jo w Birmingham Institute for Medical Research. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wykrywania ubikwitynacji białek. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania ligandów parkiny lub UBI3 oraz ich substratów.Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć ten protokół, należy przeprowadzić transfekcję komórek plazmidami wykazującymi ekspresję zarówno białka docelowego, jak i wersji ubikwityny z tagiem epitopowym. Pozostawić komórki do wzrostu na około 40 godzin, a następnie przenieść się do stanowiska laboratoryjnego, aby zlizować komórki, odprowadzić pożywkę ciekłą i dwukrotnie przemyć komórki roztworem PBS.Następnie zlizuj komórki, dodając 100 µL buforu do lizy komórek zawierającego 2% SDS na każdą płytkę o średnicy 6 cm. Zakręć każdą płytką tak, aby bufor całkowicie pokrył komórki. Następnie użyj skrobaka do komórek, aby zebrać zlizowane komórki i przenieść je do probówki typu eppendorf o pojemności 1,5 ml.Natychmiast umieść probówkę na bloku grzewczym i gotuj lizowane komórki przez 10 minut, aby dodatkowo zdenaturować i rozpuścić białka. Po gotowaniu użyj sonikatora, aby rozbić komórki i ich DNA. Ten etap zmniejsza lepkość lizatów komórkowych.Po sonikacji dodaj 900 µL buforu rozcieńczającego i pozostaw próbki w rotatorze w temperaturze 4 °C przez 30 do 60 minut. Po inkubacji odwiruj rozcieńczone próbki z prędkością 20 000 ×g przez 30 minut w temperaturze 4 °C, aby uzyskać białka rozpuszczalne. Następnie, uważając, aby nie naruszyć osadu, przenieś nadsącz do nowej probówki typu Eppendorf.Na koniec zmierz stężenie białka w supernatancie, stosując metodę taką jak zmodyfikowany test Lowry'ego, którego używamy w tym przypadku. Teraz można przystąpić do immunoprecypitacji w celu wyizolowania białka docelowego z pozostałych białek w supernatancie. Pierwszym krokiem w immunoprecypitacji jest przygotowanie kulek sprzężonych z przeciwciałami przeciwko białku docelowemu.Można użyć komercyjnie dostępnych kulek sprzężonych z przeciwciałem lub samodzielnie przygotować unieruchomione przeciwciało przy użyciu łączników sieciujących. Tak jak w naszym przypadku, przygotuj unieruchomione przeciwciało w kompatybilnym buforze, aby uzyskać 50% zawiesinę do przeprowadzenia reakcji immunoprecypitacji. Odetnij wąski koniec końcówki pipety P 200 i przenieś 14 do 20 µL żywicy do 500 do 1500 µg przygotowanych lizatów komórkowych.Dostosuj ilość użytego lizatu komórkowego do wydajności transfekcji Twoich komórek. Pozostaw mieszaninę lizatu komórkowego z kulkami do rotacji w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc. W tym czasie przeciwciało sprzężone z kulkami swoiście zwiąże białko docelowe.Następnego dnia odwirować kuleczki przy 5, 000 Gs przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby wytrącić białko w formie osadu. Po związaniu białka z kuleczkami odessać supernatant i dwukrotnie przemyć żywicę buforem do płukania z wysoką zawartością soli, wirując przy 5, 000 Gs przez pięć minut. W temperaturze czterech stopni Celsjusza odwirować kuleczki po raz ostatni przy 20, 000 GS przez 30 sekund i odessać pozostały bufor do płukania.Po oczyszczeniu interesującego białka należy poddać je elektroforezie w żelu SDS-PAGE. Najpierw zagotuj żywicę z bezigielkami z dwukrotnym buforem do ładowania SDS, aby zdenaturować białka i nadać im ładunek ujemny. Następnie nanieś przygotowane próbki na żel SDS-PAGE.Przenieś białka z żelu na membranę, stosując protokół western blotting obowiązujący w Twoim laboratorium. Następnie poddaj blot inkubacji z przeciwciałami przeciwko ubikwitynie lub białku docelowemu i wywołaj membranę na filmie, aby zwizualizować ubikwitynowane białka. Przedstawiliśmy właśnie sposób wykrywania ubikwitynacji białek w hodowlach komórkowych.Ten sam eksperyment można przeprowadzić in vitro w probówce. Całkowita objętość tej reakcji wynosi 40 µL i można ją wykonać w probówce do PCR. Każdą reakcję należy przygotować w następujący sposób.Najpierw należy dodać pięciokrotność buforu do UBIKWITYNILACJI, który zawiera TP oraz reduktory DIO trzy etol oraz DTT. Następnie należy dodać enzymy ubikwitynylacji E1 i E2. Dodaj substraty: ubikwitynę oraz białko docelowe.Dopełnić całkowitą objętość reakcji do 40 µL wodą w przypadku kontroli. Przygotować analogiczne reakcje w obecności braku ubikwityny E1, E2 lub białka docelowego. Inkubować mieszaninę w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę lub dłużej.Zatrzymaj reakcję poprzez dodanie buforu do próbek na żele SDS-PAGE. Gotuj próbkę przez 10 minut. Nałóż próbki na żel SDS-PAGE i przeprowadź analizę immuno-blottingu, analogicznie do procedury zastosowanej w eksperymencie in vivo.Oto przykładowy wynik tego protokołu. Parkinson. Białkiem docelowym jest tutaj białko związane z chorobą Parkinsona. A ścieżka czwarta pokazuje ubikwitynowaną parinę.Typowe wyraźne rozmazania lub drabinki widoczne powyżej masy cząsteczkowej niemodyfikowanej paryny służą do porównania kilku warunków eksperymentalnych; należy również wziąć pod uwagę poziomy ekspresji komórkowej niemodyfikowanego białka docelowego, paryny oraz ubikwityny w każdym z tych warunków. Jest to przykład ubikwitynacji paryny in vitro; paryna oczyszczona metodą powinowactwa została poddana analizie ubikwitynacji in vitro w obecności rekombinowanego E1, E2 oraz ubikwityny z tagiem biotyny. Ubikwitynowaną parynę wykryto za pomocą streptawidyny HRP. Ubikwitynowana paryna przejawia się w formie drabin powyżej masy cząsteczkowej niemodyfikowanej paryny. Ścieżki 1, 2 i 4 są kontrolami, które odpowiednio nie zawierają ubikwityny, E1 oraz E2 i parkiny.Właśnie zaprezentowaliśmy sposób wykrywania białka new vaccination w hodowlach komórkowych. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przygotować lizat komórkowy w warunkach silnie utleniających oraz rozcieńczyć lizat komórkowy przed dodaniem immobilizowanych przeciwciał. To wszystko.Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje metodę ekstrakcji i oczyszczania ubikwitynylowanych peptydów zawierających pozostałości peptydów di-glicyny ze złożonej mieszaniny peptydów. Przedstawiona metoda może pomóc w identyfikacji pierwotnych miejsc ubikwitynacji w białku.

Ekstrakcja peptydów ubikwitynylowanych na podstawie powinowactwa immunologicznego: technika selektywnej ekstrakcji peptydów oznaczonych ubikwityną z oczyszczonych frakcji peptydowych

Obecny protokół szczegółowo opisuje metodę pomiaru aktywności funkcjonalnie homologicznych enzymów deubikwitynujących. Specjalistyczne sondy kowalencyjnie modyfikują enzym i pozwalają na jego wykrycie. Metoda ta ma potencjał w zakresie identyfikacji nowych celów terapeutycznych.

Metoda pomiaru aktywności enzymów deubikwitynujących w liniach komórkowych i próbkach tkanek

Prezentujemy metodę oczyszczania, wykrywania i identyfikacji peptydów diGly, które pochodzą z ubikwitynowanych białek ze złożonych próbek biologicznych. Przedstawiona metoda jest powtarzalna, solidna i przewyższa opublikowane metody pod względem poziomu szczegółowości analizy wszechobecności.

Wykrywanie miejsc ubikwitynacji białek za pomocą wzbogacania peptydów i spektrometrii mas

Ubikwitynacja to modyfikacja potranslacyjna, która odgrywa ważną rolę w procesach komórkowych i jest ściśle koordynowana przez deubikwitynację. Defekty w obu reakcjach leżą u podstaw ludzkich patologii. Udostępniamy protokoły do przeprowadzania reakcji ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro z wykorzystaniem oczyszczonych składników.

Testy ubikwitynacji i deubikwitynacji in vitro histonów nukleosomalnych

Ten protokół ma na celu ustalenie proteomów specyficznych dla ubikwityny (Ub) i ubikwitynopodobnych (Ubls) w celu identyfikacji zmian tego rodzaju modyfikacji potranslacyjnych (PTM), związanych z konkretnym stanem, takim jak leczenie lub fenotyp.

Profilowanie ubikwityny i zależnych od ubikwityny modyfikacji potranslacyjnych oraz identyfikacja istotnych zmian

Ta metoda opisuje ocenę globalnych zmian w topologii łańcucha ubikwityny. Ocena jest przeprowadzana poprzez zastosowanie ukierunkowanego podejścia proteomicznego opartego na spektrometrii mas.

Analiza łańcucha ubikwityny za pomocą równoległego monitorowania reakcji

Udostępniamy szczegółowy protokół testu ubikwitylacji specyficznego substratu i ligazy ubikwityny E3 w komórkach ssaków. HEK293T linie komórkowe wykorzystano do nadekspresji białek, poliubikwitylowany substrat oczyszczono z lizatów komórkowych metodą immunoprecypitacji i rozdzielono w SDS-PAGE. Do wizualizacji tej modyfikacji potranslacyjnej wykorzystano immunoblotting.

Ocena ubikwitylacji substratu przez ligazę ubikwityny E3 w lizatach komórek ssaków

Protokół opisuje krok po kroku metodę oczyszczania ubikwitynowanych białek z komórek ssaków na przykładzie białka supresorowego p53. Ubikwitynowane białka p53 oczyszczono z komórek w rygorystycznych warunkach niedenaturacji i denaturacji.

Oczyszczanie ubikwitynowanych białek p53 z komórek ssaków

Obecny protokół podkreśla zmodyfikowaną metodę wykrywania i ilościowego oznaczania wiązań krzyżowych DNA-białko (DPC) oraz ich modyfikacji potranslacyjnych (PTM), w tym ubikwitylacji, SUMOylacji i ADP-rybozylacji indukowanej przez inhibitory topoizomerazy i formaldehyd, umożliwiając tym samym badanie powstawania i naprawy DPC i ich PTM.

Ilościowe wykrywanie wiązań krzyżowych DNA-białko i ich modyfikacji potranslacyjnych

Eksperyment wykorzystany tutaj pokazuje metodę dokowania molekularnego w połączeniu z technologiami sond do przewidywania i walidacji interakcji między małymi cząsteczkami tradycyjnej medycyny chińskiej a celami białkowymi.

Badania przesiewowe związków tradycyjnej medycyny chińskiej pod kątem hamowania aktywności UCHL3 w oparciu o technologię molekularnego dokowania i deubikwitynacji sondy enzymatycznej

Ubikwitynacja jest kluczowym regulatorem funkcji białek wewnątrzkomórkowych. Tutaj opisujemy dwie metody lizy komórek do wykrywania poziomów ubikwitynacji białek substratowych w komórkach ssaków oraz porównujemy ich skuteczność w analizie poziomów ubikwitynacji. Nadekspresja białek w HEK293T komórkach została wywołana przejściową transfekcją, a białka ubikwitynowane wykryto analizą western blota.

Porównawcze strategie wykrywania ubiquitynacji w lizatach komórek ssaków z wykorzystaniem SMAD2/SMURF2 jako modelu

Poznaj metody wykrywania ubikwitynacji białek w komórkach hodowlanych i in vitro. Techniki te umożliwiają badanie ligaz ubikwityny i mechanizmów chorobowych.

Wykrywanie ubikwitynacji białek

Przeglądaj więcej filmów