Połączenie przeszczepu nerwu obwodowego i modulacji macierzy w celu naprawy uszkodzonego rdzenia kręgowego szczura

Przygotowanie do przeszczepienia nerwu obwodowego do miejsca uszkodzenia rdzenia kręgowego rozpoczyna się od przeddegeneracji PNG na siedem do 10 dni przed przeszczepieniem. Od szczura dawcy przecina się gałąź nerwu piszczelowego. Poprzez aspirację wykonuje się hemisekcję na poziomie piątego odcinka szyjnego (C5).

Nerw obwodowy (PNG) zostaje pobrany od szczura dawcy, umieszczony naprzeciw przedniej ściany jamy uszkodzenia i przymocowany poprzez przyszycie do opony twardej. Po trzech tygodniach wykonuje się uszkodzenie w tylnym kwadrancie na poziomie C7; w jamę uszkodzenia wprowadza się na 15 minut gąbkę żelową nasączoną enzymem chondroitynasą ABC (CHABC) w celu trawienia proteoglikanów blizny glejowej. Po dwóch dniach CHABC jest wstrzykiwana za pomocą mikroiniekcji w sąsiedztwie miejsca uszkodzenia, a dystalny koniec PNG zostaje umieszczony naprzeciw uszkodzenia w tylnym kwadrancie.

Witajcie, jestem John Hula. Jestem dyrektorem Centrum Badań nad Urazami Rdzenia Kręgowego w Drexel University College of Medicine. Jestem dr Veronica Tom z laboratorium Hula, a ja jestem Martha Mean.

Z laboratorium hula. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przeszczepienia segmentu nerwu obwodowego do uszkodzonego rdzenia kręgowego dorosłego szczura. W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę w celu badania regeneracji aksonów oraz powrotu funkcji po urazie rdzenia kręgowego.

Zacznijmy. Aby przygotować się do mikrochirurgii, zdezynfekuj stanowisko operacyjne i wysterylizuj wszystkie instrumenty chirurgiczne w autoklawie. Przygotuj barierę termiczną oraz małe, o objętości mniejszej niż 2 mm³, kawałki gąbki żelatynowej do mikrohemostazy.

Przygotuj patyczki bawełniane, gaziki oraz narzędzia chirurgiczne. Umieść znieczulonego szczura na stole preparacyjnym po upewnieniu się za pomocą ucisku palca u nogi, że zwierzę jest całkowicie znieczulone. Wygolej szeroki obszar futra w planowanym polu operacyjnym, a następnie przemyj miejsce operacji zgodnie z techniką aseptycznego mycia opisaną w towarzyszącym protokole tekstowym.

Następnie umieść szczura na termicznej barierze, przykryj jego nos i pysk lejkiem inhalacyjnym i zmniejsz stężenie izofluranu do 3% oraz przepływ do 0,2 litrów na minutę. Podaj odpowiednią dawkę antybiotyku ampicyliny w zastrzyku podskórnym oraz leku przeciwbólowego buprenorfiny w zastrzyku domięśniowym. Nerw obwodowy (PN) zostaje przecięty od siedmiu do 10 dni przed jego pobraniem, aby stymulować degenerację, co zapewnia środowisko bardziej sprzyjające wzrostowi aksonów niż świeży preparat nerwu.

Aby rozpocząć przekrojenie pn, ułóż zwierzę na boku. Załóż sterylne rękawiczki i rozłóż sterylną chustę chirurgiczną wokół miejsca operacji. Wykonaj nacięcie w linii prostej od głowy kości udowej do kolana, prowadząc je równolegle i w odległości około trzech milimetrów od kości udowej; przetnij powierzchowne mięśnie biceps fems wzdłuż tej samej linii co nacięcie skóry, aby odsłonić leżący pod nimi mięsień vastus lateralis.

Po odsłonięciu mięśnia obszernego bocznego (vastus lateralis), należy za pomocą nożyczek wykonać w nim niewielkie nacięcie w pobliżu kolana i przedłużyć je w górę w stronę głowy kości udowej. Ostrożnie rozsunąć mięśnie obszerne boczne za pomocą rozieraczy, aż do momentu uwidocznienia gałęzi piszczelowej i skórnej krocza nerwu kulszowego, przebiegających równolegle do kości udowej. Następnie należy śledzić te gałęzie nerwowe w kierunku głowy kości udowej, aż do zidentyfikowania głównego pnia nerwu kulszowego.

Tuż poniżej rozwidlenia nerwu kulszowego, za pomocą precyzyjnej pęsety ostrożnie oddziel tkankę łączną lub epineurium otaczające gałąź nerwu piszczelowego. Jest to gałąź większa. Po wyizolowaniu gałęzi nerwu piszczelowego, nałóż wokół niej ligaturę z jedwabiu 6-0 i zaciśnij.

Za pomocą mikronozyciórek przetnij nerw w odległości kilku milimetrów od ligatury. Przeciągnij nitkę szwy przez mięsień obszerny boczny i zawiąż węzeł. Pozwoli to na łatwe zlokalizowanie przeciętego końca nerwu piszczelowego.

Po pobraniu nerwu zamknij mięsień obszerny boczny szwami z jedwabiu 6-0. Następnie zamknij mięsień biceps femoris szwami z jedwabiu 6-0.

Na koniec zamknij skórę za pomocą klipsów chirurgicznych Michelle. Wyłącz przepływ izofluranu i zdejmij stożek inhalacyjny z nosa. Umieść zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej.

Zwróć zwierzę do klatki domowej. Gdy zwierzę stanie się czujne i aktywne, od siedmiu do 10 dni później, segment PN będzie gotowy do pobrania. Aby rozpocząć transplantację, umieść znieczulone zwierzę na barierze termicznej.

Po potwierdzeniu, że zwierzę jest w pełni znieczulone, należy usunąć klipsy z rany i rozdzielić brzegi nacięcia skóry. Wstępne ogolenie obszaru może nie być konieczne, ponieważ skóra powinna łatwo się rozdzielić, co pozwoli uniknąć kontaminacji. Aby wyeliminować konieczność przecinania sierści, należy przeciąć szew powierzchownych mięśni w celu odsłonięcia mięśnia obszerny boczny (vastus lateralis), a następnie przeciąć szew w tym mięśniu.

Śledź linię szwu aż do przeciętego końca nerwu piszczelowego i usuń szew z nerwu. Użyj precyzyjnej pęsety, aby oddzielić epineurium od odcinka nerwu piszczelowego o długości 15 millimeter, a następnie przetnij ten dystalny koniec. Usuń segment nerwu i zanurz go w sterylnym roztworze Hanksa (Hank's balanced salt solution).

Jesteśmy teraz gotowi do kolejnego etapu, którym jest wywołanie urazu rdzenia kręgowego w celu transplantacji PN; transplantacja może być autologiczna lub heterologiczna. Umieść znieczulonego szczura na barierze termicznej i podaj antybiotyki oraz leki przeciwbólowe zgodnie z opisem w poprzedniej sekcji, aby wywołać hemisekcję rdzenia kręgowego. Najpierw zlokalizuj wcięcie potyliczne oraz wyraźny wyrostek kolczysty drugiego kręgu piersiowego (T2).

Wykonaj nacięcie na całej długości między tymi zewnętrznymi punktami orientacyjnymi. Przetnij linię środkową powierzchownego mięśnia czworobocznego i oddziel leżące pod nim mięśnie szyjne. Wprowadź rozwierak, aby utrzymać mięśnie w rozstępie.

Głębokie mięśnie nadkręgowe należy odciąć od wyrostków kolczystych C4, C5 i C6. Za pomocą nożyc Ronegera wykonaj częściową laminektomię na poziomie C5, aby odsłonić całą prawą stronę oraz przyśrodkową część lewej strony rdzenia kręgowego. Jako punkt orientacyjny dla linii środkowej rdzenia kręgowego wykorzystaj wyraźną żyłę grzbietową.

Następnie, używając ostrza mikroskalpela, przebij oponę twardą i przedłuż nacięcie nad C5 rdzenia kręgowego. Wykonaj niewielkie nacięcie w znajdującej się poniżej przestrzeni podpajęczynówkowej i oponie miękkiej za pomocą wyciągniętej szklanej mikrokaniuli. Rozpocznij aspirację grzbietowej prawej strony rdzenia kręgowego, stosując delikatny nacisk i mikropincetę w celu oddzielenia tkanki i ułatwienia jej usunięcia.

Kontynuuj przez części środkowe i brzuszne rdzenia kręgowego, aby stworzyć jamę o długości dwóch milimetrów, która przechodzi całkowicie od strony grzbietowej do brzusznej oraz od linii środkowej do opon mózgowo-rdzeniowych bocznych. Umieść nasączoną solą fizjologiczną gąbkę żelatynową w jamie uszkodzenia sekcji HEMI. Aby uzyskać hemostazę, wyjmij wcześniej pobrany fragment nerwu obwodowego z roztworu Hank'a.

Delikatnie chwyć epineurium z proksymalnych trzech milimetrów segmentu nerwu i przyłóż ten koniec do rostralnej ściany jamy uszkodzenia w sekcji HEMI. Przymocuj segment za pomocą 10 szwów przechodzących przez epineurium do opony twardej. Następnie zaszyj oponę twardą nad wszczepionym końcem przeszczepu, umieszczając go pomiędzy dwoma kawałkami elastycznej membrany celulozowej.

Umieść przeszczep wzdłuż wyrostków kręgów C6, C7 oraz T1. Nie dopuszczaj do kontaktu dystalnego końca nerwu z rdzeniem kręgowym ani tkanką mięśniową. Zamknij mięśnie warstwowo, używając szwów 4-0, a nacięcie skóry zamknij za pomocą klipsów chirurgicznych.

Na koniec umieść zwierzę w klatce przetrzymującej na barierze termicznej, a następnie przenieś je z powrotem do klatki domowej. Gdy zwierzę stanie się czujne i aktywne, zregenerowane aksony docierające do dystalnego końca przeszczepu PN często nie są w stanie ponownie wrastać do rdzenia kręgowego. Dlatego stosujemy mikroiniekcje chondroitynazy AC w celu degradacji tkanki bliznowatej otaczającej obszar urazu.

Procedurę tę przeprowadza się 21 dni po transplantacji PN; na początku należy upewnić się, że zwierzę jest całkowicie znieczulone. Następnie należy usunąć klamry ran oraz podać antybiotyki i leki przeciwbólowe, zgodnie z wcześniej przedstawioną metodą. Za pomocą cienkich pęset i nożyczek sprężynowych należy przeciąć powierzchowne szwy, aby odsłonić błonę elastyczną otaczającą przeszczep nerwu.

Ostrożnie uwolnij odcinek nerwu z błon elastycznych. Odsunie nerw z pola operacyjnego. Wykonaj częściową laminektomię po prawej stronie wyrostka kręgu C7.

Przekłuta oponami za pomocą ostrza mikroskalpela i poprzez aspirację przygotowano jamę uszkodzenia o objętości jednego milimetra sześciennego w tylnym kwadrancie rdzenia kręgowego na poziomie C7. W jamę uszkodzenia wprowadzono nasączoną solą fizjologiczną gąbkę żelową w celu uzyskania hemostazy. Następnie gąbkę żelową zastąpiono gąbką nasączoną chondroitynową NAce.

A BC. Przetwarzaj miejsce uszkodzenia przez 15 minut, aplikując co pięć minut nową gąbkę żelową nasączoną chondroityną. Przykryj zewnętrzną długość przeszczepu nerwu membraną scholastic. Zamknij mięśnie powierzchowne szwami 4-0, a nacięcie skóry za pomocą klipsów do ran.

Umieść zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej i przenieś je z powrotem do klatki domowej, gdy będzie już czujne i aktywne. Dwa dni później, 23 dni po transplantacji PN, przeprowadza się ponowną operację zwierzęcia w celu mikroiniekcji chondroityny NA do rdzenia kręgowego. Podobnie jak poprzednio, u znieczulonego zwierzęcia usuwa się klamry rany oraz podaje antybiotyki i leki przeciwbólowe.

Przetnij szwy powierzchowne, aby odsłonić błonę elastyczną otaczającą przeszczep nerwu. Odsłoń miejsce przeszczepu C7, nie naruszając samego przeszczepu. Następnie, używając strzykawki Hamiltona z dociętą szklaną kaniulą, wykonaj mikroiniekcję 1 µL chondroitin ace A BC w prawą stronę rdzenia kręgowego, około 1 mm dystalnie od miejsca przylegania przeszczepu do rdzenia kręgowego.

Delikatnie oddziel EUR od dystalnych dwóch milimetrów segmentu nerwu i przyłóż ten koniec do jamy uszkodzenia na poziomie C7. Unieruchom segment, stosując szwy 10-0, przechodząc przez epineurium do opony twardej. Zamknij mięśnie powierzchowne szwami 4-0, a nacięcie skóry za pomocą klamer chirurgicznych.

Umieść zwierzę w klatce przejściowej na barierze termicznej, a następnie przenieś je z powrotem do klatki domowej, gdy będzie już czujne i aktywne. Po zoptymalizowaniu tej procedury segment nerwu obwodowego ściśle zintegruje się z rdzeniem kręgowym gospodarza, co pozwoli na wizualizację aksonów rdzeniowych regenerujących się w przeszczepie. Przeszczep wypełniliśmy metodą dyfuzyjną za pomocą biotinylowanej dekstryny aminowej (BDA) w kierunku wstępującym i zstępującym.

Aksony rdzeniowe zazwyczaj wnikają do przeszczepu, rosnąc w linii względnie prostej, równolegle do długości przeszczepu, i rozciągają się do jego dystalnego końca z prędkością około jednego milimetra na dzień. Aksony nerwów obwodowych przenikają do sąsiadującego rdzenia kręgowego. Jeśli w celu usunięcia inhibitorowych proteoglikanów z otaczającej tkanki bliznowatej zastosowano chondroitynazę ABC, to po dotarciu do końca dystalnego bardzo niewielu aksonów nerwów obwodowych wnika do tkanki gospodarza w grupie leczonej placebo.

Jednakże, jeśli dystalny interfejs został potraktowany chondroityną, znacznie więcej aksonów wyrasta z przeszczepu, aby ponownie zinnerwować rdzeń kręgowy. Jak pokazano tutaj na tym jednym przekroju reprezentacyjnym spośród 15 do 20 przekrojów na zwierzę, w których zaobserwowano wzrost aksonów, ten wykres słupkowy wykazuje znaczący wzrost wypustek aksonalnych po zastosowaniu leczenia conjoin nace A BC. Immunochemiczna detekcja markerów synaptycznych w neuronach rdzenia kręgowego w odpowiedzi na stymulację elektryczną aksonów wewnątrz przeszczepu może być wykorzystana do oceny łączności funkcjonalnej pomiędzy przeszczepionym graftem a rdzeniem kręgowym biorcy.

Ten obszar rdzenia kręgowego zawierający dystalny punkt styku został poddany barwieniu immunocytochemicznemu zarówno na biotynilowaną dekstrynaminę w kolorze zielonym, jak i na marker synaptyczny synapsynę w kolorze czerwonym; groty strzałek wskazują obszary kolokatyzacji markerów, co świadczy o tym, że niektóre włókna odrastające z przeszczepu utworzyły funkcjonalne kontakty synaptyczne. Funkcjonalne połączenie między neuronami przeszczepu i rdzenia kręgowego wykazano również za pomocą analizy ekspresji białka c-Fos. Po stymulacji synaptycznej neuronów gospodarza poza dystalnym interfejsem, ten transsynaptyczny marker aktywacji można zidentyfikować poprzez obecność wielu neuronów pozytywnych pod kątem c-Fos w tkance po stronie ipsilateralnej względem miejsca przeszczepu, natomiast przy większym powiększeniu w tkance po stronie kontralateralnej względem przeszczepu można zaobserwować bardzo mało neuronów pozytywnych pod kątem c-Fos.

Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować miejsce urazu rdzenia kręgowego przed przeszczepieniem fragmentu nerwu obwodowego w celu stymulacji regeneracji po urazie rdzenia kręgowego. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przed przeszczepieniem zapewnić odpowiednią długość nerwu oraz dopasować przeszczep w sposób zapewniający ścisłe przyleganie do miejsca urazu rdzenia kręgowego. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.