Name: Ekstrakcja DNA z filtrów sterivex 0,22 μM i wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2009-09-18T05:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 14 s
Description: Poznaj ekstrakcję DNA z filtrów Sterivex i wirowanie w gradiencie chlorku cezu. Ta metoda pozwala uzyskać wysokiej jakości DNA genomowe z biomasy planktonowej do badań mikrobiomu morskiego.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Kanadyjskiej Fundacji na rzecz Innowacji (Canadian Foundation for Innovation), Funduszowi Rozwoju Wiedzy Kolumbii Brytyjskiej (British Columbia Knowledge Development Fund) oraz Narodowej Radzie Badań w dziedzinie Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) w Kanadzie za wsparcie prowadzonych badań nad obszarami o niskiej zawartości tlenu w wodach przybrzeżnych i otwartych oceanach. J.J.W. otrzymał wsparcie w formie stypendiów z NSERC, a D.A.W. otrzymał wsparcie w formie stypendiów z NSERC, Killam oraz finansowanego przez fundację TULA Centrum Różnorodności i Ewolucji Mikrobowej. S.L. otrzymał wsparcie z finansowanego przez fundację TULA Centrum Różnorodności i Ewolucji Mikrobowej.

Uwaga: Wszystkie odczynniki użyte w tym protokole są porcjowane z zapasów laboratoryjnych do mniejszych zapasów roboczych – jest to bardzo ważne, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej próbek DNA oraz zanieczyszczenia zapasów laboratoryjnych. Ponadto podczas pipetowania należy pamiętać o wymianie końcówek pipety przy każdym dodawaniu odczynnika, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.
Część pierwsza: Lizy komórek i trawienie
<ol>
<li>Protokół należy rozpocząć od rozmrożenia na lodzie filtrów Sterivex zawierających uprzednio skoncentrowaną biomasę planktoniczną. Dla uproszczenia opisano tutaj procedurę przetwarzania pojedynczego filtra. W praktyce zaleca się przetwarzanie maksymalnie 16 filtrów jednocześnie.</li>
 <li>Po rozmrożeniu filtra należy rozpocząć pierwszą z dwóch inkubacji: jedną w celu lizy komórek i usunięcia RNA oraz drugą w celu rozkładu białek. W pierwszej inkubacji do filtra należy dodać 100 μl lizozymu (125 mg w 1000 μl TE) oraz 20 ml RNazy A (10 μg/ml). Filtr należy ponownie uszczelnić Parafilmem i pozostawić w rotacyjnym piecu do hybrydyzacji w temperaturze 37°C na 1 godzinę.</li>
 <li>Do kolejnej inkubacji do filtra należy dodać 100 μl Proteinazy K oraz 100 μl 20% SDS. Po ponownym uszczelnieniu Parafilmem filtr należy pozostawić w rotacyjnym piecu do hybrydyzacji na kolejne jedną do dwóch godzin, tym razem w temperaturze 55°C.</li>
 <li>Za pomocą strzykawki 5cc należy przenieść lizat z filtra Sterivex do probówki Falcon 15 ml. Filtr należy przepłukać 1 ml buforu do lizy, a ciecz z płukania dodać do lizatu w probówce Falcon za pomocą strzykawki 5cc. Po przeprowadzeniu lizy i trawienia komórek można przystąpić do ekstrakcji DNA.</li> 
 </ol>
Część druga: Ekstrakcja DNA
<ol>
<li>Kolejnym krokiem jest zastosowanie metody fenolowo-chloroformowej w celu wyekstrahowania DNA z lizatu. Do probówki z lizatem należy dodać taką samą objętość (około 3 ml) mieszaniny fenol:chloroform:alkohol izoamylkowy (IAA), pamiętając o wymianie końcówek pipety przed każdym dodaniem, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej. Mieszać na wortexie przez 10 sekund do uzyskania jednorodnej zawiesiny.</li>
 <li>Wirować probówkę z prędkością 2500 g przez 5 minut, upewniając się, że wirówka jest zrównoważona. Podczas wirowania mieszanina fenolowo-chloroformowo-lizatowa powinna rozdzielić się na dwie warstwy: dolną warstwę organiczną zawierającą fenol, chloroform i białka z próbki oraz górną warstwę wodną, składającą się z DNA, wody i innych bardziej hydrofilowych cząsteczek.</li>
 <li>Przenieść warstwę wodną (zawierającą DNA) do nowej probówki typu Falcon o pojemności 15 ml. Należy uważać, aby końcówką pipety nie dotknąć granicy faz (zawsze należy pozostawić niewielką ilość warstwy wodnej).</li>
 <li>Do nowej probówki dodać taką samą objętość (ok. 3 ml) mieszaniny chloroform:IAA, pamiętając o wymianie końcówek pipety przed każdym dodaniem, aby uniknąć kontaminacji krzyżowej. Mieszać na wortexie przez 10 sekund. Krok ten pomaga usunąć pozostałości fenolu z próbki DNA.</li>
 <li>Wirować z prędkością 2500 g przez 5 minut lub do czasu, aż warstwa wodna stanie się klarowna. Przenieść warstwę wodną do nowej, opisanej probówki typu Falcon i dodać 1 ml buforu TE o pH 8.0, uważając, aby nie dotknąć końcówką pipety granicy faz (zawsze należy pozostawić niewielką ilość warstwy wodnej). Ta warstwa wodna zawiera ekstrakt DNA.</li>
 </ol>
Część trzecia: Oznaczanie stężenia i przemywanie DNA
<ol>
<li>Kolejnym krokiem jest przemycie i zagęszczenie próbki DNA w 15 ml probówce wirówkowej Amicon Ultra. Probówki Amicon składają się z filtra, który zatrzymuje cząsteczki o określonej masie cząsteczkowej lub większej (retentat), oraz probówki do zbierania przelywu (filtratu). W tym przypadku filtr zatrzymuje DNA (retentat). Przenieś ekstrakt DNA z kroku 2.5 do komory z filtrem w probówce Amicon Ultra.</li>
 <li>Wiruj przy 3500 g przez 10 minut. Sprawdź, czy w filtrze Amicon pozostało mniej niż 1 ml cieczy. Jeśli pozostało więcej retentatu, napełnij filtr buforem TE i wiruj ponownie. Aby uniknąć kontaminacji krzyżowej, przy każdym dodawaniu TE używaj nowej końcówki do pipety.</li>
 <li>Przenieś przelew, czyli filtrat, do innej probówki Falcon i przechowuj go w lodówce do czasu potwierdzenia końcowego produktu DNA na żelu (Część czwarta).</li>
 <li>Dodaj 2 ml buforu TE do filtra Amicon i wiruj przy 3500 g przez 6 minut, pamiętając o użyciu nowej końcówki do pipety przy każdym dodawaniu TE w celu uniknięcia kontaminacji krzyżowej. Połącz filtrat z tym z kroku 3.3 i przechowuj w lodówce.</li>
 <li>Przemyj DNA dwukrotnie więcej buforem TE, tak aby łącznie wykonać trzy przemycia (zawsze używając nowej końcówki do pipety), za każdym razem zachowując filtrat (zgodnie z krokami 3.3 i 3.4). Podczas ostatniego przemycia wiruj do momentu, aż w filtrze Amicon pozostanie od 200 do 500 µl retentatu. Zanotuj końcową objętość i przenieś retentat (zawierający DNA) do opisanej probówki Eppendorf 1.5 ml.</li>
</ol>
Część czwarta: Ocena jakości DNA
<ol>
<li>Sprawdź jakość DNA i oszacuj jego stężenie, przeprowadzając elektroforezę próbek w 0,8% żelu agarozowym zabarwionym 1ml bromkiem etydyny (EtBr) przez noc. (Zachowaj szczególną ostrożność podczas używania EtBr – jest on znanym mutagenem i podejrzewanym kancerogenem. Pamiętaj o częstej zmianie rękawiczek i unikaj przenoszenia EtBr do pozostałych części laboratorium oraz na skórę). Nałóż próbki obok markerów wielkości DNA, które służą jako standardy wielkości i intensywności (patrz następny krok). </li>
 <li>W pierwszych kilku studzienkach nałóż markery z prążkami o różnych masach cząsteczkowych i stężeniach. Zalecamy następujący schemat nakładania: w pierwszej i ostatniej studzience (zewnętrznych) nałóż 10 μl markera 1kb+ lub 2log o stężeniu 50ng/μl. W studzienkach 2, 3 i 4 nałóż odpowiednio 2 μl, 5 μl i 10 μl markera λHindIII o stężeniu 50ng/μl. Na koniec nałóż 5 μl ekstraktu DNA z barwnikiem do każdej z próbek w osobnych studzienkach. </li>
 <li>Prowadź elektroforezę przy napięciu 15 V przez około 16 godzin (zalecamy prowadzenie procesu przez noc). </li>
 <li>Następnego dnia wykonaj zdjęcie żelu za pomocą systemu dokumentacji żeli UV. Aby określić zakres masy cząsteczkowej oraz stężenie DNA, porównaj prążki próbek z prążkami markerów. DNA dobrej jakości będzie miało wysoką masę cząsteczkową (&gt;36kb) i nie będzie wykazywać oznak ścinania/degradacji. Patrz Rycina 1.</li>
</ol>
Część piąta: Centryfugacja w gradiencie chlorku cezu
<ol>
 <li>Jeśli jakość DNA jest dobra, a ilość wystarczająca, można przystąpić do oczyszczania DNA poprzez wirowanie w gradiencie chlorku cezu (CsCl). Należy pamiętać, że ten etap oczyszczania jest opcjonalny i nie jest konieczny dla wszystkich dalszych zastosowań (na przykład w przypadku tworzenia bibliotek fosmidów oczyszczanie POWINNO zostać przeprowadzone, natomiast przy zwykłym przeprowadzaniu reakcji PCR zazwyczaj nie jest ono wymagane). Najpierw należy oznakować jedną probówkę wirówkową dla każdej próbki. </li>
 <li>Do każdej probówki wirówkowej dodać 160 mg CsCl oraz 178 μl DNA genomowego. Po dodaniu CsCl i DNA do probówki, przykryć ją małym kawałkiem parafilmu i delikatnie odwrócić probówkę od dziesięciu do dwudziestu razy w celu wymieszania składników. Nie mieszać za pomocą pipety, ponieważ może to spowodować fragmentację DNA. Następnie dodać do probówki 10 μl EtBr w stężeniu 10 μg/μl i wymieszać w ten sam sposób. (Należy zachować szczególną ostrożność podczas używania EtBr – jest to znany mutagen i podejrzewany kancerogen. Należy często zmieniać rękawiczki i unikać przenoszenia EtBr do pozostałej części laboratorium oraz na skórę).</li>
 <li>Przed wirowaniem należy upewnić się, że wszystkie probówki są zrównoważone, tak aby różnice w masie między probówkami nie przekraczały 1 mg. </li>
 <li>Za pomocą kleszczyków hemostatycznych umieścić probówki w rotorze, zamknąć pokrywę i umieścić rotor w ultrawirówce. </li>
 <li>Zamknąć drzwiczki ultrawirówki. Próżnia zostanie wytworzona natychmiast po zamknięciu drzwiczek. Wirować przez noc w temperaturze 20°C przy 100,000 rpm przez 18 godzin. </li>
 <li>Po zakończeniu wirowania wyjąć probówki z rotora za pomocą kleszczyków hemostatycznych i umieścić je w statywie. </li>
 <li>Wizualizować DNA za pomocą transiluminatora światła niebieskiego lub, jeśli jest niedostępny, światła UV o długiej fali, w ciemni. Nosić okulary z filtrem bursztynowym, aby dostrzec prążek DNA. Patrz Rysunek 2. </li>
 <li>Używając sterylnej strzykawki 1 cm³ i igły (26G 5/8), pobrać prążek DNA i umieścić go w probówce Eppendorf 1,5 ml. </li>
 <li>Aby pomóc w odzyskaniu większości DNA uwięzionego w martwej przestrzeni strzykawki, przepłukać strzykawkę 100 μl TE i dodać roztwór z płukania do probówki. Należy przygotować jedną probówkę z 100 μl buforu TE na każdą próbkę, aby zapobiec zanieczyszczeniom krzyżowym. </li>
 <li>Aby usunąć EtBr z DNA, dodać do probówki równą objętość nasyconego wodą butanolu, delikatnie odwrócić probówki od dziesięciu do dwudziestu razy, wirować przy 10000 rpm przez 1 minutę i odrzucić górną warstwę. </li>
 <li>Powtarzać płukanie jeszcze 3–4 razy, aż butanol stanie się przezroczysty. </li>
 <li>Wlać 4 ml TE do probówki wirówkowej Amicon Ultra i dodać powyższy roztwór DNA. </li>
 <li>Wirować przy 3500 g w temperaturze pokojowej, aż objętość DNA zostanie zredukowana do około 100-500 μl (około 6-7 minut), a następnie odrzucić filtrat. </li>
 <li>Dodać 2 ml TE do filtra Amicon i wirować przy 3500 g przez 6 minut, pamiętając o użyciu nowej końcówki pipety przy każdym dodawaniu, aby uniknąć zanieczyszczeń krzyżowych. Powtórzyć dwukrotnie. </li>
 <li>Zagęścić do końcowej objętości 50-100 μl poprzez dodatkowe wirowanie w razie potrzeby i przenieść roztwór DNA z filtra do nowej probówki Eppendorf 1,5 ml. </li>
 <li>Dodać 40 μl TE do filtra Amicon i pipetować w górę i w dół wzdłuż obu membran filtra, aby wypłukać pozostałe DNA. Dodać ten roztwór do probówki z punktu 5.15. </li>
 <li>Umieścić jednostkę filtrującą Microcon YM-30 w probówce Microcon i wstępnie wypłukać Microcon, dodając 200 μl wody autoklawowanej i wirować przy 10000 rpm przez 7 minut. </li>
 <li>Dodać roztwór DNA z punktu 5.16 do wstępnie wypłukanego Microconu w celu dalszej koncentracji DNA. Wirować przy 5000-10000 g przez 1-3 minuty. Sprawdzić ilość cieczy na filtrze i powtarzać wirowanie, aż ilość cieczy na filtrze zostanie zredukowana do około 50 μl.</li>
 <li>Umieścić jednostkę filtrującą do góry dnem w nowej probówce Microcon i wirować przy 1000 g przez 3 minuty. Idealna objętość skoncentrowanego roztworu to 50-60 μl. </li>
 <li>Zmierzyć i zapisać stężenie DNA za pomocą Nanodrop oraz sprawdzić jakość piku (powinien wynosić 260 nm).</li>
 <li>Przenieść niewielką alikwot DNA do czystej probówki Eppendorf jako zapas roboczy i zamrozić w temperaturze -20°C. Przenieść resztę DNA do drugiej czystej probówki Eppendorf i zamrozić w temperaturze -80°C.</li>
</ol>
Reprezentatywne wyniki:
Po prawidłowym wykonaniu tego protokołu, obraz żelu uzyskany po kroku 4.4 w sekcji Determination of DNA quality powinien być podobny do Rysunku 1. Rzeczywiste stężenie DNA w ekstraktach będzie się różnić w zależności od źródła próbki. Po kroku 5.7 w sekcji CsCl gradient centrifugation, genomowe DNA oświetlone niebieskim światłem powinno wyglądać podobnie do Rysunku 2.
<img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig1newer.png" alt="Schemat elektroforezy żelowej: rozdział DNA, widoczne markery masy cząsteczkowej, pokazujące migrację prążków." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rycina 1"> Rycina 1. Obraz elektroforezy w 0,8% żelu agarozy dla wysokocząsteczkowego DNA pobranego z czterech głębokości w subarktycznym Oceanie Spokojnym (w duplikacie), barwionego interkalującym agentem bromkiem etydyny (10 mg/ml). Żel był prowadzony przy 15V przez ok. 16h w 1X buforze do elektroforezy TBE. Prążki próbek są dobrej jakości i wykazują niewielkie oznaki mechanicznego ścinania (widoczne są pojedyncze prążki lub smugi, w przeciwieństwie do wielu prążków), choć w ekstraktach z 10m zachowana jest pewna ilość zanieczyszczeń RNA (widoczna smuga w zakresie od 0,5 do 2,0 Kb). 
<img src="/files/ftp_upload/1352/1352Fig2.jpg" alt="Fluorescencja w probówkach; proces chromatografii do rozdziału DNA przy użyciu światła UV." data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Rysunek 2"> Rysunek 2.Prążek genomowego DNA oświetlony niebieskim światłem po wirowaniu w gradiencie CsCl.

<ol><li>Beja, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+BAC+or+not+to+BAC%3A+marine+ecogenomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">To BAC or not to BAC: marine ecogenomics.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (3), 187-190 (2004).</li>
<li>Beja, O., Suzuki, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+analysis+of+bacterial+artificial+chromosome+libraries+from+a+marine+microbial+assemblage%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage.</a> Environ Microbiol. 2 (5), 516-529 (2000).</li>
<li>DeLong, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+genomics+among+stratified+microbial+assemblages+in+the+oceans+interior%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Community genomics among stratified microbial assemblages in the oceans interior.</a> Science. 311, 496-503 (2006).</li>
<li>Stein, J. L., Marsh, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+uncultivated+prokaryotes%3A+isolation+and+analysis+of+a+40-kilobase-pair+genome+fragment+from+a+planktonic+marine+archaeon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40-kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon.</a> J Bacteriol. 178 (3), 591-599 (1996).</li>
<li>Somerville, C. C., Knight, I. T., Straube, W. L., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+rapid+method+for+the+direct+isolation+of+nucleic+acids+from+aquatic+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Appl.+Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A simple, rapid method for the direct isolation of nucleic acids from aquatic environments.</a> Appl. Environ. Microbiol. 55 (3), 548-554 (1989).</li>
</ol>

W zależności od liczby przetwarzanych próbek, procedura ta może być czasochłonna ze względu na dwa godzinne etapy inkubacji oraz powtarzające się etapy przemywania i wirowania. Najlepiej zaplanować na tę procedurę dwa pełne dni, aby zapewnić sobie odpowiedni zapas czasu. Jeśli podczas koncentrowania i przemywania DNA pojawią się problemy z zredukowaniem końcowej objętości ekstraktu w probówce Amicon do poziomu 200-500μl, należy spróbować przeprowadzić dodatkowe przemycia buforem TE i wirowania (powtórzyć Część Trzecią), ...

A correction was made to "<a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>". A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.
The step was corrected from:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 ml RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.
to:
Once the filter has thawed, begin the first of two incubations: one to lyse the cells and remove RNA, and one to break down proteins. For the first incubation, add 100 &#956;l lysozyme (125 mg in 1000 &#956;l TE) and 20 &#956;l RNase A (10 &#956;g/ml) to the filter. Reseal the filter with Parafilm and leave it to rotate in the hybridization oven at 37&#176;C for 1 hour.

A correction was made to <a href="/video/1352">DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation</a>. A typo in a volume's measurement was corrected in step 1.2.

Erratum: DNA Extraction from 0.22 &#181;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

<table><tbody><tr><td>strzykawka 1 ml (igła 26G 5/8)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 1 ml (igła 26G5/8)</td><td>BD Biosciences</td><td>309597</td><td></td></tr><tr><td>probówki Eppendorf 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 125.150</td><td></td></tr><tr><td>probówki 15 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>strzykawka 5 ml</td><td>BD Biosciences</td><td>309603</td><td></td></tr><tr><td>Amicon&amp;#174; Urządzenia do filtrowania odśrodkowego Ultra-4</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC801096</td><td>Limit nominalnej masy cząsteczkowej 10 000</td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A383-1</td><td>Nasyć go wodą (butanol:woda = 1:1)</td></tr><tr><td>Rotor wirówki, JA5.3 </td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>368690</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka, Avanti&amp;#174; J-E</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>369003</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek cezu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4036</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform:IAA (24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>25666-500ML</td><td></td></tr><tr><td>bromek etydyny (EtBr)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ml</td><td></td></tr><tr><td>Dwuwodny dwusód etylenodiaminotetraoctanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Piec do hybrydyzacji</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10</td><td>37&amp;#x00B0;C &amp;amp; 55&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>Bufor lizujący</td><td></td><td></td><td>0,75 M sacharozy, 40 mM EDTA, 50 mM Tris (pH 8,3)</td></tr><tr><td>Lizozym</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876-5G</td><td>125 mg w 1000 &amp;#x03BC;l TE</td></tr><tr><td>Microcon&amp;#174; Centryfużna jednostka filtrująca Ultracel YM-30</td><td>EMD Millipore</td><td>42410</td><td>próg odcięcia 50 bp</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Fenol:chloroform:IAA (25:24:1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77617-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaza K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>RNaza A</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2539-100</td><td>10 &amp;#x03BC;g/ml</td></tr><tr><td>Safe Imager&amp;#8482; Transiluminator do światła niebieskiego</td><td>Invitrogen</td><td>S37102</td><td></td></tr><tr><td>Dodecylosiarczan sodu (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4509</td><td>20% SDS</td></tr><tr><td>filtry Sterivex</td><td>Fisher Scientific</td><td>SVG010RS</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka laboratoryjna nakładkowa</td><td>Eppendorf</td><td>5415D</td><td></td></tr><tr><td>bufor TE, pH 8,0</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma&amp;#174; zasada</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Rotor ultrawirówki, TLA 100</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343847</td><td></td></tr><tr><td>Probówka do ultrawirówki (7x20 mm, PC)</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>343775</td><td></td></tr><tr><td>Statyw na probówki do ultrawirówki</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td>348302</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentryfuga, Optima&amp;#174; Maksymalny</td><td>Beckman Coulter Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ekstrakcja dna z filtrów sterivex 0,22 $\mu$m oraz wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu

DNA Extraction from 0.22 &mu;M Sterivex Filters and Cesium Chloride Density Gradient Centrifugation

Metoda ta jest wykorzystywana do ekstrakcji wysokocząsteczkowego genomowego DNA z biomasy planktonicznej skoncentrowanej na filtrach Sterivex 0,22 $\mu$M, które zostały potraktowane buforem do przechowywania/lizy i zarchiwizowane w temperaturze -80°C, a następnie do oczyszczania tego DNA przy użyciu gradientu gęstości chlorku cezu. Protokół rozpoczyna się od dwóch jedno-godzinnych etapów inkubacji w celu uwolnienia DNA z komórek i usunięcia RNA. Następnie przeprowadza się serię ekstrakcji fenol:chloroformem i chloroformem, po których następuje wirowanie w celu usunięcia białek i składników błon komórkowych, zebranie wodnego ekstraktu DNA oraz kilka etapów wymiany buforu w celu przemycia i skoncentrowania ekstraktu. Część piąta opisuje opcjonalne oczyszczanie za pomocą gradientu gęstości chlorku cezu. Aby uniknąć pomyłek i skrócić czas trwania procedury, zaleca się pracę z mniej niż 15 próbkami jednocześnie. Całkowity czas wymagany do przeprowadzenia tego protokołu zależy od liczby próbek przeznaczonych do ekstrakcji. W przypadku 10–15 próbek, przy założeniu dostępności odpowiedniego sprzętu do wirowania, cały protokół powinien zająć 3 dni. Przed rozpoczęciem procesu należy upewnić się, że piece do hybrydyzacji zostały ustawione na odpowiednią temperaturę.

Opisujemy metodę ekstrakcji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z biomasy planktonicznej skoncentrowanej na filtrach Sterivex 0.22 μm, a następnie oczyszczania go za pomocą wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu.

Ekstrakcja DNA z filtrów Sterivex 0,22 $\mu$M oraz wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu

Metoda ta jest stosowana do izolacji genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z biomasy planktonicznej skoncentrowanej na filtrach Sterivex 0,22 $\mu$M, które zostały...

Witajcie, jestem Jody z laboratorium Stevena Hallama w Katedrze Mikrobiologii i Immunologii na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę ekstrakcji genomowego DNA skoncentrowanego z próbek wody morskiej na filtrach STX o rozmiarze 0,2 mikrona oraz oczyszczanie tego DNA za pomocą wirowania w gradiencie gęstości chlorku cezu. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu uzyskania środowiskowego DNA, aby móc badać strukturę, różnorodność i metabolizm społeczności mikrobiologicznych w środowiskach morskich.Zacznijmy. Niniejszy protokół należy rozpocząć od rozmrożenia na lodzie zestawu filtrów, które wcześniej skoncentrowano z biomasą planktoniczną, poddano działaniu buforu lizującego i zamrożono dla ułatwienia pracy. W tej części opisano procedurę przetwarzania pojedynczego filtra.W praktyce zalecamy przetwarzanie maksymalnie 15 filtrów jednocześnie. Po rozmrożeniu filtra należy rozpocząć pierwszą z dwóch inkubacji: jedną w celu lizy komórek i usunięcia RNA oraz drugą w celu rozkładu białek.Podczas pierwszej inkubacji dodaj do filtra 100 µL lizozymu oraz 20 µL RNase A. Zamknij filtr i pozostaw go w rotatorze w temperaturze 37 °C przez jedną godzinę. Podczas kolejnej inkubacji dodaj do filtra 100 µL Proteinase K oraz 100 µL 20% SDS.Ponownie uszczelnij filtr za pomocą Parafilmu i pozostaw go do dalszej rotacji przez jedną lub dwie godziny. Tym razem w temperaturze 55°C. Użyj strzykawki o objętości 5 mL, aby przenieść lizat z filtra Stax do probówki typu Falcon o pojemności 15 mL.Przepłucz filtr jednym mililitrem buforu lizującego i dodaj płyn z płukania do lizatu w probówce typu Falcon. Po przeprowadzeniu lizy i trawienia komórek można przystąpić do ekstrakcji DNA. Kolejnym krokiem jest wykorzystanie metody fenol-chloroformowej w celu wyekstrahowania DNA z lizatu.Do probówki z lizatem dodać taką samą objętość (około 3 ml) fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego, a następnie wymieszać w wstrząsarze typu vortex przez 10 s. Wirować probówkę z prędkością 2 500 ×g przez pięć minut. W wyniku wirowania mieszanina lizatu z fenolem i chloroformem powinna rozdzielić się na dwie warstwy.Warstwa organiczna na dnie zawiera chloroform z fenolem oraz białka z próbki. Warstwa wodna, zazwyczaj znajdująca się na górze, składa się z DNA, wody i innych bardziej hydrofilowych cząsteczek. Przenieś warstwę wodną zawierającą DNA do nowej probówki typu Falcon o pojemności 15 ml. Do probówki dodaj równą objętość mieszaniny chloroformu z alkoholem izoamylowym i mieszaj w wstrząsarku wortex przez 10 sekund.Ten krok pozwala usunąć pozostałości fenolu z próbki DNA. Odwiruj próbkę z prędkością 2 500 ×g przez pięć minut lub do momentu, aż warstwa wodna stanie się klarowna. Przenieś warstwę wodną do nowej, opisanej probówki typu Falcon i dodaj 1 mL buforu TE o pH 8.W tym momencie dysponują Państwo ekstraktem DNA. Następnym krokiem jest przemycie i zagęszczenie próbki DNA w 15 mililitrowej probówce do ultrawirówki firmy Amazon. Przenieście próbkę DNA do komory filtra.Probówki Ultra-Centrifuge składają się z filtra zatrzymującego cząsteczki o określonej masie cząsteczkowej lub większej, uszczelki oraz probówki służącej do zbierania przesączu. W tym przypadku filtr zatrzymuje DNA podczas wirowania z prędkością 3 500 ×g przez 10 minut. Należy sprawdzić, czy w filtrze pozostało mniej niż 1 ml cieczy.Jeśli pozostało więcej retentatu, ponownie napełnij filtr buforem TE i odwiruj. Przenieś frakcję przepływową lub filtrat do innej probówki typu Falcon i przechowuj w lodówce do czasu potwierdzenia produktu końcowego na żelu, a następnie dodaj dwa mililitry buforu TE do filtra Amicon i wiruj przy 3 500 ×g przez sześć minut. Usuń filtrat w taki sam sposób jak wcześniej.Przemyj DNA jeszcze dwa razy buforem TE, aby łącznie wykonać trzy przemycia, zbierając filtrat po każdym etapie; podczas ostatniego wirowania przemywania zbieraj filtrat do momentu, aż w filtrze Amon pozostanie od 200 do 500 µL buforu TE. Odnotuj końcową objętość i przenieś roztwór do opisanej probówki typu Eppendorf o pojemności 1,5 mL. Odmierz alikwot 70 µL przemytego, skoncentrowanego DNA do wykorzystania jako zapas roboczy.Przechowywać roztwór roboczy w temperaturze -20 °C. Pozostałą część DNA zamrozić w temperaturze -80 °C. Sprawdzić stężenie i jakość DNA produktu końcowego, przeprowadzając elektroforezę próbek w żelu obok markera DNA.Przygotuj żel 0,8% AROS z dodatkiem bromku etydium i prowadź elektroforezę przez noc, używając markerów służących jako standardy wielkości i intensywności. W pierwszych kilku ścieżkach nanieś markery z prążkami o różnych masach cząsteczkowych i stężeniach; zalecamy następujący schemat nakładania: w dwóch pierwszych ścieżkach nanieś 10 µL markera 1 kb plus, a w kolejnych trzech ścieżkach nanieś odpowiednio 2 µL, 5 µL i 10 µL markera Lambda H3 o stężeniu 50 ng/µL.Na koniec nanieś pięć µL próbki ekstraktu DNA na każdą studzienkę. Prowadź elektroforezę w żelu przy napięciu 15 V przez około 16 godzin. Wykonaj zdjęcie żelu za pomocą systemu dokumentacji żeli UV, aby określić zakres masy cząsteczkowej oraz stężenie DNA.Porównaj prążki próbek z prążkami drabinki. DNA wysokiej jakości będzie charakteryzować się wysoką masą cząsteczkową i nie będzie wykazywać oznak fragmentacji ani degradacji. Jeśli jakość DNA jest dobra, a jego ilość wystarczająca, przystąp do oczyszczania DNA poprzez przeprowadzenie gradientu chlorku cezu.W pierwszej kolejności oznakuj probówki i do każdej probówki do wirowania dodaj 160 mg chlorku cezu oraz 178 µL genomowego DNA. Przykryj probówkę małym kawałkiem folii Parafilm i delikatnie odwróć ją 10–20 razy, aby wymieszać składniki. Nie mieszaj za pomocą pipety, ponieważ może to doprowadzić do fragmentacji DNA.Następnie dodaj do probówki 10 µL bromku AUM i ponownie wymieszaj. Przed wirowaniem upewnij się, że probówki są dobrze zrównoważone, a różnice wagowe między nimi nie przekraczają 1 mg. Umieść probówki w rotorze ultrawirowarki za pomocą pęsety.Następnie zamknij pokrywę wirnika i umieść wirnik wewnątrz ultrawirówki, a następnie ją zamknij. Próżnia w komorze ultrawirówki zostanie wytworzona natychmiast po zamknięciu drzwiczek. Wirowanie należy przeprowadzić przez noc, przez łącznie 18 godzin, przy 100 000 RPM w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Po zakończeniu wirowania wyjmij probówki z rotora za pomocą pęsety i umieść je w statywie. Przenieś probówki do transluminatora z niebieskim światłem i załóż bursztynowe okulary filtrujące. Następnie włącz światło niebieskie i zlokalizuj prążek DNA, używając sterylnej strzykawki 1 cc z igłą.Usuń prążek DNA, a następnie umieść go w probówce typu Eppendorf o pojemności 1,5 ml, aby ułatwić odzyskanie większości DNA uwięzionego w przestrzeni martwej strzykawki. Przepłucz strzykawkę 100 µl buforu TE i dodaj roztwór z płukania do probówki. Przygotuj jedną probówkę z 100 µl buforu TE na każdą próbkę, aby zapobiec kontaminacji krzyżowej.Aby usunąć bromek AUM z DNA, należy dodać do probówki równą objętość nasyconego wody butanolu. Delikatnie odwrócić probówki 10–20 razy, odwiruçować przy 10 000 RPM przez jedną minutę i usunąć górną warstwę. Powtórzyć przemywanie jeszcze około trzech lub czterech razy, aż butanol stanie się przezroczysty.Do probówki do ultrawirówki ancon wlej cztery mililitry TE i dodaj roztwór DNA z powyższego wirowania przy 3 500 ×g w temperaturze pokojowej, aż objętość DNA zostanie zredukowana do około 100 do 500 µL, a następnie odrzuć przesącz. Do filtra Amazon dodaj dwa mililitry TE i wiruj przy 3 500 ×g przez sześć minut. Powtórz tę czynność dwukrotnie, aby przeprowadzić łącznie trzy przemycia za pomocą TE; w razie potrzeby zastosuj dodatkowe wirowanie, aby zagęścić roztwór do objętości końcowej od 50 do 100 µL.Następnie przenieś roztwór DNA z filtra do nowej probówki typu einor o pojemności 1,5 ml. Dodaj 40 µl TE na filtr i pipetuj w górę i w dół wzdłuż obu membran filtra, aby wypłukać pozostałe DNA. Dodaj ten roztwór do probówki z zagęszczonym DNA.Umieść jednostkę filtrującą MicroCon YM 30 w probówce MicroCon i przeprowadź wstępne płukanie, dodając 200 µL wody autoklawowanej i wirując przy 10 000 RPM przez siedem minut. Przenieś roztwór DNA do wstępnie wypłukanego MicroCon, a następnie w celu dalszego zagęszczenia DNA wiruj z prędkością od 5 000 do 10 000 ×g przez jedną do trzech minut. Sprawdź objętość cieczy na filtrze i powtarzaj wirowanie do momentu, aż objętość cieczy na filtrze zostanie zredukowana do około 50 µL.Umieść jednostkę filtrującą dnem do góry w nowej probówce MicroCon i wiruj przy 1000 ×g przez trzy minuty. Optymalna objętość stężonego roztworu wynosi od 50 do 60 µL. Przenieś próbkę DNA do nowej probówki typu einor o pojemności 1,5 ml.Zmierz stężenie DNA za pomocą NanoDrop i sprawdź jakość piku. Wykres absorbancji dla czystego DNA powinien wykazywać wyraźny pik przy 260 nm. Pozostałą część DNA zamroź w temperaturze -80 °C.W przypadku prawidłowego wykonania protokołu obraz żelu powinien być zbliżony do rysunku jeden; rzeczywiste stężenie DNA w ekstraktach będzie różnić się w zależności od źródła próbki. Przy prawidłowym wykonaniu protokołu powinna być wyraźnie widoczna prążka DNA w środkowej części probówki. Jak pokazano na rysunku dwa, zaprezentowaliśmy sposób ekstrakcji genomowego DNA z filtrów sterex oraz jego oczyszczania przy użyciu gradientu gęstości chlorku cezu.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przed rozpoczęciem sprawdzić, czy dysponują Państwo wszystkimi niezbędnymi odczynnikami i materiałami eksploatacyjnymi. Po drugie, należy zaplanować co najmniej trzy pełne dni, aby zapewnić wystarczająco dużo czasu na uważne przeprowadzenie procedury. To wszystko.Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.

dna-extraction-from-022-m-sterivex-filters-cesium-chloride-density

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ekstrakcja DNA z filtrów Sterivex o średnicy 0,22 µM i wirowania z gradientu gęstości chlorku cezu

Opisano metodologię izolacji wysokiej jakości genomowego DNA o wysokiej masie cząsteczkowej z mikrobiologicznej społeczności glebowej.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego genomowego DNA z gleb i osadów

Metoda znakowania stabilnymi izotopami DNA (DNA stable-isotope probing) jest metodą niezależną od hodowli, służącą do identyfikacji i charakterystyki aktywnych społeczności mikroorganizmów zdolnych do wykorzystania określonych substratów. Asymilacja substratu wzbogaconego w ciężki izotop prowadzi do wbudowania znakowanych atomów w biomasę mikrobiologiczną. Ultracentryfugacja w gradiencie gęstości pozwala na odzyskanie znakowanego DNA do dalszych analiz molekularnych.

Analiza stabilnych izotopów w DNA (DNA-SIP)

Przedstawiamy ulepszony protokół izolacji wysokocząsteczkowego DNA z hipersalinitycznych mat mikrobjalnych. Przed ekstrakcją i puryfikacją DNA komórki mikrobjalne są oddzielane od macierzy maty. Pozwala to na zwiększenie stężenia, poprawę jakości oraz zwiększenie rozmiaru DNA. Protokół ten może być stosowany również w przypadku innych próbek trudnych do obróbki.

Ekstrakcja wysokocząsteczkowego DNA z mat mikrobowych

Ten film opisuje technikę ekstrakcji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych ze świeżych lub zamrożonych tkanek. Wyizolowane pęcherzyki zewnątrzkomórkowe można wykorzystać do dalszej analizy w celu odkrycia ich znaczącej roli w patogenezie choroby.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika izolowania pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z próbek całych tkanek za pomocą wirowania różnicowego

Ten film demonstruje metodę oczyszczania opartą na ultrawirowaniu w gradiencie gęstości w celu wyizolowania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych nadających się do badań charakteryzacyjnych.

Oczyszczanie subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych: technika oczyszczania subpopulacji pęcherzyków zewnątrzkomórkowych za pomocą ultrawirowania w gradimencie gęstości

Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół izolowania małych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (EV) z całych tkanek, w tym próbek mózgu i nowotworów. Metoda ta oferuje powtarzalną technikę ekstrakcji EV z tkanki stałej w celu dalszych analiz.

Ekstrakcja pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z całej tkanki

Bakterie wydzielają nanometrowe pęcherzyki zewnątrzkomórkowe (EV) przenoszące bioaktywne cząsteczki biologiczne. Badania nad EV koncentrują się na zrozumieniu ich biogenezy, roli w interakcjach i chorobach między drobnoustrojami a gospodarzem-mikroorganizmem, a także na ich potencjalnych zastosowaniach terapeutycznych. Przedstawiono proces pracy do skalowalnej izolacji pojazdów elektrycznych od różnych bakterii, aby ułatwić standaryzację badań nad pojazdami elektrycznymi.

Skalowalna izolacja i oczyszczanie pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z Escherichia coli i innych bakterii

Obecny protokół zawiera szczegółowe opisy izolacji, koncentracji i charakterystyki pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z kultur sinic. Omówiono również podejścia do oczyszczania pęcherzyków z kultur w różnych skalach, kompromisy między metodologiami oraz rozważania dotyczące pracy z próbkami terenowymi.

Izolacja i charakterystyka pęcherzyków zewnątrzkomórkowych sinic

To badanie opisuje metodę izolacji i oczyszczania bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych (BEV) wzbogaconych z ludzkiego kału poprzez wirowanie w gradifikacji gęstości (DGC), identyfikuje fizyczne cechy BEV na podstawie morfologii, wielkości cząstek i stężenia, oraz omawia potencjalne zastosowania podejścia DGC w badaniach klinicznych i naukowych.

Izolacja i oczyszczanie bakteryjnych pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z ludzkiego kału za pomocą wirowania w gradiacji gęstości

Tutaj prezentujemy prostą technikę oceny środowiskowej oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe (AMR) poprzez zwiększenie proporcji niskocząsteczkowego DNA zewnątrzkomórkowego. Wcześniejsze leczenie 20%-30% PEG i 1,2 M NaCl pozwala na wykrycie zarówno genomowych, jak i przenoszonych horyzontalnie genów AMR. Protokół nadaje się do procesu bez zestawów z dodatkową optymalizacją.

Ulepszona ekstrakcja DNA o niskiej masie cząsteczkowej ze ścieków w celu kompleksowej oceny oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe

Poznaj ekstrakcję DNA z filtrów Sterivex i wirowanie w gradiencie chlorku cezu. Ta metoda pozwala uzyskać wysokiej jakości DNA genomowe z biomasy planktonowej do badań mikrobiomu morskiego.

Ekstrakcja DNA z filtrów Sterivex 0,22 $\mu$M oraz wirowanie w gradiencie gęstości chlorku cezu

Przeglądaj więcej filmów