Name: Obrazowanie egzocytozy w komórkach dwubiegunowych siatkówki za pomocą mikroskopii TIRF (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-06-09T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Poznaj metodę obrazowania egzocytozy pęcherzyków synaptycznych w komórkach dwubiegunowych siatkówki złotej rybki przy użyciu mikroskopii TIRF. Technika ta pozwala na wizualizację dynamiki uwalniania neuroprzekaźników w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca ta była finansowana z grantu NIH EY 14990.

Część 1: Disekcja i izolacja komórek bipolarnych
<ol>
<li>Przygotować roztwory wymienione w Tabeli 2; pH roztworów ringera (zewnętrznych) należy dostosować do 7,4 za pomocą NaOH, a pH roztworu wewnętrznego do 7,2 za pomocą CsOH. Roztwór wewnętrzny należy chronić przed światłem za pomocą folii aluminiowej i przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu użycia;</li>
<li>Złotą rybkę należy adaptować do ciemności przez co najmniej 30 minut przed sekcją;</li>
<li>Podczas adaptacji zwierzęcia do ciemności przygotować 5 mL roztworu hialuronidazy (hialuronidaza typu V, 1100 units/mL w roztworze ringera z niską zawartością Ca2+; Sigma, St. Louis, MO) oraz 10 mL roztworu L-cysteiny (0,5 mg/mL w roztworze ringera z niską zawartością Ca2+) i odważyć papainę (proszek liofilizowany, 40 units/mL; Sigma, St. Louis, MO) na 5 mL roztworu do trawienia;</li>
<li>Eutanazować złotą rybkę poprzez szybką dekapitację nożyczkami chirurgicznymi, a następnie zniszczyć mózg i rdzeń kręgowy ostrzem skalpela nr 11;</li>
<li>Usunąć oczy, przecinając mięśnie pozagałkowe za pomocą zakrzywionej pęsety Dumont nr 7 i przecinając nerw wzrokowy nożyczkami do tęczówki;</li>
<li>Umieścić jedno gałkę oczną na kawałku papieru filtracyjnego i przebić limbus twardówki końcówką ostrza skalpela nr 11;</li>
<li>Wprowadzić ostrze nożyczek Vannasa do otworu i wyciąć cały segment przedni;</li>
<li>Położyć mały kawałek papieru filtracyjnego na pozostałej czarence i lekko docisnąć, aby papier nasiąkł ciałem szklistym;</li>
<li>Podnieść papier filtracyjny z przytwierdzoną do niego siatkówką i przeciąć nerw wzrokowy nożyczkami Vannasa;</li>
<li>Umieścić papier filtracyjny z siatkówką w plastikowej szalce hodowlanej o średnicy 35 mm z roztworem hialuronidazy i oddzielić siatkówkę od papieru za pomocą pęsety Dumont nr 7;</li>
<li>Pokroić siatkówkę na 4-6 kawałków za pomocą połowy przemysłowego jednostronnego ostrza ze stali węglowej i pozostawić w roztworze hialuronidazy na 20 minut;</li>
<li>Podczas oczekiwania na działanie hialuronidazy dodać 5 mL roztworu L-cysteiny do papainy i odczekać, aż ciecz stanie się przezroczysta (około 5-10 minut);</li>
<li>Przemyć kawałki siatkówki 3x w roztworze ringera z niską zawartością Ca2+ i pozostawić w roztworze papainy na 30-35 minut;</li>
<li>Przemyć kawałki siatkówki 3x w roztworze ringera z niską zawartością Ca2+ i przechowywać do momentu użycia w temperaturze 4 °C w plastikowej szalce hodowlanej o średnicy 35 mm zawierającej roztwór ringera z niską zawartością Ca2+;</li>
<li>Aby dysocjować komórki, umieścić kawałek siatkówki w probówce do mikrocentryfugi zawierającej 500 mL roztworu ringera z niską zawartością Ca2+ i powoli utrzeć siatkówkę, pipetując ją w górę i w dół za pomocą szklanej pipety do dysocjacji, uważając, aby nie wytworzyć pęcherzyków powietrza. Pipety do dysocjacji wykonuje się poprzez rozgrzanie końcówki szklanej pipety Pasteura palnikiem Bunsena i lekkie zagięcie jej za pomocą pęsety anatomicznej;</li>
<li>Nanieść wyizolowane komórki, dodając kroplę zawiesiny siatkówki do własnoręcznie wykonanej komory rejestracyjnej, uprzednio wypełnionej 2 mL roztworu ringera z niską zawartością Ca2+. Komora składa się z dolnej połowy plastikowej szalki hodowlanej o średnicy 35 mm z okrągłym otworem w środku oraz okrągłego szkiełka zakryjącego o współczynniku załamania światła 1,78 (PlanOptik, Niemcy), przyklejonego do dna elastomerem silikonowym (Sylgard 184; Dow Corning, Midland, MI).</li>
</ol>
Część 2: Obciążanie komórek bipolarnych i wypłukiwanie
Obrazowanie pęcherzyków synaptycznych metodą TIRF najlepiej przeprowadzić przy użyciu mikroskopu TIRFM z obiektywem o bardzo wysokiej aperturze numerycznej (NA) i czułą kamerą. W naszych eksperymentach zdecydowaliśmy się na użycie obiektywu o NA 1.65 (Apo x100 O HR, N.A. 1.65, Olympus, Japonia) z kamerą EMCCD (Cascade 512B, Roper Scientific, Tucson, AZ). Zastosowanie obiektywu o bardzo wysokiej NA wymaga użycia szkiełek zakrywek o wysokim współczynniku załamania światła oraz odpowiedniego medium imersyjnego (diiodometanu z siarką). W naszych warunkach światło wzbudzenia jest ograniczone do pola zanikającego wykładniczo o stałej długości wynoszącej około 50 nm.
<ol>
<li>Nanieś kroplę cieczy o wysokim współczynniku załamania światła (seria M, współczynnik załamania = 1,7800, Cargille Labs, Cedar Grove, NJ) na obiektyw mikroskopu;</li>
<li>Ostrożnie umieść komorę rejestracyjną na obiektywie mikroskopu, a następnie starannie zamontuj elektrodę uziemiającą i rurkę wylotową superfuzji do komory;</li>
<li>Pozostaw komorę na mikroskopie na 10-20 minut, aby komórki mogły opaść i przytwierdzić się do dna;</li>
<li>W międzyczasie przygotuj 5 mL 1mM roztworu trolox® ((±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid; Sigma, St. Louis, MO) w roztworze Ringera z wysoką zawartością K+. Sonicuj do całkowitego rozpuszczenia;</li>
<li>Przygotuj 15 mL roztworu płuczącego ADVASEP-7: 1 mM ADVASEP-7 (Sigma, St. Louis, MO) w roztworze Ringera z niską zawartością Ca2+. Należy pamiętać, że użycie ADVASEP-7 jest opcjonalne i można z niego zrezygnować w razie potrzeby;</li>
<li>Przepłucz linie superfuzji i wprowadź do systemu superfuzji roztwór płuczący ADVASEP-7, roztwór Ringera z niską zawartością Ca2+ oraz kontrolny roztwór Ringera;</li>
<li>Wytnij pipety do ładowania z cienkościennego szkła borokrzemianowego (Kwik-Fil® TW150-3; WPI, Sarasota, FL). Rezystancja pipet typu puffer mieści się w zakresie 1,5-2,5 MΩ;</li>
<li>Przygotuj roztwory FM1-43® (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl)pyridinium dibromide, „special packaging”; Invitrogen, Carlsbad, CA). Najpierw przygotuj roztwór stokowy 1 mM, dodając 160 μL wody destylowanej do jednej fiolki (100 mg) FM1-43®. Roztwór ten można przechowywać w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia. Następnie dodaj 5 μL FM1-43® do 1 mL roztworu Ringera z wysoką zawartością K+ + 1mM trolox®. Chroń roztwór przed światłem za pomocą folii aluminiowej i przechowuj w temperaturze 4 °C do momentu użycia;</li>
<li>Włącz światło pola jasnego w mikroskopie i wyszukaj nieuszkodzone komórki bipolarne. Delikatnie stuknij w mikroskop, aby upewnić się, że neurony są mocno przytwierdzone do dna komory;</li>
<li>Ustaw końcówkę superfuzyjną blisko wybranej komórki i stale perfunduj preparat roztworem Ringera z niską zawartością Ca2+;</li>
<li>Zgaś światła w pomieszczeniu i wprowadź do toru optycznego czerwony filtr długoprzepustowy (np. RG630; Schott, Germany), aby zminimalizować wzbudzenie barwnika FM;</li>
<li>Napełnij pipetę do ładowania 10 μL roztworu barwnika FM, zamontuj pipetę w mikromanipulatorze i opuść ją na preparat bez stosowania nadciśnienia, aż znajdzie się w tej samej płaszczyźnie ogniskowej co komórka bipolarna, którą chcesz załadować. Upewnij się, że dysponujesz co najmniej dwoma uchwytami do elektrod: uchwytu użytego do barwnika FM nie można wykorzystać do patch clampingu, ponieważ mogłoby to zanieczyścić roztwór wewnątrzkomórkowy;</li>
<li>Ustaw otwór pipety puffer w odległości około 10 μm od terminala aksonu, wyłącz system superfuzji i podaj roztwór barwnika przez 10 sekund, włączając nadciśnienie w pipiecie;</li>
<li>Wyłącz nadciśnienie i, nie przesuwając pipety, odczekaj 30 sekund;</li>
<li>Włącz superfuzję i kąp komorę w roztworze ADVASEP-7 przez 5 minut. W międzyczasie wyjmij pipetę puffer z kąpieli;</li>
<li>Po 5 minutach przełącz na roztwór Ringera z niską zawartością Ca2+ i perfunduj komorę przez 25-30 minut, aby usunąć nadmiar barwnika.</li>
</ol>
Część 3: Metoda patch-clamp i obrazowanie TIRFM
<ol>
<li>Podczas wypłukiwania preparatu, wyciągnij pipety patch z grubościennego szkła borokrzemianowego (B150-86-10; Sutter Instrument Company, Novato, CA). Opór pipet patch mieści się w zakresie 8-10 MΩ;</li>
<li>Po zakończeniu wypłukiwania, umieść zakończenie aksonu w centrum pola widzenia;</li>
<li>Napełnij pipetę patch 7μL roztworu wewnętrznego, opukaj pipetę, aby usunąć pęcherzyki powietrza, pokryj ją stopionym woskiem dentystycznym (Sticky Wax; Kerr Corporation, Orange, CA) i zamocuj w mikromanipulatorze;</li>
<li>Włącz nadciśnienie w pipecie i powoli opuść pipetę na preparat. Sprawdź opór pipety w wzmacniaczu i skoryguj przesunięcia oraz pojemność pipety za pomocą odpowiednich sterowników wzmacniacza;</li>
<li>Przełącz superfuzję na kontrolny roztwór ringera. Aby utworzyć gigauszczelnienie (gigaseal) między pipetą a komórką, lekko dotknij końcówką elektrody ciała komórki i wyłącz nadciśnienie w pipecie, jednocześnie delikatnie przykładając podciśnienie do elektrody;</li>
<li>Po uzyskaniu uszczelnienia, wybierz w wzmacniaczu tryb „whole cell” i ustaw potencjał podtrzymujący komórki na -60 mV;</li>
<li>Za pomocą oprogramowania obrazującego wybierz obszar zainteresowania obejmujący całe zakończenie aksonu, wyłącz światło w polu jasnym i, krótko naświetlając (30 ms) zakończenie laserem 488 nm, znajdź odpowiednią płaszczyznę ogniskowania dla obrazowania TIRF;</li>
<li>Przebij membranę komórkową, używając komendy „zap” we wzmacniaczu podczas przykładania lekkiego podciśnienia do pipety;</li>
<li>Skoryguj pojemność komórki i opór szeregowy, a następnie zastosuj wybrany protokół napięciowy podczas obrazowania ruchu pęcherzyków synaptycznych. Na tym etapie ważne jest, aby protokół napięciowy był zsynchronizowany z częstotliwością klatek kamery. W naszym przypadku każda klatka trwa 30 ms, zatem zmiany napięcia występują w wielokrotnościach tej wartości (tj. co 300 ms lub 10 klatek);</li>
<li>Odczekaj co najmniej 40 sekund między próbami, aby umożliwić regenerację;</li>
<li>Aby sprawdzić położenie wstążek synaptycznych, wykonaj zdjęcia po włączeniu lasera 561 nm.</li>
</ol>
<img src="/files/ftp_upload/1305/fig1.jpg" alt="Schemat układu mikroskopii optycznej; wzbudzenie laserowe, emisja fluorescencyjna, filtr dichroiczny." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 1"> Rycina 1: Układ eksperymentalny. Laser 488 nm (niebieski) jest ogniskowany na obwodzie tylnej płaszczyzny ogniskowej obiektywu i ulega całkowitemu wewnętrznemu odbiciu w miejscu styku szkła z medium wodnym. Pole elektromagnetyczne generowane przez odbitą wiązkę wzbudza fluorofor wprowadzony do pęcherzyków synaptycznych znajdujących się najbliżej dna szklanej komory, które następnie fluorescują (zielony). Światło fluorescencyjne jest następnie kierowane do oka obserwatora (przedstawione) lub do kamery CCD. Potencjał błonowy obrazowanych komórek jest kontrolowany jednocześnie za pomocą techniki patch-clamp. Takie podejście umożliwia badanie zależności między sygnałami wejściowymi (napięciem błony) a odpowiedzią neuronalną (egzocytozą).
<img src="/files/ftp_upload/1305/fig2.jpg" alt="Mikroskopia izolowanego zakończenia aksonu komórki dwubiegunowej; fluorescencja, znakowanie FM 1-43, Rpep-Rhodamine." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="rycina 2"> Rycina 2: Typowe wyniki. Lewo: obraz w polu jasnym izolowanej komórki dwubiegunowej złotej rybki. Prawy górny róg: obraz TIRF pęcherzyków synaptycznych w zakończeniu aksonu komórki dwubiegunowej obciążonych barwnikiem FM 1-43® i obrazowanych laserem 488 nm (barwnik FM). Prawy dolny róg: obraz tego samego zakończenia po wykonaniu patch-clamp komórki i obrazowaniu zakończenia aksonu laserem 561 nm. Wstążki synaptyczne są znakowane peptydem wiążącym RIBEYE opartym na rhodaminie (Rpep_rhod).
Tabela 1: Specyficzne odczynniki i sprzęt.
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
<tr>
<td> Nazwa</td>
<td>Typ</td>
<td>Producent</td>
<td>Katalog</td>
<td>Komentarz</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>Stół optyczny pneumatyczny</td>
<td>Newport Corporation</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>IX70</td>
<td>Mikroskop odwrócony</td>
<td>Olympus</td>
<td>-</td>
<td>Wyposażony w lampę wolframową do pola jasnego i boczny port dostępu dla TIRF</td>
</tr>
<tr>
<td>TH4-100</td>
<td>Zasilacz lampy</td>
<td>Olympus</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>FF498_581-Di01</td>
<td>Filtr dychroiczny</td>
<td>Semrock</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>NF01-405_488_568</td>
<td>Filtr emisyjny</td>
<td>Semrock</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Apo x100 O HR</td>
<td>Obiektyw</td>
<td>Olympus</td>
<td>-</td>
<td>N.A. 1.65</td>
</tr>
<tr>
<td>RG630</td>
<td>Czerwony filtr szklany</td>
<td>Schott</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>Laser 488 nm</td>
<td>Coherent</td>
<td>-</td>
<td>Stosować przy minimalnej mocy</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>Migawka</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>VMM-D1</td>
<td>Sterownik migawki</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>Laser 561 nm</td>
<td>Melles Griot</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>Migawka</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>VMM-D3</td>
<td>Sterownik migawki</td>
<td>Uniblitz</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Perfusion Pressure Kit</td>
<td>System superfuzji</td>
<td>Automate Scientific</td>
<td>09-04</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Perfusion Pen</td>
<td>System superfuzji</td>
<td>Automate Scientific</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Valvelink 8</td>
<td>Sterownik systemu superfuzji</td>
<td>Automate Scientific</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Cascade 512B</td>
<td>Kamera EM CCD</td>
<td>Roper Scientific</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Metamorph 7.1</td>
<td>Oprogramowanie do obrazowania</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>EPC-9</td>
<td>Wzmacniacz patch-clamp</td>
<td>HEKA Elektronik</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Pulse</td>
<td>Oprogramowanie wzmacniacza</td>
<td>HEKA Elektronik</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>MP-285</td>
<td>Mikromanipulator</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>Uchwyt elektrody</td>
<td>HEKA Elektronik</td>
<td>-</td>
<td>Dla szkła o średnicy zewnętrznej 1.5 mm, 2 sztuki</td>
</tr>
<tr>
<td>Kwik-Fil® TW150-3</td>
<td>Szkło kapilarne borokrzemowe</td>
<td>WPI</td>
<td>-</td>
<td>Bez włókna</td>
</tr>
<tr>
<td>B150-86-10</td>
<td>Szkło kapilarne borokrzemowe</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>-</td>
<td>Z włóknem</td>
</tr>
<tr>
<td>P-97</td>
<td>Wytciągacz mikroelektrod</td>
<td>Sutter Instrument</td>
<td>-</td>
<td>Wyposażony w włókno w obudowie 3x3 i komorę środowiskową</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>Pompa próżniowa ciśnieniowa</td>
<td>Thomas Scientific</td>
<td>7893B05</td>
<td>Tworzy próżnię do usuwania cieczy z komory oraz nadciśnienie dla pipet</td>
</tr>
<tr>
<td>MatLab R2008a</td>
<td>Oprogramowanie analityczne</td>
<td>MathWorks</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>353001</td>
<td>Plastikowe szalki hodowlane 35 mm</td>
<td>Falcon</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>-</td>
<td>Szkło o wysokim współczynniku załamania</td>
<td>PlanOptik</td>
<td>-</td>
<td>Współczynnik załamania488 nm = 1.78</td>
</tr>
<tr>
<td>Series M</td>
<td>ciecz o wysokim współczynniku załamania</td>
<td>Cargille Labs</td>
<td>-</td>
<td>Współczynnik załamania = 1.78</td>
</tr>
<tr>
<td>Sylgard 184</td>
<td>Zestaw elastomeru silikonowego</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutathione</td>
<td>Tripeptyd</td>
<td>EMD Chemicals</td>
<td> </td>
<td>Wymiatacz wolnych rodników</td>
</tr>
<tr>
<td>Hyaluronidase</td>
<td>Enzym</td>
<td>Sigma</td>
<td>H6254</td>
<td>Typ V</td>
</tr>
<tr>
<td>L-cysteine</td>
<td>Aminokwas</td>
<td>Fluka</td>
<td>30090</td>
<td>Aktywuje papainę</td>
</tr>
<tr>
<td>Papain</td>
<td>Enzym</td>
<td>Fluka</td>
<td>76220</td>
<td>Z Carica papaya</td>
</tr>
<tr>
<td>Trolox®</td>
<td>Rozpuszczalna witamina E</td>
<td>Sigma</td>
<td>56510</td>
<td>Wymiatacz wolnych rodników</td>
</tr>
<tr>
<td>ADVASEP-7</td>
<td>Sulfonowana pochodna β-cyklodekstryny</td>
<td>Sigma</td>
<td>A3723</td>
<td>Zmniejsza fluorescencję tła FM 1-43®</td>
</tr>
<tr>
<td>FM 1-43®</td>
<td>Barwnik fluorescencyjny</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>T35356</td>
<td>„Specjalne opakowanie”</td>
</tr>
<tr>
<td>Sticky Wax</td>
<td>Środek do powlekania pipet</td>
<td>Kerr Corporation</td>
<td>-</td>
<td>Zmniejsza pojemność pipety</td>
</tr>
</tbody>
</table>
Tabela 2: Roztwory fizjologiczne użyte w niniejszym badaniu.
<table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0">
<tbody>
<tr>
<td> Substancja</td>
<td>Roztwór Ringera z niską zawartością Ca2+</td>
<td>Kontrolny roztwór Ringera</td>
<td>Roztwór Ringera z wysoką zawartością K+</td>
<td>Roztwór wewnętrzny</td>
</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
<td>120 mM</td>
<td>120 mM</td>
<td>97.5 mM</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>KCl</td>
<td>2.5 mM</td>
<td>2.5 mM</td>
<td>25 mM</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>MgCl2</td>
<td>1 mM</td>
<td>1 mM</td>
<td>1 mM</td>
<td>4 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>CaCl2</td>
<td>0.5 mM</td>
<td>2.5 mM</td>
<td>2.5 mM</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>10 mM</td>
<td>10 mM</td>
<td>10 mM</td>
<td>10 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>EGTA</td>
<td>0.75 mM</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>0.5 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Glukoza</td>
<td>10 mM</td>
<td>10 mM</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
</tr>
<tr>
<td>Glutation</td>
<td>2 mM</td>
<td>2 mM</td>
<td>-</td>
<td>1 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>CH3CsO3S*</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>100 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>TEACl</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>10 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>ATP-Mg</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>10 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>GTP-Li</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>1 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Rpep-rhod**</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>-</td>
<td>5 mM</td>
</tr>
<tr>
<td>Objętość</td>
<td>200 mL</td>
<td>100 mL</td>
<td>5 μL</td>
<td>100 μL</td>
</tr>
</tbody>
</table>
* Metanosulfonian cezu. ** Peptyd wiążący RIBEYE: rhodamine+EQTVPVDLSVARDR-cooh (mw 1997.75).

<ol><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li>
<li>Zenisek, D., Steyer, J. A., Almers, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport%2C+capture+and+exocytosis+of+single+synaptic+vesicles+at+active+zones%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones.</a> Nature. 406, 849-854 (2000).</li>
<li>Zenisek, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+association+and+exocytosis+at+ribbon+and+extraribbon+sites+in+retinal+bipolar+cell+presynaptic+terminals%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Vesicle association and exocytosis at ribbon and extraribbon sites in retinal bipolar cell presynaptic terminals.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 4922-4927 (2008).</li>
<li>Zenisek, D., Horst, N. K., Merrifield, C., Sterling, P., Matthews, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+synaptic+ribbons+in+the+living+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visualizing synaptic ribbons in the living cell.</a> J. Neurosci. 24, 9752-9759 (2004).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+very+high+aperture+microscope+objectives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Opt%22%5BJournal%5D)">Selective imaging of surface fluorescence with very high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li>
<li>Rouze, N. C., Schwartz, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continous+and+transient+vesicle+cycling+at+a+ribbon+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Continous and transient vesicle cycling at a ribbon synapse.</a> J. Neurosci. 18, 8614-8624 (1998).</li>
</ol>

Zaletami mikroskopii TIRF z zastosowaniem obiektywu są: 1) doskonałe sekcjonowanie optyczne dzięki ograniczeniu światła wzbudzenia do wąskiego obszaru w płaszczyźnie ogniskowej obiektywu, co minimalizuje wpływ światła poza ogniskiem; 2) możliwość monitorowania ruchu w kierunku pionowym jako zmiany natężenia fluorescencji, ponieważ natężenie światła spada wykładniczo wraz z odległością; 3) efektywny zbieranie światła dzięki obiektywowi o wysokiej aperturze numerycznej1,5.
Główną wad...

obrazowanie egzocytozy w bipolarnych komórkach siatkówki z wykorzystaniem mikroskopii tirf

Imaging Exocytosis in Retinal Bipolar Cells with TIRF Microscopy

Mikroskopia całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) to technika umożliwiająca badanie zdarzeń zachodzących na błonie komórkowej poprzez selekcyjne obrazowanie cząsteczek fluorescencyjnych znajdujących się najbliżej substancji o wysokim współczynniku załamania światła, takiej jak szkło1W niniejszym artykule stosujemy tę technikę do obrazowania egzocytozy pęcherzyków synaptycznych w komórkach bipolarnych siatkówki wyizolowanych z siatkówki złotej rybki. Neurony te są bardzo odpowiednie do tego rodzaju badań ze względu na ich duże zakończenia aksonalne. Dzięki jednoczesnemu zastosowaniu techniki patch-clamp w komórkach bipolarnych możliwe jest zbadanie zależności między napięciem presynaptycznym a uwalnianiem synaptycznym2,3Pęcherzyki synaptyczne w zakończeniach komórek bipolarnych są ładowane barwnikiem fluorescencyjnym (FM 1-43®) poprzez jednoczesne podawanie barwnika i roztworu Ringera zawierającego wysoką zawartość K+koncentracja na zakończeniach synaptycznych. Powoduje to depolaryzację komórek i stymuluje endocytozę, a w konsekwencji pobieranie barwnika do pęcherzyków glutaminergicznych. Po wypłukaniu nadmiaru barwnika przez około 30 minut komórki są gotowe do rejestracji metodą patch-clamp i jednoczesnego obrazowania za pomocą lasera o długości fali 488 nm. Roztwór w pipecie patch zawiera peptyd oparty na rodaminie, który wiąże się selektywnie z białkiem wstążki synaptycznej RIBEYE4, co pozwala na specyficzne znakowanie wstęg podczas obrazowania zakończeń za pomocą lasera o długości fali 561 nm. Umożliwia to precyzyjną lokalizację stref aktywnych oraz odróżnienie zdarzeń synaptycznych od pozasynaptycznych.

W niniejszym filmie demonstrujemy sposób znakowania i wizualizacji pojedynczej egzocytozy oraz transportu pęcherzyków synaptycznych w komórkach bipolarnych siatkówki złotych rybek przy użyciu mikroskopii TIRF (całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji).

Obrazowanie egzocytozy w bipolarnych komórkach siatkówki z wykorzystaniem mikroskopii TIRF

Mikroskopia fluorescencyjna z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRF) to technika pozwalająca na badanie zjawisk zachodzących w błonie komórkowej poprzez selektywne...

Procedura ta rozpoczyna się od wycięcia siatkówki nerwowej u dorosłych złotych rybek, która stanowi tkankę nerwową znajdującą się w tylnej części oka. Siatkówki umieszcza się w roztworze enzymatycznym na 35 minut, a następnie płucze i traktuje wypalaną szklaną pipetą w celu dysocjacji komórek. Następnie komórki wysiewa się na szklane szkiełka nakrywkowe o wysokim współczynniku załamania światła i umieszcza w plastikowych naczyniach do hodowli tkankowej.Izolowane komórki bipolarne są identyfikowane po ich charakterystycznej morfologii zakończeń. Podajemy na nie przez 10 sekund roztwór zawierający FM 1 43, a następnie odczekujemy 30 sekund przed wypłukaniem barwnika. Po 30-minutowym płukaniu komórki są poddawane technice patch-clamp oraz obrazowaniu za pomocą mikroskopii TIRF.Cześć, nazywam się Christina Jovi i pochodzę z laboratorium ZEC w Katedrze Fizjologii Komórkowej i Molekularnej w Yale University School of Medicine. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę badania egzocytozy w żywych bipolarnych komórkach siatkówki z wykorzystaniem mikroskopii TIRF. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania mechanizmów uwalniania synaptycznego.Zacznijmy. Na początek poddaj złotą rybkę adaptacji do ciemności przez co najmniej 30 minut przed sekcją. Po odcięciu głowy i usunięciu oka, umieść gałkę oczną na fragmencie papieru filtracyjnego i za pomocą ostrza skalpela nr 11 wykonaj nacięcie w obrębie limbusa twardówki. Wewnątrz wykonanego otworu.Używając nożyczek typu bonna, wyciąć cały odcinek przedni. Następnie położyć mały kawałek papieru filtracyjnego na pozostałej czace nerwu wzrokowego i lekko go docisnąć. Aby wchłonąć ciało szkliste, unieść papier filtracyjny wraz z przyczepioną siatkówką i za pomocą nożyczek VNA przeciąć nerw wzrokowy.Umieść papier filtracyjny z siatkówką w 35 milimetrowym plastikowym naczyniu hodowlanym zawierającym roztwór wysokiego stężenia kwasu hialuronowego i za pomocą pęsety Dumont nr 7 oddziel siatkówkę od papieru filtracyjnego. Następnie, używając połowy przemysłowego jednoostrzowego ostrza ze stali węglowej, podziel siatkówkę na cztery do sześciu kawałków i pozostaw je w roztworze hialuronidazy na 20 minut. Podczas oczekiwania na działanie hialuronidazy, dodaj pięć mililitrów roztworu L-cysteiny do papainy i odstaw na około 5 do 10 minut, aż płyn stanie się przezroczysty. Przemyj kawałki siatkówki trzy razy w roztworze Ringera o niskiej zawartości wapnia i pozostaw je w roztworze papainy na 30 do 35 minut.Po 35 minutach inkubacji w roztworze papainy trzykrotnie przemyj fragmenty siatkówki. Przenieś fragmenty do plastikowej szalki hodowlanej o średnicy 35 mm zawierającej roztwór Ringera o niskiej zawartości wapnia i przechowuj szalkę w temperaturze od 12 do 14 °C do momentu rozpoczęcia dysocjacji komórek.W pierwszej kolejności należy wykonać pipetę do dysocjacji, rozgrzewając końcówkę szklanej pipety pasterskiej za pomocą palnika i lekko ją wyginając pęsetą anatomiczną. Kawałek siatkówki umieszcza się w probówce do mikrocentryfugi zawierającej roztwór Ringera z niską zawartością wapnia, a następnie powoli dysocjuje siatkówkę, ostrożnie pipetując ją w górę i w dół za pomocą przygotowanej pipety do dysocjacji. Dbając o to, aby nie powstały pęcherzyki powietrza, należy nanieść wyizolowane komórki, dodając kroplę zawiesiny siatkówki do własnoręcznie wykonanej komory rejestracyjnej wypełnionej roztworem Ringera z niską zawartością wapnia.Komora składa się z dolnej połowy plastikowej szalki hodowlanej o średnicy 35 milimetrów z okrągłym otworem w środku oraz z okrągłego szkiełka podstawowego wykonanego ze szkła o współczynniku załamania 1,78, przyklejonego do dna. Po zakończeniu dyssekcji i izolacji komórek bipolarnych możemy przystąpić do ładowania komórek bipolarnych i ich wypłukiwania. W tym doświadczeniu najlepiej zastosować mikroskop fluorescencyjny z całkowitym wewnętrznym odbiciem typu obiektywnego, wyposażony w obiektyw o bardzo wysokiej aperturze numerycznej i czułą kamerę.W tym filmie będziemy korzystać z obiektywu o aperturze numerycznej 1,65 oraz z urządzenia CCD z mnożeniem elektronów. Aby rozpocząć, nanieś kroplę cieczy o wysokim współczynniku załamania światła na obiektyw mikroskopu. Umieść komorę rejestracyjną na obiektywie mikroskopu.Ostrożnie zamontuj elektrodę uziemiającą oraz rurkę wylotową superfuzji do komory. Pozostaw komorę na mikroskopie na 10 do 20 minut, aby komórki mogły opaść i przytwierdzić się do dna. Następnie przepłucz linie superfuzji i dodaj roztwór płuczący.Wlej roztwór Ringera z niską zawartością wapnia oraz kontrolny roztwór Ringera do systemu superfuzji. Włącz światło pola jasnego w mikroskopie i wyszukaj nienaruszone komórki bipolarne. Delikatnie stuknij w mikroskop, aby upewnić się, że neurony są mocno przytwierdzone do dna komory.Umieść pióro do superfuzji blisko nienaruszonej komórki i stale perfunduj preparat roztworem Ringera o niskiej zawartości wapnia. Następnie wyłącz światło w pomieszczeniu i wprowadź do toru optycznego czerwony filtr długoprzepustowy, aby zminimalizować wzbudzenie barwnika fluorescencyjnego. Napełnij pipetę do ładowania 10 µL roztworu barwnika fluorescencyjnego.Zamocuj go w mikromanipulatorze, a następnie opuść na preparat, nie korzystając z opcji nadciśnienia, aż znajdzie się w tej samej płaszczyźnie ogniskowania co wybrana komórka dwubiegunowa. Umieść otwór do aplikacji impulsu (puffer) w odległości około 10 micrometers od terminala aksonalnego. Wyłącz system superfuzyjny i podaj roztwór barwnika impulsem przez 10 seconds, włączając nadciśnienie pipety.Teraz należy wyłączyć nadciśnienie i, nie przesuwając pipety, odczekać 30 sekund, włączyć system superfuzji i płukać komorę roztworem płuczącym przez pięć minut. W tym czasie należy wyjąć pipetę buforującą z kąpieli.Po pięciu minutach przełącz system SUPERFUSION na roztwór Ringera o niskiej zawartości wapnia i przeprowadzaj perfuzję przez 25 do 30 minut, aby usunąć nadmiar barwnika. Po zakończeniu ładowania i wypłukiwania komórek dwubiegunowych możemy przystąpić do patch clampingu oraz obrazowania T-I-R-F-M. Po zakończeniu procesu wypłukiwania wymień uchwyty elektrod, aby zapobiec zanieczyszczeniu pipety patch barwnikiem.Umieść zakończenie aksonu w centrum pola widzenia. Napełnij pipetę patch 7 µL roztworu wewnętrznego. Opukaj ją, aby usunąć pęcherzyki powietrza.Pokryć go stopionym woskiem dentystycznym, a następnie zamocować w mikromanipulatorze. Włączyć nadciśnienie w pipecie i powoli opuścić ją na preparat. Sprawdzić opór pipety i wprowadzić ewentualne korekty.Następnie, przy ustawieniu systemu superfuzji na kontrolny roztwór Ringera, należy utworzyć giga-uszczelnienie (giga seal) pomiędzy pipetą a komórką, lekko dotykając końcówką elektrody ciała komórki. Po wyłączeniu nadciśnienia w pipecie, należy delikatnie przyłożyć podciśnienie do elektrody podczas uszczelnienia. W wzmacniaczu należy wybrać tryb whole-cell i ustawić potencjał trzymania komórki na -60 mV.Następnie przy użyciu oprogramowania do obrazowania zaznaczyć obszar zainteresowania obejmujący całe zakończenie aksonu. Wyłączyć światło w polu jasnym i krótko naświetlić zakończenie laserem o długości fali 488 nanometrów. Odnaleźć odpowiednią płaszczyznę ogniskowania do obrazowania TIRF.Następnie należy przeprowadzić przebicie błony komórkowej, używając funkcji zap wzmacniacza, przy jednoczesnym przyłożeniu lekko ujemnego ciśnienia do pipety, korygując pojemność komórki oraz oporność szeregową. Następnie należy zastosować protokół napięciowy, obrazując ruch pęcherzyków synaptycznych. Należy odczekać co najmniej 40 sekund pomiędzy próbami, aby umożliwić regenerację.W pierwszej kolejności wybieramy komórkę dwubiegunową w mikroskopii w polu jasnym. Następnie zwiększamy powiększenie i wprowadzamy barwnik fluorescencyjny do zakończenia aksonu. Po 30-minutowym płukaniu, wypełnione zakończenie może zostać zobrazowane pod mikroskopem wraz z ruchem fluorescencyjnych pęcherzyków glutaminergicznych.W niniejszej części wprowadzamy peptyd wiążący się z wstążką synaptyczną za pomocą pipety do patch-clampu, co pozwala nam na wizualizację położenia wstążek synaptycznych podczas obrazowania laserem o długości fali 561 nanometrów. Następnie depolaryzujemy komórki i obrazujemy ruch pęcherzyków za pomocą lasera o długości fali 488 nanometrów. Przedstawiliśmy właśnie sposób dysocjacji, wysiewania na płytki i obciążania komórek dwubiegunowych siatkówki barwnikiem fluorescencyjnym, a także sposób rejestracji tych neuronów metodą patch-clamp z jednoczesnym obrazowaniem za pomocą mikroskopii TIRF.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie wystawiać komórek na zbyt długie działanie lasera. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.

imaging-exocytosis-in-retinal-bipolar-cells-with-tirf-microscopy

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Obrazowanie eksocytozy w komórkach zwojowych wzrokowych za pomocą mikroskopii TIRF

W niniejszej pracy opisujemy protokół przygotowania skrawków siatkówki zatopionych w agarze, które nadają się do elektrofizjologii oraz obrazowania Ca2+. Metoda ta pozwala na badanie synaps wstążkowych w mikroobwodach siatkówki przy użyciu bezpośrednich rejestracji patch-clamp z pojedynczych przedsynaptycznych zakończeń nerwowych.

Pomiary pojemności metodą patch-clamp oraz obrazowanie Ca2+ w pojedynczych zakończeniach nerwowych w skrawkach siatkówki

Kompartmentacja białek,y zarówno w obrębie błony plazmatycznej, jak i w lokalizacjach wewnątrzkomórkowych, jest jednym z mechanizmów regulacyjnych, który może w znacznym stopniu wpływać na wyniki sygnalizacji; dlatego w celu zrozumienia sygnalizacji istotne jest badanie zachowania przestrzennego i czasowego zaangażowanych białek. Opisujemy tutaj system oparty na mikroskopii TIRF do badania transdukcji sygnału w limfocytach T, który jednak znajduje szerokie zastosowanie.

Technika mikroskopii TIRF do jednoczesnego obrazowania w czasie rzeczywistym TCR oraz powiązanych z nim białek sygnałowych

Źródło: Daniele, F.,  et. al Sondy TIRFM i pH GFP do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych. J. Vis. Exp. (2015). Ten film pokazuje obrazowanie ludzkich komórek nerwiaka zarodkowego przy użyciu mikroskopu całkowitej fluorescencji wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji pęcherzyków synaptycznych znakowanych fluoroforem. Komórki są najpierw skupiane w trybie epifluorescencji. Następnie dokonuje się regulacji,...

Obrazowanie komórek przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego odbicia wewnętrznego

Źródło: Winkle, C. C., et al. Wykorzystanie połączonych metodologii w celu zdefiniowania roli dostarczania błony plazmatycznej podczas rozgałęziania aksonów i morfogenezy neuronów. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia mikroskopię fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF) do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych w neuronach korowych. Wrażliwy na pH marker białka zielonej fluorescencji (GFP) fluoryzuje po fuzji pęcherzyków, z selektywnym wzbudzeniem TIRF wychwytującym egzocytozę...

Mikroskopia fluorescencyjna całkowitego odbicia wewnętrznego do wizualizacji zdarzeń egzocytarnych 

Mikroskopia fluorescencyjna z pełnym wewnętrznym odbiciem (pTIRFM) oparta na polaryzacji umożliwia wykrywanie dynamiki błony komórkowej w czasie rzeczywistym. W artykule opisano implementację pTIRFM do badania przebudowy błony podczas regulowanej egzocytozy. Technikę tę można uogólnić na inne procesy w biologii komórki, które bezpośrednio lub pośrednio wiążą się ze zmianami kształtu błony.

Obrazowanie deformacji błony plazmatycznej za pomocą pTIRFM

Endocytoza za pośrednictwem klatryny, szybki i bardzo dynamiczny proces internalizuje wiele białek, w tym receptory sygnałowe. Opisany tutaj protokół bezpośrednio wizualizuje kinetykę poszczególnych zdarzeń endocytarnych. Ma to zasadnicze znaczenie dla zrozumienia, w jaki sposób rdzeniowi członkowie maszynerii endocytarnej koordynują się ze sobą i jak ładunek białka wpływa na ten proces.

Wizualizacja endocytozy receptorów sprzężonych z białkiem G za pośrednictwem klatryny w rozdzielczości pojedynczego zdarzenia za pomocą mikroskopii TIRF

Ten artykuł przedstawia metodę badania dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach neuroblastoma, przy użyciu konstruktu synaptobrevin2-pHluorin i mikroskopii fluorescencyjnej całkowitego wewnętrznego odbicia. Przedstawiono również opracowaną strategię przetwarzania obrazów i analizy danych.

Sondy GFP TIRFM i pH do oceny dynamiki pęcherzyków neuroprzekaźników w komórkach nerwiaka zarodkowego SH-SY5Y: obrazowanie komórek i analiza danych

Tutaj szczegółowo opisujemy metodę obrazowania żywych komórek regulowanej egzocytozy. Metoda ta wykorzystuje dekstran FITC, który gromadzi się w organellach związanych z lizosomami, jako reporter. Ta prosta metoda pozwala również na rozróżnienie różnych trybów regulowanej egzocytozy w komórkach, które są trudne do manipulowania genetycznie.

Obrazowanie FITC-dekstranu jako reportera regulowanej egzocytozy

Obrazowanie in vivo jest potężnym narzędziem do badania biologii w zdrowiu i chorobie. Protokół ten opisuje obrazowanie przezźrenicowe siatkówki myszy za pomocą standardowego mikroskopu dwufotonowego. Zademonstrowano również różne metody obrazowania in vivo, które umożliwiają fluorescencyjne znakowanie wielu kohort komórkowych siatkówki.

Przezźrenicowe dwufotonowe obrazowanie in vivo siatkówki myszy

Praca ta przedstawia alternatywne przygotowanie siatkówki płaskie, w którym usunięcie ciał komórek fotoreceptorowych umożliwia szybszą dyfuzję przeciwciał oraz poprawiony dostęp pipety plastrowej do wewnętrznych neuronów siatkówki do immunohistochemii, hybrydyzacji in situ oraz eksperymentów elektrofizjologicznych.

Rozdzielona siatkówka jako ulepszone przygotowanie płaskie do badania neuronów wewnętrznej warstwy jądrowej w siatkówce kręgowej

Niniejszy artykuł demonstruje metodę wizualizacji i ilościowej ruchliwości mikrogleju oraz kontaktu z postsynaptycznymi punktami siatkówki za pomocą obracającej się mikroskopii konfokalnej dysku.

Obrazowanie na żywo i charakteryzacja dynamiki mikrogleju oraz interakcji z synapsami w chorej siatkówce myszy

Poznaj metodę obrazowania egzocytozy pęcherzyków synaptycznych w komórkach dwubiegunowych siatkówki złotej rybki przy użyciu mikroskopii TIRF. Technika ta pozwala na wizualizację dynamiki uwalniania neuroprzekaźników w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie egzocytozy w bipolarnych komórkach siatkówki z wykorzystaniem mikroskopii TIRF

Przeglądaj więcej filmów