Połączenie przeszczepu nerwu obwodowego i modulacji macierzy w celu naprawy uszkodzonego rdzenia kręgowego szczura

Przygotowanie do przeszczepienia nerwu obwodowego w miejsce uszkodzenia rdzenia kręgowego rozpoczyna się od wstępnej degeneracji PNG na siedem do 10 dni przed przeszczepieniem. Gałąź nerwu piszczelowego od szczura dawcy zostaje przecięta. Aspiracyjnie wykonuje się hemisekcję na poziomie piątego odcinka szyjnego lub C5.

Nerw kulszowy (PNG) zostaje pobrany od szczura dawcy, przyłożony do rostralnej ściany jamy uszkodzenia i zabezpieczony poprzez przyszycie okostnej do opony twardej. Trzy tygodnie później wykonuje się uszkodzenie w grzbietowym kwadrancie na poziomie C7; do jamy wprowadza się na 15 minut gąbkę żelową nasyconą chondroitynazą ABC (C-H-A-B-C), aby strawić proteoglikany blizny glejowej. Dwa dni później C-H-A-B-C jest wstrzykiwana mikrostrzykawką w sąsiedztwie miejsca uszkodzenia, a dystalny koniec PNG zostaje przyłożony do uszkodzenia w grzbietowym kwadrancie.

Witajcie, jestem John Hula. Jestem dyrektorem Centrum Badań nad Urazami Rdzenia Kręgowego w Drexel University College of Medicine. Jestem dr Veronica Tom z laboratorium Hula, a ja jestem Martha Mean.

Z laboratorium hula. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przeszczepienia segmentu nerwu obwodowego do uszkodzonego rdzenia kręgowego dorosłego szczura. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania regeneracji aksonów oraz powrotu funkcji po urazie rdzenia kręgowego.

Zacznijmy. Aby przygotować się do operacji mikroschirurgicznej, należy zdezynfekować stanowisko operacyjne i wysterylizować w autoklawie wszystkie narzędzia chirurgiczne. Przygotuj barierę termiczną oraz małe fragmenty gąbki żelowej o rozmiarach mniejszych niż 2 mm³ do mikrohemostazy.

Przygotuj patyczki bawełniane, gaziki oraz narzędzia chirurgiczne. Umieść znieczulonego szczura na stole preparacyjnym po potwierdzeniu całkowitego znieczulenia zwierzęcia za pomocą uciśnięcia palca stopy. Wygol szeroki obszar futra w zamierzonym polu operacyjnym, a następnie umyj miejsce nacięcia zgodnie z techniką aseptycznego mycia skóry opisaną w towarzyszącym protokole tekstowym.

Następnie umieść szczura na barierze termicznej, przykryj jego nos i pysk lejkiem inhalacyjnym, a następnie zmniejsz stężenie izofluranu do 3% i przepływ do 0,2 litrów na minutę. Podaj odpowiednią dawkę antybiotyku ampicyliny poprzez wstrzyknięcie podskórne oraz leku przeciwbólowego buprenorfiny poprzez wstrzyknięcie domięśniowe. Nerw obwodowy (PN) zostaje przecięty od siedmiu do 10 dni przed jego usunięciem w celu promowania degeneracji, co stwarza środowisko bardziej sprzyjające wzrostowi aksonów niż świeży preparat nerwu.

Aby rozpocząć przecięcie nerwu kulszowego, ułóż zwierzę na boku. Załóż sterylne rękawiczki i rozłóż sterylną draperię chirurgiczną wokół miejsca operacji. Wykonaj nacięcie w linii prostej od głowy kości udowej do kolana, prowadząc je równolegle i w odległości około trzech milimetrów od kości udowej; przetnij powierzchowne mięśnie biceps fems wzdłuż tej samej linii co nacięcie skóry, aby odsłonić znajdujący się pod nimi mięsień obszerny boczny.

Po odsłonięciu mięśnia obszernego bocznego, należy za pomocą nożyczek wykonać w nim niewielkie nacięcie w pobliżu kolana, a następnie przedłużyć je w kierunku głowy kości udowej. Delikatnie rozsunąć mięśnie obszerne boczne za pomocą rozsierników, aż do momentu uwidocznienia gałęzi piszczelowej i strzałkowej nerwu kulszowego, biegnących równolegle do kości udowej. Następnie należy śledzić te gałęzie nerwowe w kierunku głowy kości udowej, aż do zidentyfikowania głównego pnia nerwu kulszowego.

Tuż poniżej rozwidlenia nerwu kulszowego, za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie oddziel tkankę łączną lub epineurium otaczające gałąź nerwu piszczelowego. Jest to gałąź większa. Po wyizolowaniu gałęzi nerwu piszczelowego, załóż wokół niej ligaturę z jedwabiu 6-0 i zaciśnij.

Za pomocą mikronożyczek przetnij nerw w odcinku od miejsca podwiązania. Przełóż nić szewną przez mięsień obszerny boczny i zawiąż w węzeł. Umożliwi to łatwą lokalizację przeciętego końca nerwu piszczelowego.

Po pobraniu nerwu należy zaszyć mięsień obszerny boczny szwami z jedwabiu 6-0. Następnie należy zaszyć mięsień biceps femoris szwami z jedwabiu 6-0.

Na koniec zamknij skórę za pomocą klipsów chirurgicznych Michelle. Wyłącz dopływ izofluranu i usuń stożek nosowy do inhalacji. Umieść zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej.

Zwróć zwierzę do jego klatki domowej. Gdy zwierzę będzie już czujne i aktywne, od siedmiu do 10 dni później, segment PN będzie gotowy do pobrania. Aby rozpocząć transplantację, umieść znieczulone zwierzę na barierze termicznej.

Po potwierdzeniu, że zwierzę jest w pełni znieczulone, usuń klamry rany i rozchyl nacięcie skóry. Wstępne golenie obszaru może nie być konieczne, ponieważ skóra powinna łatwo się rozdzielić, co zapobiega zanieczyszczeniu. Aby uniknąć konieczności przecinania futra, przetnij szew powierzchownego mięśnia, aby odsłonić mięsień obszerny boczny, a następnie przetnij szew w tym mięśniu.

Prześledź linię szwu do przeciętego końca nerwu piszczelowego i usuń szew z nerwu. Za pomocą precyzyjnej pęsety oddziel epineurium na odcinku 15 milimetrów nerwu piszczelowego, a następnie przetnij ten dystalny koniec. Usuń segment nerwu i zanurz go w sterylnym zrównoważonym roztworze soli Hanksa.

Jesteśmy teraz gotowi do kolejnego kroku, którym jest wywołanie uszkodzenia rdzenia kręgowego w celu transplantacji PN; transplantacja może być autologiczna lub heterologiczna. Umieść znieczulonego szczura na barierze termicznej i podaj antybiotyki oraz leki przeciwbólowe zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji, aby wywołać hemisekcję rdzenia kręgowego. Najpierw zlokalizuj wcięcie potyliczne oraz wystający wyrostek kolczysty drugiego kręgu piersiowego (T2).

Wykonaj nacięcie na całej długości pomiędzy tymi zewnętrznymi punktami orientacyjnymi. Przetnij linię środkową powierzchownego mięśnia czworobocznego i rozdziel znajdujące się pod nim mięśnie szyjne. Wprowadź rozwieracz, aby utrzymać mięśnie w rozdzieleniu.

Głębokie mięśnie nadkręgowe należy odciąć od wyrostków kolczystych kręgów C4, C5 i C6. Za pomocą narzędzi rongeurów należy wykonać częściową laminektomię na poziomie C5, aby odsłonić całą prawą stronę oraz przyśrodkową część lewej strony rdzenia kręgowego. Jako punkt orientacyjny linii środkowej rdzenia kręgowego należy wykorzystać wyraźną żyłę grzbietową.

Następnie za pomocą ostrza mikroskalpela należy przebić oponę twardą i przedłużyć nacięcie nad rdzeniem kręgowym na poziomie piątego kręgu szyjnego (C5). Przy użyciu wyciągniętej szklanej mikrokaniuli należy wykonać niewielkie nacięcie w znajdującej się poniżej przestrzeni podpajęczynówkowej i oponie miękkiej. Należy rozpocząć aspirację grzbietowej prawej strony rdzenia kręgowego, stosując delikatny nacisk i mikropincetę w celu oddzielenia tkanki i ułatwienia jej usunięcia.

Kontynuuj nacięcia przez części pośrednią i brzuszną rdzenia kręgowego, aby utworzyć jamę o długości 2 mm, przechodzącą całkowicie od strony grzbietowej do brzusznej oraz od linii środkowej do bocznych opon mózgowo-rdzeniowych. Umieść nasączoną solą fizjologiczną gąbkę żelową w jamie uszkodzenia sekcji HEMI. Aby uzyskać hemostazę, wyjmij wcześniej pobrany odcinek nerwu obwodowego z roztworu Hank'a.

Delikatnie odsuń epineurium z proksymalnych trzech milimetrów segmentu nerwu i przyłóż ten koniec do rostralnej ściany jamy ubytku w przekroju HEMI. Zabeziecz segment, wykonując 10 szwów przez epineurium do opony twardej. Następnie zaszyj oponę twardą nad implantowanym końcem przeszczepu, umieszczając przeszczep pomiędzy dwoma kawałkami elastycznej membrany celulozowej.

Umieść przeszczep wzdłuż wyrostków kręgów C6, C7 i T1. Nie doprowadź do zetknięcia dystalnego końca nerwu z rdzeniem kręgowym lub tkanką mięśniową. Zamknij mięśnie warstwowo, używając szwów 4-0, a nacięcie skóry zamknij za pomocą klipsów chirurgicznych.

Na koniec umieść zwierzę w klatce przetrzymującej na bariery termicznej, a następnie przenieś je z powrotem do klatki macierzystej. Gdy zwierzę odzyska czujność i stanie się aktywne, zregenerowane aksony docierające do dystalnego końca przeszczepu PN często nie są w stanie ponownie wrastać do rdzenia kręgowego. Dlatego stosujemy mikroiniekcje chondroitynazy AC w celu degradacji tkanki bliznowatej otaczającej obszar urazu.

Procedurę tę przeprowadza się 21 dni po transplantacji PN; należy upewnić się, że zwierzę jest całkowicie znieczulone. Następnie usuwa się klamry ranne oraz podaje antybiotyki i środki przeciwbólowe zgodnie z wcześniejszą procedurą. Za pomocą precyzyjnych pęset i nożyczek sprężynowych przecina się szwy powierzchowne, aby odsłonić błonę sprężystą otaczającą przeszczep nerwowy.

Ostrożnie uwolnij odcinek nerwu z elastycznych błon otaczających. Odsuń nerw z pola operacyjnego. Wykonaj częściową laminektomię po prawej stronie wyrostka kręgu C7.

Przebij oponu mikro skalpelem i za pomocą aspiracji przygotuj ubytek o objętości jednego milimetra sześciennego w kwadrancie grzbietowym rdzenia kręgowego na poziomie C7. Umieść w jamie ubytku gąbkę żelatynową nasączoną solą fizjologiczną w celu uzyskania hemostazy. Następnie zastąp gąbkę żelatynową taką, która została nasączona chondroityną.

A BC.Miejscu zmiany należy poddawać działaniu preparatu przez 15 minut, przykładając świeżą gąbkę żelową nasączoną chondroityną co pięć minut. Zewnętrzną długość przeszczepu nerwowego należy pokryć błoną scholastic. Mięśnie powierzchowne zamyka się szwami 4-0, a nacięcie skóry klipsami chirurgicznymi.

Umieść zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej, a następnie przenieś je z powrotem do klatki macierzystej, gdy odzyska czujność i aktywność. Dwa dni później, w 23. dniu po przeszczepieniu PN, u zwierzęcia ponownie wykonuje się zabieg w celu mikroiniekcji chondroityny NA do rdzenia kręgowego. Podobnie jak wcześniej, u znieczulonego zwierzęcia usuwa się klamry ranne i podaje antybiotyki oraz leki przeciwbólowe.

Przetnij szwy powierzchowne, aby odsłonić błonę elastyczną otaczającą przeszczep nerwowy. Odsłoń miejsce przeszczepu C7, uważając, aby nie naruszyć samego przeszczepu. Następnie, używając strzykawki Hamiltona z wyciągniętą szklaną kaniulą, wykonaj mikroiniekcję 1 µL chondroityny ace A BC w prawą stronę rdzenia kręgowego, około 1 mm dystalnie od miejsca połączenia przeszczepu z rdzeniem kręgowym.

Ostrożnie odsunąć EUR z dystalnych dwóch milimetrów odcinka nerwu i przyłożyć ten koniec do jamy ubytku na poziomie C7. Zabezpieczyć odcinek, wykonując szwy 10-0 przez epineurium do twardej opony. Zamknąć mięśnie powierzchowne szwami 4-0, a nacięcie skóry za pomocą klipsów chirurgicznych.

Umieść zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej, a następnie przenieś je z powrotem do klatki domowej, gdy odzyska pełną świadomość i aktywność. Po zoptymalizowaniu tej procedury segment nerwu obwodowego ściśle zintegruje się z rdzeniem kręgowym gospodarza, co pozwoli na wizualizację aksonów rdzeniowych regenerujących się w przeszczepie. Przeszczep wypełniliśmy metodą dyfuzyjną biotynilowaną dekstryną aminową (BDA) w kierunku wstępującym i zstępującym.

Aksony rdzeniowe zazwyczaj wnikają do przeszczepu, rosną w stosunkowo prostej linii równolegle do jego długości i rozciągają się do dystalnego końca przeszczepu z prędkością około jednego milimetra na dobę. Aksony nerwów obwodowych przenikają do sąsiedzącego rdzenia kręgowego. Jeśli do usunięcia hamujących proteoglikanów z otaczającej tkanki bliznowatej zastosowano chondroitynazę ABC, to po dotarciu do końca dystalnego bardzo niewiele aksonów nerwów obwodowych rozszerza się do tkanki gospodarza w porównaniu z grupą traktowaną placebo.

Jednakże, jeśli dystalna część interfejsu została potraktowana chondroityną, znacznie więcej aksonów wyłania się z przeszczepu, aby ponownie zinnervować rdzeń kręgowy. Jak pokazano tutaj na tym jednym przekroju reprezentacyjnym spośród 15 do 20 przekrojów na zwierzę, w których zaobserwowano wzrost aksonów, wykres słupkowy ten wykazuje istotny wzrost odrostów aksonalnych po leczeniu chondroityną. Immunochemiczna detekcja markerów synaptycznych w neuronach rdzenia kręgowego w odpowiedzi na stymulację elektryczną aksonów wewnątrz przeszczepu może być wykorzystana do oceny funkcjonalnej łączności pomiędzy przeszczepionym graftem a rdzeniem kręgowym gospodarza.

Ten obszar rdzenia kręgowego zawierający dystalny punkt styku został poddany barwieniu immunocytochemicznemu zarówno dla biotynilowanej dekstryny aminowej w kolorze zielonym, jak i dla markera synaptycznego synapsyny w kolorze czerwonym; groty strzałek wskazują obszary kolokalizacji markerów, co świadczy o tym, że niektóre włókna zregenerowane z przeszczepu utworzyły funkcjonalne połączenia synaptyczne. Funkcjonalna łączność między neuronami przeszczepu i rdzenia kręgowego została również wykazana poprzez analizę ekspresji CFOs. Po stymulacji synaptycznej neuronów gospodarza poza dystalnym interfejsem ten transsynaptyczny marker aktywacji można zidentyfikować poprzez obecność wielu neuronów pozytywnych pod kątem CFOs w tkance po stronie ipsilateralnej względem miejsca przeszczepu, natomiast przy większym powiększeniu w tkance po stronie kontralateralnej do przeszczepu można zaobserwować bardzo niewielką liczbę neuronów pozytywnych pod kątem CFOs.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób przygotowania miejsca uszkodzenia rdzenia kręgowego przed przeszczepieniem graftu nerwu obwodowego w celu promowania regeneracji po urazie rdzenia kręgowego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zapewnić wystarczającą długość nerwu przed przeszczepieniem oraz ścisłe przyleganie graftu do miejsca uszkodzenia rdzenia kręgowego. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.