Name: Zapis elektrofizjologiczny w zarodku Drosophila (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-05-21T00:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Poznaj techniki elektrofizjologiczne w zarodku Drosophila do badania właściwości elektrycznych mięśni i neuronów. Ta metoda umożliwia analizę synaptogenezy w zwojach nerwowo-mięśniowych i centralnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

K.B. jest wspierany przez grant NIH GM54544.

Autorzy nie mają żadnych konfliktów interesów do ujawnienia.

Rejestracja elektrofizjologiczna z embrionów Drosophila wymaga manualnej manipulacji i mikrodysekcji. Stan preparatu, a w konsekwencji jakość rejestracji, zależy od umiejętności szybkiego i starannego przygotowania delikatnych tkanek embrionalnych do pomiaru, a następnie przeprowadzenia eksperymentu. Badacze powinni biegle opanować zarówno techniki dysekcji embrionów, jak i elektrofizjologię metodą patch clamp przed próbą jednoczesnego zastosowania obu tych metod.
Pomiary można przep...

rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku drosophila

Electrophysiological Recording in the Drosophila Embryo

Drosophilajest wiodącym modelem genetycznym w badaniach nad rozwojem embrionalnym oraz funkcjonalną neuronauką. Tradycyjnie dziedziny te są od siebie dość odizolowane, z w znacznym stopniu niezależnymi historiami i społecznościami naukowymi. Jednakże punktem styku między tymi zazwyczaj rozbieżnymi obszarami są programy rozwojowe leżące u podstaw nabywania funkcjonalnych właściwości sygnalizacji elektrycznej oraz różnicowania funkcjonalnych synaps chemicznych podczas końcowych faz formowania obwodów neuronalnych. Ten punkt styku stanowi krytycznie ważny obszar badań. WDrosophilate fazy rozwoju funkcjonalnego następują w okresie &lt;8 godzin (w 25°C) podczas ostatniej trzeciej części embriogenezy. Ten późny okres rozwojowy przez długi czas uważano za niepodatny na badania ze względu na odkładanie się twardej, nieprzepuszczalnej kutykuli naskórkowej. Przełomem było zastosowanie wodopolimeryzującego kleju chirurgicznego, który można aplikować miejscowo na kutykulę, co umożliwia kontrolowaną sekcję embrionów w późnym stadium. Poprzez nacięcie podłużne na grzbiecie embrion można rozłożyć płasko, eksponując brzuszny sznur nerwowy oraz mięśnie ściany ciała do badań eksperymentalnych. Można wtedy zastosować techniki patch-clamp w konfiguracji whole-cell do rejestracji sygnałów z pojedynczych, zidentyfikowanych neuronów i mięśni somatycznych. Konfiguracje rejestracyjne te były wykorzystywane do śledzenia pojawienia się i dojrzewania prądów jonowych oraz propagacji potencjałów czynnościowych zarówno w neuronach, jak i w mięśniach. Scharakteryzowano mutanty genetyczne wpływające na te właściwości elektryczne, aby ujawnić skład molekularny kanałów jonowych i powiązanych kompleksów sygnalizacyjnych oraz rozpocząć badanie molekularnych mechanizmów różnicowania funkcjonalnego. Szczególną uwagę poświęcono tworzeniu połączeń synaptycznych, zarówno w ośrodkowym układzie nerwowym, jak i na obwodzie. Glutaminergiczne złącze nerwowo-mięśniowe (NMJ) jest najbardziej dostępne dla kombinacji obrazowania optycznego i rejestracji elektrofizjologicznej. Szklana elektroda ssąca służy do stymulacji nerwu obwodowego, a rejestracje prądów złącza pobudzającego (EJC) przeprowadza się w mięśniu w warunkach clampowania napięcia. Konfiguracja rejestracyjna ta była wykorzystywana do mapowania różnicowania funkcjonalnego synapsy oraz śledzenia pojawienia się i dojrzewania właściwości uwalniania glutaminianu w terminalu presynaptycznym. Dodatkowo właściwości postsynaptyczne można badać niezależnie poprzez jontoforezę lub aplikację glutaminianu pod ciśnieniem bezpośrednio na powierzchnię mięśnia, aby zmierzyć pojawienie się i dojrzewanie pól receptorów glutaminianowych. W ten sposób elementy przed- i postsynaptyczne mogą być monitorowane oddzielnie lub w połączeniu podczas embrionalnej synaptogenezy. System ten był intensywnie wykorzystywany do izolacji i charakterystyki mutantów genetycznych upośledzających tworzenie synaps w okresie embrionalnym, co pozwala ujawnić molekularne mechanizmy sterujące specyfikacją i różnicowaniem połączeń synaptycznych oraz funkcjonalnymi właściwościami sygnalizacji synaptycznej.

Rejestracje elektrofizjologiczne z embrionów Drosophila umożliwiają analizę właściwości elektrycznych rozwijających się mięśni i neuronów, a także charakterystykę funkcjonalnej synaptogenezy w glutaminergicznych złączach neuromięśniowych oraz w centralnych synapsach cholinergicznych i GABAergicznych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

*Drosophila* to czołowy model genetyczny w badaniach nad rozwojem embrionalnym oraz funkcjonalną neuronauką. Tradycyjnie dziedziny te są dość...

Rejestracje elektrofizjologiczne z mięśni i neuronów ruchowych można uzyskać z odpowiednio przygotowanej ściany ciała embrionu oph. Mięśnie 6, 7, 12 lub 13 można łatwo rejestrować w konfiguracji whole cell, a silne prądy miniaturowe można zmierzyć po uzyskaniu uszczelnienia rzędu gigaoma w celu rejestracji z złącza nerwowo-mięśniowego. Elektrody ssącej można użyć do pobrania nerwu ruchowego w pobliżu punktu wyjścia z OUN i dostarczenia stymulacji presynaptycznej, podczas gdy prądy whole cell są mierzone w postsynaptycznym mięśniu.Alternatywnie można użyć pipety do podawania pobudzających neuroprzekaźników w pobliżu elektrody rejestrującej poprzez jontoforezę lub wtrysk pod ciśnieniem. Cześć, jestem Ton z laboratorium Dave'a w Departamencie Nauk Biologicznych na University of Illinois w Chicago. Dzisiaj pokażę wam, jak rejestrować elektrofizjologicznie połączenia nerwowo-mięśniowe w stadium embrionalnym oraz neurony centralne.Procedury te wykorzystujemy do badania funkcji i rozwoju układu nerwowo-mięśniowego u muszki owocówki. Techniki te zostały pierwotnie opracowane przez Kendalla Brody'ego, przekazane Davidowi Fit Stone'owi, a następnie mnie; dziś przekażę je Państwu.Niniejsza procedura wymaga wcześniejszego prawidłowego pobrania i wypreparowania zarodków. Aby dowiedzieć się, jak to osiągnąć, zapoznaj się z towarzyszącą publikacją autorstwa Brody Featherstone i Chen. Rejestracje elektrofizjologiczne z mięśni i neuronów embrionalnych Jossa wykorzystują standardowe techniki patch-clampingu całokomórkowego. W pierwszej kolejności wypreparowany zarodek umieszcza się w niewielkiej komorze rejestracyjnej z pleksiglasu.Obszar rejestracji fizjologicznej jest ekranowany elektrycznie za pomocą klatki Faradaya i umieszczony na stole wibroizolacyjnym. Komora jest obserwowana w świetle przechodzącym przy użyciu prostego mikroskopu złożonego z optyką KY i obiektywem imersyjnym wodnym 40 x o długiej odległości roboczej. Rejestracje z obiektywu są zazwyczaj przeprowadzane w temperaturze poniżej temperatury pokojowej, ponieważ wraz ze wzrostem temperatury coraz trudniej jest wykonać patch-clamp mięśni oph.Elektroda rejestrująca powinna mieć końcową rezystancję od pięciu do 10 mega omów i zostać wypolerowana termicznie do średnicy wewnętrznej około jednego mikrometra. Końcówki elektrod rejestrujących wypełnia się wstecznie roztworem fizjologicznym zawierającym chlorek potasu i sacharozę. Przewód uziemiający z chlorku srebra umieszcza się w kąpieli zawierającej standardową sól fizjologiczną, która jest również wykorzystywana podczas dysekcji embrionów.Sygnały są wzmacniane za pomocą wzmacniacza patch clamp, filtrowane i zapisywane cyfrowo do późniejszej analizy. Można użyć każdego systemu odpowiedniego do eksperymentów patch clamp, takiego jak sprzęt i oprogramowanie firmy Axon. Komórki pochodzące z trzech różnych tkanek zarodkowego układu nerwowego mogą teraz być stymulowane i rejestrowane: neurony mięśniowe w obrębie NMJ oraz centralne neurony ruchowe.Dzięki tej metodzie przygotowania zarodka można rejestrować aktywność dowolnego mięśnia zarodkowego w większości eksperymentów. Należy skupić się na grupie czterech podłużnych mięśni brzusznych 6, 7, 12 i 13, w szczególności na mięśniu szóstym w przedniej części brzucha, A2-A3, aby rejestrować sygnały z mięśni grzbietowych. Zarodek musi zostać przyklejony stroną grzbietową do podłoża, a w przypadku młodych zarodków należy go rozciąć wzdłuż linii środkowej strony brzusznej.Przed rejestracją z mięśni nie jest wymagana obróbka enzymatyczna. Jednak w późniejszych embrionach z rozwiniętą kutykulą przed rejestracją metodą patch-clamp rozwija się również osłona mięśniowa. Osłonę tę należy usunąć poprzez krótkie zanurzenie w kolagenazie.Większość pomiarów wykonuje się w konfiguracji rejestracji z całej komórki (whole cell), którą łatwo uzyskać z poziomu kontaktu z błoną komórkową (cell attached) poprzez lekkie podciśnienie lub impuls elektryczny. Jest to tzw. zap, czyli stymulacja elektryczna służąca do przerwania błony komórkowej.W konfiguracji whole-cell opory uszczelnienia w mięśniach są zazwyczaj wyższe niż 1 GΩ. Prądy whole-cell uzyskuje się zazwyczaj w czasie krótszym niż trzy minuty po utworzeniu uszczelnienia. W większości przypadków opór szeregowy ulega znacznemu zwiększeniu, a w komórkach może rozwinąć się zwiększony prąd przecieku. Do metody patch clamp zarodki muszą mieć co najmniej 14 godzin; we wcześniejszych etapach rozwoju.Silne sprzężenie elektryczne między miocytami sprawia, że clampowanie napięcia podczas rejestracji metodą patch-clamp z włókien mięśniowych staje się niedokładne. Typowe potencjały holdingowe wynoszą od -60 do -80 mV i można stosować metody clampowania napięcia oraz clampowania prądu. Pomyślne rejestracje z całej komórki przy -60 mV towarzyszą silne spontaniczne prądy synaptyczne o wartościach od kilku do kilkuset pA, takich jak te przedstawione tutaj.Duże prądy NMJ można wywołać poprzez stymulację nerwu ruchowego za pomocą elektrod ssących. Można je wykonać z różnych szklanych elektrod wypełnionych włóknami, które należy poddać wypalaniu w celu uzyskania pożądanej konfiguracji. Używając delikatnego ssania, naciągnij niewielki odcinek odpowiedniego segmentowego nerwu ruchowego w pobliżu punktu wyjścia z OUN. Aby uzyskać szczelne połączenie, najlepiej zastosować krótką stymulację o intensywności określonej eksperymentalnie, zazwyczaj od 1 V do 5 V. Niezawodną stymulację osiąga się, ustawiając natężenie bodźca o 1 V do 2 V powyżej progu wyznaczonego eksperymentalnie.Postsynaptyczne receptory glutaminianowe w NMJ mogą być aktywowane poprzez aplikację neuroprzekaźnika glutaminianu; naładowane cząsteczki, takie jak glutaminian, mogą być dostarczane do NMJ za pomocą jontoforezy. Do mapowania receptorów wykorzystuje się pipety o wysokiej rezystancji, natomiast do szacowania całkowitej odpowiedzi receptorów glutaminianowych stosuje się pipety o niższej rezystancji. Pipety jontoforetyczne napełnia się 100 mM roztworem L-glutaminianu.Aby uwolnić L-glutaminian, należy zastosować krótki impuls prądu ujemnego z niewielkim dodatnim prądem kompensacyjnym w celu zapobiegania wyciekowi; glutaminian lub dowolna nienaładowana cząsteczka mogą być również dostarczane do NMJ za pomocą wyrzutu ciśnieniowego. W przypadku wyrzutu ciśnieniowego należy zastosować glutaminian o stężeniu od 1 do 2 mM i przyłożyć siłę wypychającą od 5 do 10 PSI do pipety, korzystając z urządzenia pico spritzer.Prądy w NMJ wywołane stymulacją nerwu lub aplikacją glutaminianu przy -60 mV zazwyczaj wynoszą od 1500 do 2000 pA. Wiele neuronów embrionalnych można zidentyfikować indywidualnie na podstawie położenia somy i morfologii projekcji. Większość rejestracji eksperymentalnych koncentrowała się na grupie pięciu powierzchownych neuronów grzbietowych w obrębie embrionalnego brzusznego sznura nerwowego.Aby zarejestrować sygnały z tych neuronów, należy usunąć osłonkę neuromy brzusznego sznura nerwowego poprzez krótką, miejscową obróbkę proteazą; ciała komórkowe są uwalniane z osłonki poprzez podanie 0,5 do 1% proteazy podczas rejestracji, wykorzystując pipetę patch o dużej średnicy do zassania materiału osłonki do wnętrza pipety zawierającej proteazę. Można zastosować delikatne ssanie ustami, aby wielokrotnie wciągać i wypuszczać osłonkę z pipety. Po jednej lub dwóch minutach osłonka ulegnie rozerwaniu.Komórki są teraz przygotowane do rejestracji metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell. Ten model rejestracji nie wymaga cyrkulacji ani podgrzewania soli fizjologicznej. Zewnętrzny roztwór soli fizjologicznej stosowany w tej preparacji różni się od roztworu używanego podczas rejestracji z mięśni.Pipetę do patch-clampu można napełnić barwnikiem Lucifer yellow, aby później zwizualizować pozycję i morfologię komórki poddanej patchowi. Przedstawiony tutaj centralny neuron ruchowy pobrał barwnik Lucifer yellow i został zwizualizowany przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej. Rejestracje w konfiguracji whole-cell z zastosowaniem clampingu napięcia prowadzone są przy potencjałach spoczynkowych wynoszących -60 mV w temperaturze 18 °C.Możliwe jest również rejestrowanie w trybie clamp prądowy. Neurony można stymulować neuroprzekaźnikami: acetylocholiną lub GABA. Są one aplikowane do ciała komórki za pomocą jontoforezy lub wyrzutu ciśnieniowego, podobnie jak podczas rejestracji z njs.Po ustanowieniu połączenia typu whole-cell w pierwszej kolejności obserwuje się prądy spontaniczne. Przedstawiono minutę surowych danych uzyskanych z embrionalnego brzusznego mięśnia podłużnego 6, w którym zastosowano metodę patch clamp przy potencjale -60 mV w warunkach braku stymulacji. Zdrowy preparat zazwyczaj wykazuje silną spontaniczną aktywność synaptyczną, reprezentowaną tutaj przez liczne odchylenia prądu skierowane w dół.Oto dane z tego samego mięśnia z zastosowaniem stymulacji za pomocą pipety ssącej na nerwie ruchowym prowadzącym do tego mięśnia. Doprowadziło to do wielokrotnych wychyleń prądu w dół, reprezentujących wywołane prądy złączeniowe (e jcs). Są to dane z tego samego mięśnia stymulowanego 1 mM glutaminianu podanego za pomocą wtrysku ciśnieniowego.Glutaminian otwiera receptory, co prowadzi do dużych wychyleń w dół. Na zapisie przedstawione są dwa ślady obrazujące dwie kolejne aplikacje glutaminianu. Właśnie pokazałem Państwu, jak rejestrować sygnały elektrofizjologiczne z embrionów Xenopus w późnym stadium; rejestracja elektrofizjologiczna wykorzystuje zazwyczaj standardowe techniki patch-clamp, których nie będziemy tutaj szczegółowo opisywać.Idealnie byłoby, gdyby każda osoba chcąca rejestrować sygnały z embrionów zmiękczonych, uprzednio opanowała technikę patch-clamp na prostszym preparacie. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

electrophysiological-recording-in-the-drosophila-embryo

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę izolacji całych mózgów dorosłych muszek Drosophila w celu przygotowania do rejestracji z pojedynczych neuronów przy użyciu standardowej techniki whole-cell. Materiał zawiera obrazy komórek i neuronów znakowanych GFP, zarejestrowane podczas pomiarów.

Rejestracja z całej komórki z mózgu dorosłej muchy Drosophila

W niniejszej pracy opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwalnianie wywołane inicjuje się sztucznie poprzez stymulację aksonów neuronów ruchowych, a przekaźnictwo w złączu NMJ można zmierzyć na podstawie odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.

Metody elektrofizjologiczne rejestracji potencjałów synaptycznych z złącza nerwowo-mięśniowego larw Drosophila

Technika ta umożliwia odsłonięcie układu nerwowo-mięśniowego embrionów Drosophila do przeprowadzenia immunohistochemii lub rejestracji elektrofizjologicznej. Jest ona przydatna do badania wczesnych etapów rozwoju nerwowo-mięśniowego lub wykonywania badań elektrofizjologicznych u mutantów, które nie są w stanie wykluć się z jaj.

Zbieranie i przygotowywanie embrionów Drosophila do rejestracji elektrofizjologicznej i innych procedur

System Gigantycznych Włókien jest prostym obwodem neuronalnym u dorosłych Drosophila melanogaster, zawierającym największe neurony w organizmie muchy. Opisujemy protokół monitorowania przekaźnictwa synaptycznego w tej ścieżce poprzez rejestrację potencjałów postsynaptycznych w mięśniach grzbietowych podłużnych (DLM) i tergotrochanteralnych (TTM) po bezpośredniej stymulacji interneuronów Gigantycznych Włókien.

Rejestracje elektrofizjologiczne z drogi włókna olbrzymiego D. melanogaster

Ten film przedstawia protokół elektrofizjologicznego zapisu aktywności fotoreceptorów w oku unieruchomionej Drosophila, umożliwiając precyzyjny pomiar zmian napięcia w odpowiedzi na bodźce świetlne.

Elektrofizjologiczny zapis napięciowych odpowiedzi fotoreceptorów siatkówki Drosophila na bodźce świetlne

Wideo demonstruje zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej z ośrodkowego układu nerwowego (OUN) larw Drosophila. Przecięty OUN jest umieszczany w komorze rejestracyjnej, a aktywność elektryczna z nerwu zstępującego jest rejestrowana w celu ustalenia podstawowej częstotliwości wypalania. Następnie wprowadza się czynnik testowy i rejestruje się zmianę częstotliwości wypalania w celu określenia działania pobudzającego lub hamującego czynnika.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności elektrycznej w ośrodkowym układzie nerwowym Drosophila

Ten protokół opisuje zewnątrzkomórkowy zapis odpowiedzi potencjału czynnościowego wyzwalanych przez neurony smaku etykietowego u Drosophila.

Zapis elektrofizjologiczny z Drosophila labellar Taste Sensilla

Ostre mikroelektrody umożliwiają dokładną elektrofizjologiczną charakterystykę fotoreceptorów i wizualnych interneuronów u żyjących Drosophila. Tutaj pokazujemy, jak wykorzystać tę metodę do rejestrowania wysokiej jakości odpowiedzi napięciowych poszczególnych komórek na kontrolowaną stymulację światłem. Ta metoda jest idealna do badania przetwarzania informacji neuronalnych w oczach złożonych owadów.

Elektrofizjologiczna metoda rejestracji wewnątrzkomórkowych odpowiedzi napięciowych fotoreceptorów i interneuronów Drosophila na bodźce świetlne in vivo

Zapisy całokomórkowe z fotoreceptorów Drosophila melanogaster umożliwiają pomiar spontanicznych ciemnych guzków, wybrzuszeń kwantowych, makroskopowych reakcji na światło i zależności prąd-napięcie w różnych warunkach. W połączeniu z narzędziami manipulacji genetycznej D. melanogaster, metoda ta umożliwia badanie wszechobecnego szlaku sygnałowego inozytol-lipid i jego celu, czyli kanału TRP.

Metoda elektrofizjologiczna dla zapisów cęgów napięcia w całej komórce z fotoreceptorów Drosophila

Ten protokół opisuje metodę rejestrowania malejącej aktywności elektrycznej ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster, aby umożliwić ekonomiczne i wygodne testowanie środków farmakologicznych, mutacji genetycznych białek nerwowych i/lub roli niezbadanych ścieżek fizjologicznych.

Elektrofizjologiczny zapis aktywności ośrodkowego układu nerwowego Drosophila melanogaster w trzecim stadium rozwojowym

Celem tego protokołu jest przedstawienie projektu i wydajności eksperymentów in vivo na Drosophila melanogaster w celu oceny funkcjonalnych konsekwencji rzadkich wariantów genów związanych z chorobami ludzkimi.

Badanie funkcjonalne in vivo rzadkich wariantów ludzkich związanych z chorobą przy użyciu Drosophila

Poznaj techniki elektrofizjologiczne w zarodku Drosophila do badania właściwości elektrycznych mięśni i neuronów. Ta metoda umożliwia analizę synaptogenezy w zwojach nerwowo-mięśniowych i centralnych.

Rejestracja elektrofizjologiczna w zarodku Drosophila

Przeglądaj więcej filmów