Name: Połączenie przeszczepu nerwów obwodowych i modulacji macierzy w celu naprawy uszkodzonego rdzenia kręgowego szczura (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-11-20T17:00:00.000+00:00
Duration: 20 min 14 s
Description: Poznaj metodę przeszczepu nerwów obwodowych i modulacji macierzy w celu naprawy uszkodzonego rdzenia kręgowego szczura. Technika ta wspiera regenerację włókien nerwowych i poprawę funkcji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Niniejsza praca była finansowana z grantów NIH/NINDS NS26380 i NS55976, fundacji Christopher and Dana Reeve Foundation oraz funduszu Daniel Heumann Fund for Spinal Cord Research. Centrum Badań nad Rdzeniem Kręgowym w Drexel University College of Medicine zapewnia wsparcie dla infrastruktury badawczej wykorzystanej do realizacji tej pracy.

1) Przygotowanie do mikrochirurgii
<ol>
 <li>Stanowisko chirurgiczne musi być czyste i zdezynfekowane rozcieńczonym roztworem wybielacza przed rozłożeniem instrumentów i materiałów pomocniczych. Instrumenty należy poddać autoklawowaniu na 1 dzień przed operacją i przechowywać w sterylnym pojemniku. Włączyć sterylizator koralikowy (Fine Science Tools) używany do usuwania patogenów i zanieczyszczeń mikrobiologicznych z instrumentów pomiędzy zabiegami u różnych zwierząt.</li>
 <li>Podłączyć barierę termiczną służącą do utrzymania temperatury ciała podczas zabiegu chirurgicznego. Przygotować patyczki bawełniane i gaziki do kontroli krwawienia. Przygotować małe (&lt; 2mm3) kawałki gąbki żelowej (Gel Foam) do mikrohemostazy i zanurzyć je w sterylnym roztworze soli fizjologicznej. </li>
 <li>Umieścić szczura w komorze indukcyjnej i znieczulić izofluranem (5% w tlenie, przepływ 2,0 L/min). Przenieść zwierzę z komory na stół preparacyjny i ogolić szeroki obszar futra w miejscu planowanego pola operacyjnego. Przetrzeć 70% alkoholem izopropylowym, zaczynając od środka pola i kierując się na zewnątrz, a następnie w ten sam sposób przemyć roztworem polihydroksydyny (Xenodine). Powtórzyć tę sekwencję przemywania 3 razy.</li>
 <li>Umieścić zwierzę na barierze termicznej, przykryć nos i pysk lejkiem do inhalacji, zmniejszyć stężenie izofluranu do 3% i przepływ do 0,2 L/min. Podać odpowiednią dawkę antybiotyku (ampicylina) w iniekcji podskórnej oraz analgetyku (buprenorfina 0,05 mg/kg) w iniekcji domięśniowej. </li>
 <li>Chirurg musi umyć ręce roztworem Xenodine i opłukać je wodą. Chirurg zakłada sterylną fartuch chirurgiczny; ręce należy osuszyć sterylnym ręcznikiem i założyć sterylne rękawiczki. Procedurę tę stosuje się przy każdym zabiegu chirurgicznym opisanym w tekście.</li>
 <li>Asystent zdejmuje pokrywkę zabezpieczającą sterylne instrumenty, a chirurg rozkłada instrumenty na sterylnym podkładzie.</li>
 </ol>
2) Przecięcie nerwu obwodowego (PN) w celu wywołania degeneracji
 <ol>
 <li>Przy zwierzęciu leżącym na boku wykonaj nacięcie w linii prostej od głowy kości udowej w kierunku kolana, zachowując równoległość i odległość około 3mm od kości udowej. Przetnij powierzchowne mięśnie dwugłowe uda wzdłuż tej samej linii co nacięcie skóry, aby odsłonić znajdujący się pod nimi mięsień obszerny boczny.</li>
 <li>Za pomocą nożyczek wykonaj małe nacięcie w mięśniu obszernym bocznym w pobliżu kolana i przedłuż je w górę w stronę głowy kości udowej. Ponownie, używając nożyczek, delikatnie rozdziel mięsień obszerny boczny, aż do momentu uwidocznienia połączonych gałęzi piszczelowej i strzałkowej nerwu kulszowego (biegnących równolegle do kości udowej).</li>
 <li>Śledź te gałęzie w kierunku głowy kości udowej, aż do zidentyfikowania głównego pnia nerwu kulszowego. Tuż poniżej rozwidlenia nerwu kulszowego użyj precyzyjnej pęsety, aby ostrożnie oddzielić tkankę łączną (epineurium) otaczającą gałąź nerwu piszczelowego (jest to gałąź większa).</li>
 <li>Po wyizolowaniu załóż jedwabną ligaturę 6-0 wokół nerwu piszczelowego i zaciśnij ją. Za pomocą mikronożyczek przetnij nerw rostralnie od ligatury. Przeciągnij nitkę szwy przez mięsień obszerny boczny i zawiąż w węzeł. Zapewni to punkt ułatwiający lokalizację przeciętego końca nerwu piszczelowego podczas pobierania nerwu za 7-10 dni.</li>
 <li>Degeneracja nerwu piszczelowego przed przeszczepieniem stwarza środowisko bardziej odpowiednie dla wzrostu aksonów niż świeża preparacja nerwu.</li>
 <li>Zamknij mięsień obszerny boczny szwami jedwabnymi 6-0. Zamknij mięsień dwugłowy uda szwami jedwabnymi 6-0. Zamknij skórę za pomocą klipsów chirurgicznych Michela. Wyłącz dopływ izofluranu, zdejmij maskę inhalacyjną, umieść zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej, a następnie przenieś do klatki domowej, gdy odzyska czujność i aktywność.</li>
</ol>
3) Usunięcie segmentu PN
<ol>
<li>Zanurzyć zwierzę w narkozie, ogolić i oczyścić zamierzone pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej.</li>
<li>Usunąć klamry ranne i rozdzielić poprzednie nacięcie skóry. Przeciąć szew powierzchownego mięśnia, aby odsłonić mięsień obszerny boczny (vastus lateralis), a następnie przeciąć szew w tym mięśniu.</li>
<li>Podążać wzdłuż linii szwów, aby przeciąć koniec nerwu piszczelowego i usunąć szew z nerwu. Używając precyzyjnych pincetów, oddzielić epineurium od 15 mm odcinka nerwu piszczelowego i przeciąć ten dystalny koniec. Usunąć segment nerwu i zanurzyć go w sterylnym zrównoważonym roztworze soli Hanksa.</li>
<li>Jeśli jest to eksperyment z przeszczepem heterologicznym, uśmiercić zwierzę poprzez doglebowe wstrzyknięcie Euthasolu do jam brzusznej. Jeśli jest to eksperyment z przeszczepem autologicznym, zamknąć mięśnie nogi i skórę zgodnie z opisem w punkcie 2.6, a następnie przygotować zwierzę do urazu rdzenia kręgowego na poziomie szyjnym, jak opisano poniżej.</li>
</ol>
4) Przecięcie połowiczne rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym i transplantacja
Dzień 1
<ol>
<li>Zanurzyć zwierzę w narkozie, ogolić i oczyścić planowane pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej. Podać antybiotyki i środki przeciwbólowe zgodnie z powyższymi instrukcjami (1.4).</li>
<li>Zlokalizować wcięcie potyliczne oraz wystający wyrostek grzbietowy kręgu T2 i wykonać nacięcie na całej długości pomiędzy tymi punktami orientacyjnymi. Przeciąć w linii środkowej powierzchowny mięsień czworoboczny i oddzielić leżące pod nim mięśnie równoległobiałe szyjne. Rozsunąć mięśnie za pomocą rozwieracza.</li>
<li>Głębokie mięśnie nadkolcowe należy odciąć od wyrostków grzbietowych kręgów C4, C5 i C6. Za pomocą kaniulek kuretażowych wykonać częściową laminektomię C5, aby odsłonić całą prawą stronę oraz przyśrodkową część lewej strony rdzenia kręgowego. Wykorzystać wystającą żyłę grzbietową jako punkt orientacyjny dla linii środkowej rdzenia kręgowego.</li>
<li>Użyć ostrza mikroskalpela lub igły 30 G, aby przebić oponę twardą i rozszerzyć nacięcie nad rdzeniem kręgowym na poziomie C5. Wykonać niewielkie nacięcie w leżącej poniżej przestrzeni podpajęczynówkowej i oponie miękkiej.</li>
<li>Za pomocą wyciągniętej szklanej mikrokaniuli rozpocząć aspirację grzbietowej, prawej strony rdzenia kręgowego, stosując delikatny nacisk i mikrochwytaki w celu oddzielenia tkanki i ułatwienia jej usunięcia. Kontynuować proces przez części pośrednią i brzuszną rdzenia kręgowego, aby stworzyć jamę o długości 2 mm, przebiegającą całkowicie od strony grzbietowej do brzusznej oraz od linii środkowej do bocznych opon mózgowych.</li>
<li>Wprowadzić do jamy gąbkę żelową nasączoną solą fizjologiczną w celu uzyskania hemostazy.</li>
<li>Wyjąć segment nerwu obwodowego z roztworu Hanksa. Delikatnie oddzielić epineurium od proksymalnych 3 mm segmentu nerwu i przyłożyć ten koniec do rostralnej ściany jamy po uszkodzeniu hemisekcyjnym. Przymocować segment szwem 10-0 przez epineurium do opony twardej, a następnie zaszyć oponę twardą nad wszczepionym końcem przeszczepu.</li>
<li>Umieścić przeszczep pomiędzy 2 kawałkami membrany silastycznej (Biobrane) w celu ochrony i łatwej izolacji w późniejszym czasie. Umieścić go obok wyrostków kręgów C6, C7 i T1. Nie przykładać dystalnego końca nerwu do rdzenia kręgowego ani tkanki mięśniowej.</li>
<li>Zamknąć mięśnie warstwowo szwem 4-0 i zamknąć nacięcie skóry za pomocą klipsów ranowych.</li>
<li>Umieścić zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej i przenieść do klatki domowej, gdy odzyska czujność i aktywność.</li>
</ol>
Dzień 21
<ol start="11">
<li>Zanurzyć zwierzę w narkozie, ogolić i oczyścić planowane pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej i podać antybiotyki oraz leki przeciwbólowe zgodnie z powyższymi instrukcjami (1.4). Przeciąć powierzchowne szwy, aby odsłonić membranę silastykową otaczającą przeszczep nerwu. Ostrożnie uwolnić odcinek nerwu z membrany silastykowej za pomocą precyzyjnej pęsety i nożyczek sprężynowych, a następnie odsunąć go z pola operacyjnego.</li>
<li>Wykonać częściową laminektomię po prawej stronie wyrostka kręgu C7). Przebić opony twarde i miękkie zgodnie z powyższym opisem (4.4) i poprzez aspirację przygotować w rdzeniu kręgowym na poziomie C7 jamę uszkodzenia w kwadrancie grzbietowym o objętości 1 mm3. Do hemostazy użyć gąbki żelowej nasączonej solą fizjologiczną, a następnie zastąpić ją gąbką żelową nasączoną chondroitynazą ABC. Prowadzić zabieg w miejscu uszkodzenia przez 15 minut, wymieniając gąbkę żelową nasączoną chondroitynazą co 5 minut.</li>
<li>Przykryć zewnętrzną długość przeszczepu nerwu membraną silastykową. Zamknąć powierzchowne mięśnie szwami 4-0, a nacięcie skóry za pomocą klipsów chirurgicznych. Umieścić zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej i zwrócić do klatki domowej, gdy odzyska pełną świadomość i aktywność.</li>
</ol>
Dzień 23
<ol start="14">
<li>Zanurzyć zwierzę w znieczuleniu, ogolić i oczyścić planowane pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej oraz podać antybiotyki i leki przeciwbólowe jak opisano wyżej (1.4). Przeciąć powierzchowne szwy, aby odsłonić membranę silastykową otaczającą przeszczep nerwu. Nie naruszać przeszczepu, lecz odsłonić miejsce przeszczepu C7 i użyć strzykawki Hamiltona z wyciągniętą szklaną kaniulą, aby mikroiniekować 1μl chondroitynazy ABC w prawą stronę rdzenia kręgowego, około 1 mm dystalnie od miejsca przylegania przeszczepu do rdzenia kręgowego.</li>
<li>Ostrożnie odwarstwić epineurium z dystalnych 2mm segmentu nerwu i dopasować ten koniec do jamy uszkodzenia C7. Unieruchomić segment za pomocą szwu 10-0, przechodząc przez epineurium do opony twardej.</li>
<li>Zamknąć powierzchowne mięśnie szwami 4-0, a nacięcie skóry za pomocą klipsów chirurgicznych. Umieścić zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej i przenieść do klatki macierzystej, gdy tylko stanie się czujne i aktywne.</li>
</ol>
5) Rejestracja elektrofizjologiczna potencjału czynnościowego w przeszczepie i dystalnej części rdzenia kręgowego
<ol>
<li>Aby określić, czy aktywność elektryczna jest przenoszona przez aksony, które zregenerowały się w PNG, należy najpierw odsłonić i wyizolować przeszczep. Podczas tej procedury należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić mechanicznie przeszczepu; w tym celu kluczowe jest zastosowanie membrany Silastic po umieszczeniu przeszczepu. Zwierzę należy znieczulić, ogolić i oczyścić planowane pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej.</li>
<li>Po rozcięciu skóry i rozdzieleniu mięśni powierzchownych należy zidentyfikować paski membrany Silastic i ostrożnie odseparować je od przeszczepu.</li>
<li>Za pomocą kleszczyków kostnych usunąć wyrostki grzbietowe kręgów bezpośrednio rostralnie i kaudalnie względem miejsc styku PNG z rdzeniem kręgowym. Podczas tego etapu należy uważać, aby nie naruszyć nadmiernie przeszczepu. W obu poziomach należy wykonać nacięcie opony twardej.</li>
<li>W odległości około 1cm rostralnie od miejsca styku przeszczepu z rdzeniem kręgowym na poziomie C5 wprowadzić pojedynczą elektrodę stymulującą (stop platyny i irydu) do rdzenia kręgowego po stronie ipsilateralnej względem uszkodzenia, na głębokość około 1mm. Ostrożnie unieść środkową część przeszczepu na bipolarną elektrodę hakową. Podać pojedyncze impulsy stymulujące o natężeniu 10μA i czasie trwania 100μsec, a następnie ustalić, czy występują potencjały czynnościowe przemieszczające się przez aksony, które zregenerowały się w przeszczepie.</li>
<li>Zamienić połączenia i pozycje przewodów tak, aby elektroda hakowa stała się elektrodą stymulującą, a pojedynczy przewód został wprowadzony do rdzenia kręgowego dystalnie względem miejsca styku PNG z rdzeniem kręgowym, i spróbować zarejestrować potencjały czynnościowe w rdzeniu kręgowym.</li>
<li>Na koniec eksperymentu podać serię stymulacji o natężeniu 1mA i czasie trwania 100μsec z częstotliwością 50Hz przez łącznie 1hr. Eutanazować zwierzęta po 1hr, przeprowadzić perfuzję 4% paraformaldehydem i przygotować tkankę rdzenia kręgowego do detekcji immunocytochemicznej cFos w neuronach aktywowanych przez zregenerowane aksony w PNG.</li>
</ol>
6) Markowanie wsteczne neuronów regenerujących aksony do PNG oraz markowanie w przód aksonów regenerujących się z powrotem do rdzenia kręgowego
<ol>
<li>W przypadku zwierząt, które nie zostały poddane pomiarom elektrofizjologicznym, możliwe jest zidentyfikowanie źródła aksonów wrastających w przeszczep oraz przebiegu ich zakończeń w rdzeniu kręgowym. Znieczulić zwierzę, ogolić i oczyścić planowane pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej i odsłonić PNG zgodnie z opisem w punkcie 6.1 powyżej.</li>
<li>Za pomocą mikronożyczek przeciąć przeszczep w jego połowie i usunąć epineurium z przeciętych końców przeszczepu. Odchylić przecięte końce od siebie i ułożyć każdy z nich na oddzielnym arkuszu parafilmu.</li>
<li>Umieścić tampon z gąbki żelowej nasączonej True Blue na proksymalnym przeciętym końcu, aby oznakować neurony, które dostarczyły akson do PNG. Umieścić tampon z gąbki żelowej nasączonej biotynilowaną dekstranoaminą (BDA) na dystalnym przeciętym końcu, aby oznakować aksony, które przechodzą z przeszczepu z powrotem do rdzenia kręgowego.</li>
<li>Uśmiercić zwierzęta po 3-4 dniach, przeprowadzić perfuzję 4% paraformaldehydem i przygotować przekroje tkanek mózgu i rdzenia kręgowego do mikroskopii fluorescencyjnej w celu wykrycia neuronów oznakowanych True Blue lub do histochemii BDA w celu wykrycia oznakowanych aksonów.</li>
</ol>
7) Całkowite przerwanie rdzenia kręgowego w odcinku piersiowym i transplantacja
Niniejsza metoda stanowi alternatywne podejście do opisanego powyżej modelu uszkodzenia z jednoczesną hemisekcją szyjną. W tym przypadku wywołuje się cięższe, obustronne uszkodzenie, a następnie do jamy uszkodzenia wprowadza się segmenty nerwu obwodowego, aby połączyć rostralny i kaudalny pień uszkodzonego rdzenia kręgowego.
Dzień 1
<ol>
<li>Zanurzyć zwierzę w narkozie, ogolić i oczyścić planowane pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej. Podać antybiotyki i leki przeciwbólowe zgodnie z powyższym opisem (1.4).</li>
<li>Zidentyfikować poziom kręgu T12 w miejscu przyczepu ostatniego żebra. Wykonać nacięcie skóry od tego punktu w kierunku rostralnym nad wyrostkami kręgów T11, T10 i T9. Przeciąć powięź powierzchowną oraz mięśnie nadkolczyste przyczepione do tych trzech wyrostków.</li>
<li>Wykonać całkowitą laminektomię wyrostka kręgu T10 (nad segmentem T12 rdzenia kręgowego). Użyć ostrza mikro-skalpela lub igły 30G, aby przebić oponę twardą i rozszerzyć nacięcie nad odcinkiem T12 rdzenia kręgowego. Wykonać niewielkie nacięcie w znajdującej się poniżej przestrzeni podpajęczynówkowej oraz w oponie miękkiej.</li>
<li>Za pomocą wyciągniętej szklanej mikrokaniuli rozpocząć obustronną aspirację odcinka T12 rdzenia kręgowego, stosując delikatny nacisk i mikro-pincetę w celu oddzielenia tkanki i ułatwienia jej usunięcia. Kontynuować procedurę przez części pośrednią i brzuszną rdzenia kręgowego, aby utworzyć jamę o długości 3 mm, przebiegającą całkowicie od strony grzbietowej do brzusznej i pomiędzy oponami bocznymi.</li>
<li>Użyć nasączonej solą fizjologiczną gąbki żelowej w celu uzyskania hemostazy, a następnie zastąpić ją gąbką żelową nasączoną chondroitynazą ABC. Traktować miejsce uszkodzenia przez 15 minut, wymieniając gąbkę żelową nasączoną chondroitynazą co 5 minut.</li>
<li>Wyjąć segment nerwu obwodowego z roztworu Hanks. Delikatnie odsunąć epineurium z proksymalnych 4mm segmentu nerwu i odciąć odcinek tak, aby ściśle pasował pomiędzy rostralny i kaudalny pień po jednej stronie rdzenia kręgowego. Umieścić drugi segment obok pierwszego przeszczepionego odcinka, przylegając do drugiej strony rdzenia kręgowego. Zaszyć oponę twardą nad wszczepionymi przeszczepami i przykryć oponę twardą małym kawałkiem membrany silastycznej.</li>
<li>Zamknąć mięśnie warstwowo szwem 4-0 i zamknąć nacięcie skóry za pomocą klipsów do ran.</li>
<li>Umieścić zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej i przenieść do klatki macierzystej, gdy będzie ono czujne i aktywne.</li>
</ol>
Dzień 3
<ol start="9">
<li>Zanurzyć zwierzę w znieczuleniu, ogolić i oczyścić planowane pole operacyjne zgodnie z powyższym opisem (1.3). Umieścić zwierzę na barierze termicznej i podać antybiotyki oraz leki przeciwbólowe jak opisano wyżej (1.4). Przeciąć szwy powierzchowne, aby odsłonić membranę silikonową nad miejscem przeszczepu. Nie naruszać przeszczepu, lecz odsłonić rdzeń kręgowy w części ogonowej względem przeszczepu i za pomocą strzykawki Hamiltona z wyciągniętą szklaną kaniulą mikroiniekować 1μl chondroitynazy ABC po każdej stronie rdzenia kręgowego, około 1 mm dystalnie od miejsca przylegania przeszczepu do rdzenia kręgowego.</li>
<li>Zamknąć powierzchowne mięśnie szwami 4-0, a nacięcie skóry za pomocą klipsów chirurgicznych. Umieścić zwierzę w klatce obserwacyjnej na barierze termicznej i przenieść do klatki domowej, gdy odzyska ono czujność i aktywność. Przeprowadzić stymulację i rejestrację elektrofizjologiczną oraz znakowanie tracerami zgodnie z opisem w punktach 5) i 6) powyżej.</li>
</ol>
8) Reprezentatywne wyniki
Po zoptymalizowaniu tej procedury segment nerwu obwodowego ściśle zintegruje się z rdzeniem kręgowym gospodarza. Aksony rdzeniowe wstępujące i zstępujące wnikną do przeszczepu, będą rosły w linii względnie prostej, równolegle do długości przeszczepu, i będą rozszerzać się do jego dystalnego końca z prędkością około 1 mm na dobę. Po dotarciu do końca dystalnego aksony przenikną do sąsiedzącego rdzenia kręgowego, pod warunkiem zastosowania chondroitynaz w celu usunięcia inhibicyjnych proteoglikanów z otaczającej tkanki bliznowatej. Łączność funkcjonalna zostanie określona na podstawie elektrofizjologicznego i immunocytochemicznego wykrycia odpowiedzi neuronów rdzenia kręgowego na stymulację aksonów wewnątrz przeszczepu. Korelacja anatomiczna w zakresie regeneracji funkcjonalnej zostanie oceniona poprzez śledzenie liczby i długości aksonów, które wysunęły się poza przeszczep nerwowy z powrotem do rdzenia kręgowego.

<ol><li>Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Demonstration+of+the+potential+for+chronically+injured+neurons+to+regenerate+axons+into+intraspinal+peripheral+nerve+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Demonstration of the potential for chronically injured neurons to regenerate axons into intraspinal peripheral nerve grafts.</a> Exp. Neurol. 113, 1-9 (1991).</li>
<li>Ye, J. H., Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+the+chronically+injured+spinal+cord+with+neurotrophic+factors+can+promote+axonal+regeneration+from+supraspinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment of the chronically injured spinal cord with neurotrophic factors can promote axonal regeneration from supraspinal neurons.</a> Exp. Neurol. 143, 70-81 (1997).</li>
<li>Houle, J. D., Tom, V., Mayes, D., Wagoner, G., Phillips, N., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combining+an+autologous+peripheral+nerve+bridge+and+matrix+modification+by+chondroitinase+allows+robust+functional+regeneration+across+a+hemisection+lesion+of+the+adult+rat+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Combining an autologous peripheral nerve bridge and matrix modification by chondroitinase allows robust functional regeneration across a hemisection lesion of the adult rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 26, 7405-7415 (2006).</li>
<li>Tom, V., Houle, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraspinal+microinjection+of+chondroitinase+ABC+following+injury+promotes+axonal+regeneration+out+of+a+peripheral+nerve+graft%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Intraspinal microinjection of chondroitinase ABC following injury promotes axonal regeneration out of a peripheral nerve graft.</a> Exp. Neurol. 211, 315-319 (2008).</li>
</ol>

<ol>
 <li>Dla zapewnienia powtarzalności eksperymentu ważne jest, aby stopień uszkodzenia rdzenia kręgowego był spójny u wszystkich zwierząt. Dlatego krytyczne jest zidentyfikowanie odpowiedniego wyrostka kręgowego do wykonania laminektomii. Ponieważ w niniejszym badaniu stosujemy model uszkodzenia polegający na hemisekcji lub transekcji, nie ma wątpliwości co do wielkości uszkodzenia oraz tego, czy określone drogi rdzeniowe zostały uszkodzone czy oszczędzone.</li>
 <li>Niezbędne jest uprzednie odnerwienie nerwu obwodowego przed transplantacj...

<table><tbody><tr><td>nici jedwabne 10-0</td><td>ArosSurgical</td><td>T5A10N10</td><td></td></tr><tr><td>nici jedwabne 6-0</td><td>McKesson</td><td>2693</td><td></td></tr><tr><td>Ampicylina</td><td>McKesson</td><td>483549</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciwko cFos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7799</td><td></td></tr><tr><td>Biotynilowana dekstrana amina</td><td>Invitrogen</td><td>D7135</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina (.3mg/ml)</td><td>McKesson</td><td>12496075701</td><td></td></tr><tr><td>Chondroitynaza ABC</td><td>Associates of Cape Cod</td><td>100332-1A</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>Webster Veterinary</td><td>07-805-9296</td><td></td></tr><tr><td>Zrównoważony roztwór soli Hanksa</td><td>Cellgro</td><td>21-021-CV</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Henry Schein</td><td>209-1966</td><td></td></tr><tr><td>Zapięcia do ran Michela</td><td>Fine Science Tools</td><td>12040-02</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw Neurotrace</td><td>Invitrogen</td><td>N7167</td><td></tr><tr><td>True Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5891</td><td></td></tr><tr><td>Xenodine</td><td>Webster Veterinary</td><td>92201</td><td></td></tr><tr><td>Sterylizator kuleczkowy na gorąco</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Koło do wymuszonego ćwiczenia</td><td>Lafayette Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System TreadScan</td><td>Clever System</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do wywoływania urazów Infinite Horizon Impact Device</td><td>Precision Systems and Instrumentation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urządzenie do stymulacji magnetycznej</td><td>Magstim</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

połączenie przeszczepu nerwu obwodowego i modulacji macierzy w celu naprawy uszkodzonego rdzenia kręgowego szczura

Combining Peripheral Nerve Grafting and Matrix Modulation to Repair the Injured Rat Spinal Cord

Urazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego (SCI) powoduje śmierć neuronów, przerwanie dróg włókien nerwowych (aksonów) ruchowych i czuciowych oraz zaburzenie komunikacji z mózgiem. Jednym z celów naszych badań jest promowanie regeneracji aksonów w celu przywrócenia łączności w miejscu uszkodzenia. Aby to osiągnąć, opracowaliśmy technikę przeszczepiania nerwów obwodowych (PN), w której fragmenty nerwu kulszowego są umieszczane bezpośrednio między uszkodzonymi końcami rdzenia kręgowego lub wykorzystywane do utworzenia pomostu nad miejscem uszkodzenia. Podejście to oferuje kilka zalet w porównaniu z transplantacją innych tkanek nerwowych: regenerujące się aksony można skierować do konkretnego obszaru docelowego, liczbę i pochodzenie regenerujących się aksonów można łatwo określić za pomocą technik śledzenia (tracing), przeszczep może być wykorzystany w eksperymentach elektrofizjologicznych do pomiaru funkcjonalnej regeneracji związanej z aksonami w przeszczepie oraz istnieje możliwość zastosowania nerwu autologicznego w celu zmniejszenia ryzyka odrzutu przeszczepu. W naszym laboratorium przeprowadziliśmy zarówno przeszczepy autologiczne (dawca i biorca to to samo zwierzę), jak i heterologiczne (dawca i biorca to różne zwierzęta), uzyskując porównywalne wyniki. Metoda ta była stosowana z powodzeniem zarówno w sytuacjach urazów ostrych, jak i przewlekłych. Aksony regenerujące się, które docierają do dystalnego końca przeszczepu nerwu obwodowego, często nie są w stanie ponownie wrastać do rdzenia kręgowego, dlatego stosujemy mikroiniekcje chondroitynazy w celu degradacji cząsteczek hamujących związanych z tkanką bliznowatą otaczającą obszar SCI. Jednocześnie stwierdziliśmy, że dostarczenie egzogennych cząsteczek wzrostu i troficznych sprzyja odrostowi aksonów na dłuższych dystansach do wnętrza rdzenia kręgowego. Kilka miesięcy po transplantacji przeprowadzamy szereg testów anatomicznych, behawioralnych i elektrofizjologicznych, aby ocenić powrót funkcji u zwierząt z uszkodzeniem rdzenia kręgowego. To podejście eksperymentalne było stosowane z sukcesem w kilku modelach uszkodzenia rdzenia kręgowego, na różnych poziomach urazu i u różnych gatunków (myszy, szczura i kota). Co istotne, metoda przeszczepiania nerwów obwodowych jest skuteczna w promowaniu regeneracji zarówno w przypadku neuronów uszkodzonych ostro, jak i przewlekłe.

Uraz rdzenia kręgowego zaburza komunikację z mózgiem. Aby przywrócić utraconą łączność, wykorzystujemy przeszczep nerwu obwodowego, który stanowi podłoże dla regenerujących się włókien, w połączeniu z czynnikami neurotroficznymi i enzymami modyfikującymi macierz, które usuwają cząsteczki hamujące w celu promowania wzrostu na duże odległości.

Połączenie przeszczepu nerwu obwodowego i modulacji macierzy w celu naprawy uszkodzonego rdzenia kręgowego szczura

Urazowe uszkodzenie rdzenia kręgowego (SCI) powoduje śmierć neuronów, przerwanie dróg przejścia włókien nerwowych (aksonów) ruchowych i czuciowych oraz przerwanie...

Przygotowanie do przeszczepienia nerwu obwodowego do miejsca uszkodzenia rdzenia kręgowego rozpoczyna się od przeddegeneracji PNG na siedem do 10 dni przed przeszczepieniem. Od szczura dawcy przecina się gałąź nerwu piszczelowego. Poprzez aspirację wykonuje się hemisekcję na poziomie piątego odcinka szyjnego (C5).Nerw obwodowy (PNG) zostaje pobrany od szczura dawcy, umieszczony naprzeciw przedniej ściany jamy uszkodzenia i przymocowany poprzez przyszycie do opony twardej. Po trzech tygodniach wykonuje się uszkodzenie w tylnym kwadrancie na poziomie C7; w jamę uszkodzenia wprowadza się na 15 minut gąbkę żelową nasączoną enzymem chondroitynasą ABC (CHABC) w celu trawienia proteoglikanów blizny glejowej. Po dwóch dniach CHABC jest wstrzykiwana za pomocą mikroiniekcji w sąsiedztwie miejsca uszkodzenia, a dystalny koniec PNG zostaje umieszczony naprzeciw uszkodzenia w tylnym kwadrancie.Witajcie, jestem John Hula. Jestem dyrektorem Centrum Badań nad Urazami Rdzenia Kręgowego w Drexel University College of Medicine. Jestem dr Veronica Tom z laboratorium Hula, a ja jestem Martha Mean.Z laboratorium hula. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę przeszczepienia segmentu nerwu obwodowego do uszkodzo

combining-peripheral-nerve-grafting-matrix-modulation-to-repair

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Połączenie przeszczepu nerwów obwodowych i modulacji macierzy w celu naprawienia uszkodzonego rdzenia kręgowego szczura

Weźmy znieczulonego szczura z odsłoniętym nienaruszonym prawym nerwem kulszowym, który kontroluje ruch nóg i czucie.Wytnij segment nerwowy, tworząc szczelinę, przecinając aksony neuronów i zakłócając transmisję sygnału.Odcięte dystalne aksony pogarszają się, odrywając wyspecjalizowane komórki naprawy nerwów lub komórki Schwanna.Zszyj bioniczne rusztowanie nerwu przewodzącego, miękką rurkę z mikrokanałami, do epineurium, zewnętrznej warstwy nerwu, na obu odciętych końcach.Elektrody sparowane z...

Naprawa nerwów za pomocą bionicznego rusztowania przewodzącego w połączeniu ze stymulacją elektryczną

Źródło: Zweckberger, K., et al. Synergiczne zastosowanie neuronalnych komórek prekursorowych i samoorganizujących się peptydów w eksperymentalnym uszkodzeniu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym.  J. Vis. Exp. (2015).Protokół ten demonstruje ukierunkowane podejście do iniekcji w celu naprawy urazu rdzenia kręgowego w modelu szczurzym. Polega na dostarczeniu samoorganizujących się peptydów (SAP) do rdzenia zmiany chorobowej w celu stworzenia rusztowania nośnego, a następnie wstrzyknięciu komórek...

Wstrzykiwanie samoorganizujących się peptydów i nerwowych komórek prekursorowych w celu naprawy rdzenia kręgowego w modelu szczurzym

Źródło: Svientek, S. R., et al. Wytwarzanie kompozytowego regeneracyjnego interfejsu nerwów obwodowych (C-RPNI) u dorosłego szczura.  J. Vis. Exp. (2020).Film ten demonstruje chirurgiczną konstrukcję kompozytowego regeneracyjnego interfejsu nerwów obwodowych (C-RPNI) w szczurzym modelu uszkodzenia nerwów obwodowych. Zabieg polega na przymocowaniu przeciętego nerwu strzałkowego do przeszczepu mięśniowego i nałożeniu na niego przeszczepu skóry w celu pobudzenia regeneracji nerwów. Z biegiem czasu...

Budowa kompozytowego regeneracyjnego interfejsu nerwów obwodowych w szczurzym modelu uszkodzenia nerwu

Matryce fibrynowe zawierające czynniki wzrostu zostały użyte do zatrzymania przeszczepionych nerwowych komórek macierzystych w miejscach całkowitego przecięcia rdzenia kręgowego. Przeszczepione komórki całkowicie wypełniły jamę chorobową i zróżnicowały się w wiele typów komórek nerwowych, w tym neurony, które rozciągały aksony do rdzenia kręgowego gospodarza na duże odległości.

Promowanie przeżycia i różnicowania nerwowych komórek macierzystych z koktajlami fibryny i czynnika wzrostu po ciężkim urazie rdzenia kręgowego

Leczenie uszkodzeń rdzenia kręgowego odcinka szyjnego zarówno za pomocą peptydów samoorganizujących się (SAP), jak i nerwowych komórek prekursorowych (NPC), wraz z czynnikami wzrostu, jest obiecującym podejściem do promowania regeneracji i regeneracji. Ustalono szczurzy model klisa do stłuczenia/ucisku tętniaka szyjki macicy i leczenia skojarzonego obejmującego wstrzyknięcie SAP i przeszczep NPC.

Synergiczne zastosowanie neuronalnych komórek prekursorowych i samoorganizujących się peptydów w eksperymentalnym uszkodzeniu rdzenia kręgowego w odcinku szyjnym

Poważne urazy rdzenia kręgowego często skutkują wadami tkanek. Opisano dwie możliwości skutecznego wypełnienia takich luk w celu promowania adaptacji tkanek, reakcji regeneracyjnych i poprawy funkcjonalnej u szczurów poprzez wszczepienie mechanicznego systemu mikrołączników po ostrym urazie i pięć tygodni po całkowitym przecięciu rdzenia kręgowego.

Eksperymentalne strategie wypełniania dużych luk tkankowych w uszkodzonym rdzeniu kręgowym po ostrym i przewlekłym uszkodzeniu

Ten artykuł opisuje technikę wprowadzania pustego przewodu między kikuty rdzenia kręgowego po całkowitym przecięciu i wypełnieniu komórkami Schwanna (SC) oraz wstrzykiwalną macierzą błony podstawnej w celu wypełnienia i wspomagania regeneracji aksonów w poprzek szczeliny.

Przeszczep komórek Schwanna wewnątrz przewodów PVDF-TrFE w celu zmostkowania przeciętych kikutów rdzenia kręgowego szczura w celu promowania regeneracji aksonów w poprzek luki

Poniższy manuskrypt opisuje nowatorską metodę rozwoju biologicznego, zamkniętego systemu neuronowego sprzężenia zwrotnego, zwanego kompozytowym regeneracyjnym interfejsem nerwów obwodowych (C-RPNI). Konstrukt ten ma zdolność integracji z nerwami obwodowymi w celu wzmocnienia odprowadzających sygnałów motorycznych, jednocześnie zapewniając aferentne sensoryczne sprzężenie zwrotne.

Wytwarzanie kompozytowego regeneracyjnego interfejsu nerwów obwodowych (C-RPNI) u dorosłego szczura

Ten manuskrypt dostarcza innowacyjnej metody rozwoju biologicznego interfejsu nerwów obwodowych, zwanego Muscle Cuff Regenerative Peripheral Nerve Interface (MC-RPNI).  Ten konstrukt chirurgiczny może wzmacniać sygnały odprowadzające motoryczne nerwu obwodowego, aby ułatwić dokładne wykrywanie intencji motorycznej i potencjalną kontrolę urządzeń egzoszkieletowych.

Regeneracyjny interfejs nerwów obwodowych mankietu mięśniowego do wzmacniania nienaruszonych sygnałów nerwów obwodowych

Przedstawiamy nowatorską i wydajną integrację nanofotoniki (QD-FRET) oraz mikrofluidyki w celu zbadania procesu tworzenia polipreksów polielektrolitowych, co w przyszłości powinno zapewnić lepszą kontrolę oraz syntezę jednorodnych i dostosowanych do potrzeb polipreksów stosowanych w terapiach opartych na kwasach nukleinowych.

Połączenie QD-FRET i mikroprzepływowości w celu monitorowania samoorganizacji nanokompleksów DNA w czasie rzeczywistym

Poznaj metodę przeszczepu nerwów obwodowych i modulacji macierzy w celu naprawy uszkodzonego rdzenia kręgowego szczura. Technika ta wspiera regenerację włókien nerwowych i poprawę funkcji.

Połączenie przeszczepu nerwu obwodowego i modulacji macierzy w celu naprawy uszkodzonego rdzenia kręgowego szczura

Przeglądaj więcej filmów